专利名称：抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有强杀藻活性作用的苯胺类化合物，尤其是涉及一种抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法。
背景技术：
海洋放线菌是一类特殊的、具有重要经济价值的微生物，近年来50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的，使得利用放线菌控制 水华和赤潮成为值得深入研究的领域。随着分子生态学方法的广泛使用，海洋放线菌多样性研究，尤其是深海放线菌的多样性研究取得的巨大进展，越来越多的海洋放线菌被发现，包括新的16SrDNA序列簇，放线菌的种类和数量不断增加，由最初的3个属增加到了 170个属，然而，其已知物种与其估计在自然界存在的数量相比仍然是微不足道的。目前发现的不同菌属溶藻放线菌多数通过分泌胞外活性物质间接杀藻，对于杀藻活性物质的研究多数还仅限于对活性物质的定性表述，如为弱极性脂溶性、非蛋白质类(梁锏文，林炜铁.溶藻放线菌的分离鉴定及其溶藻特性.环境科学与技术，2009. 32
(9):68-72.)等。仅 Yamamoto 鉴定出 S. phaeofaciens 是通过分泌 L-赖氨酸(YokoYamamoto, T. K. , Yoshikuni Hodoki, Kunimoto Hotta, Hideaki Uchida, Ken-Ichi Harada.Distribution and identification of actinomycetes lysing cyanobacteria inaeutrophic lake. Journal ofApplied Phycology, 1998)破坏藻的细胞壁，抑制蓝藻的生长。崔妍等(崔妍，李建宏，汪燕等.高效抑藻放线菌的筛选和活性.生态学报，2008. 28
(11):5691-5697)从江苏海洋滩涂土壤中分离到I株对微囊藻有强烈抑杀作用的菌株YC0412,属于灰霉素链霉菌(Streptomyces griseinus),该菌株还对小球藻、栅藻、鱼腥藻和集胞藻都有不同的抑杀作用，YC0412的发酵液经乙酸乙酯和氯仿抽提后发现乙酸乙酯提取物具有很好的杀藻作用，说明其活性产物应该是一种弱极性脂溶性物质。关英红等(关英红等.一株溶藻菌株的分离鉴定及溶藻特性.环境科学学报，2008. 28 (7) :1288-1293)也从某湖泊中分离出一株对铜绿微囊藻具有很好