一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因工程技术领域，尤其设及一种海洋放线菌基因遗传操作系统 的构建方法。
【背景技术】
[0002] 链霉菌（Str巧tomyces)在分类学上属于原核生物界、放线菌目、链霉菌科，是一类 具有分枝丝状体的好氧革兰氏阳性细菌，是±壤中主要的微生物类群之一。链霉菌基因组 平均大小为8000化，约为大肠杆菌基因组的两倍。同其它生物相比，其基因组最大特征之一 就是其DNA具有极高的G+Cmol%，可高达69~78%，是迄今为止已知的G+Cmol%含量最高的 生物类群之一。链霉菌是工业微生物中最具有商用价值的类群之一。人们已经了解到自然 界中有近70%的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的。自1928年AlexanderFleming 发现第一个抗生素一一青霉素W来，数W万计的抗生素正源源不断地被人们发现和创造出 来并造福于人类。
[0003] 作为活性天然产物重要来源的陆生微生物随着研究的不断扩展与深入，其生物多 样性及相应的结构、活性多样性已逐渐被人们所认识，但作为生物起源和覆盖地球表面约 70%的海洋中所蕴藏的微生物却知之甚少。由于海洋微生物所处的海洋是一个十分独特的 环境，具有高盐、高碱、低溫的特点，导致了微生物类群的多样性和微生物基因资源的多样 性。目前已培养的微生物只占所有微生物的0. 1 %到1 %，因此丰富的海洋生物资源无疑是 天然药物筛选的重要来源。据报道，美国国立肿瘤研究所每年筛选新的抗癌化合物中有5% 来自海洋生物，从海洋生物提取的化合物有10%具有抗癌活性。因此，基于海洋微生物的活 性天然产物生物合成途径的探索和发现是新药开发的重要补充和延伸。
[0004] 海洋微生物中的一个重要群体就是专属性海洋放线菌。1991年化nical等发现 了第一个依赖海水生长的特殊放线菌家族并将其命名为"MR1"。2005年，结合全面的形 态学特征分析和基因组测序分析后，"MAR1"被鉴定为第一个专属性海洋放线菌，并正式 更名为"Salinispora"。随后，Demequina、Marinispora、Solwaraspora、Lamerjespora、 Serinicoccus、Salinibacterium、Aeromicrobium、Willamsia、MarinactinosporaW 及Sciscionella等放线菌属相继被分离鉴定为专属性海洋放线菌。其中，海洋放线菌 SalinisporaarenlocolaCNS-205就是专属性海洋放线菌Salinispora的代表性菌株。海 洋放线菌SalinisporaarenlocolaCNS-205分布广泛，由于其生活环境的特殊性，该菌产 生多种活性多样、结构新颖次生代谢产物，成为了新药开发研究的新资源。然而其生物合成 机制却一直未被掲示。现有技术中尚未有关于海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法。 阳0化]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种海洋放线菌基因遗传操作 系统的构建方法，旨在解决现有技术中尚未有关于海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方 法的问题。 阳007] 本发明的技术方案如下： 一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，包括步骤： A、 将已灭菌的SFMS培养基融化，溫度降至40~50°C，在SFMS培养基中加入适量的抗生 素，倒平板，将SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子悬液涂布平板，25~30°C培养4~5d; B、 将整合型质粒通过化CI2法导入供体菌中，借助于供体菌上tra基因，所述整合型质 粒W接合转移方式从供体菌导入到步骤A得到的SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子 中进行整合。
[0008] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤A中，所述抗生 素为阿泊拉霉素。
[0009] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，所述整合 型质粒为PSET152和PIB139。
[0010] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，所述供体 菌为PUZ8002。
[0011] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，供体菌与 受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205 抱子的比例为（15~1) :1。
[0012] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，供体菌与 受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205 抱子的比例为 8:1。
[0013] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B之后包括：W 整合型质粒PSET152和PIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV为模板，设计引物CP1 和CP2W验证接合转移子，提取SalinisporaarenlocolaCNS-205基因组DNA并进行PCR 验证。
[0014] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述CP1为 5, -TTTATCACCACCGACTATTTGC-3' ；所述CP2 为 5' -TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3,。
[0015] 所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述PCR验证的条件反 应程序为98°(：1111111;981：3〇3,581：3〇3,721：3〇3,30个循环；72°(：延伸1〇111111。
[0016] 有益效果：本发明通过接合转移方式将整合型质粒从供体菌导入到受体菌 SalinisporaarenlocolaCNS-205 抱子中进行整合，实现了向Salinisporaarenlocola CNS-205导入外源DM片段的可能性。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例1中PIB139和PSET152接合转移子的PCR验证的示意图。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，为使本发明的目的、 技术方案及效果更加清楚、明确，W下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的 具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019] 本发明提供一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其包括步骤： A、将已灭菌的SFMS培养基融化，溫度降至40~50°C，在SFMS培养基中加入适量的抗生 素，倒平板，将SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子悬液涂布平板，25~3(TC培养4~5d; B、将整合型质粒通过CaCls法导入供体菌中，借助于供体菌上tra基因，所述整合型质 粒1^接合转移方式从供体菌导入到SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子中，并进行整 厶 η〇
[0020] 通过上述技术方案，本发明成功地将位点特异性整合型质粒整合到Salinispora arenlocolaCNS-205抱子中，为后续SalinisporaarenlocolaCNS-205染色体上各基因的 功能研究和生物合成基因的改造奠定了基础。
[0021] 所述步骤A中，所述抗生素为阿泊拉霉素。
[0022] 所述步骤B中，所述整合型质粒为pSET152和pIB139。质粒是一种闭合环状双链 DNA，它不属于基因组DNA，游离于染色体DNA之外。在链霉菌遗传操作中人们常将其作为 载体来介导外源DNA向宿主细胞导入。载体可依据其是否能整合到链霉菌染色体DNA上的 特点分为整合型载体和非整合型载体，例如，整合型载体为整合型质粒PIB139和PSET152。 而非整合型载体又可依据其是否含有链霉菌复制子分为自杀型载体和游离型载体，例如游 离型载体PYH7。
[0023] 将外源DNA导入宿主细胞的方式主要有：巧转移、接合转移、电转化和显微注射 等。本发明所述步骤B中，选用接合转移的方式将外源整合型质粒导入到Salinispora arenlocolaCNS-205抱子中，运是由于接合转移因具有导入效率较高、高度跨种属差异、价 格低廉、操作方便等优势。
[0024] 所述步骤B中，所述供体菌为PUZ8002。
[00巧]所述步骤B中，接合转移的供体菌(大肠杆菌)与受体菌Salinisporaarenlocola CNS-205抱子的比例为（15~1) :1。优选地，所述步骤B中，接合转移的供体菌(大肠杆菌） 与受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子的比例为8:1。运是由于在接合转移过 程中，含有外源载体的供体菌和受体菌（SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子)在同一个 平板上生长时，两者之间存在不可避免的相互竞争。由于受体菌Salinisporaarenlocola CNS-205抱子的生长速度比供体菌的生长速度缓慢，过量的供体菌会使链Salinispora arenlocolaCNS-205抱子的生长受到抑制，导致接合转移率降低。接合转移的所述供体菌 与所述SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子的比例为8:1时，接合转移率达到最高。 [00%] 下面通过具体的实施例对本发明进行详细描述。 实施例
[0027]实验材料 基因克隆受体E.coliDH10B、接合转移供体菌E.coliET12567(pUZ8002)、整合型质粒PSET152和PIB139 (均携带阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV，接合转移位点or口）。 W測试剂 硫链丝菌素和阿泊拉霉素购自美国Sigma公司；氯霉素、氨节青霉素、卡那霉素、硫链 丝菌素、Lambda/Hint限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自大连宝生物 工程有限公司；其他常用试剂均购于上海国药集团. 培养基和抗生素 SalinisporaarenlocolaCNS-205的平板培养基为SFMS，培养细菌的为LB培养基、抱 子预萌发培养基为2ΧΥΤ、接合转移使用的是SFMS培养基。 阳029]LB中抗生素浓度为：阿泊拉霉素25μg/mL，氯霉素25μg/mL，卡那霉素25μg/血， 氨节青霉素100μg/mL;接合转移培养基中抗生素浓度为阿泊拉霉素25μg/mU糞晚酬酸 25μg/mLo
[0030] (1)、抗生素敏感性实验 将已灭菌的SFMS培养基融化，溫度降至45°C，加入适当质量浓度的抗生素(卡那霉素 0~100μg/mL;氯霉素0~100μg/mL;阿泊拉霉素0~100μg/mL;硫链丝菌素0~100μ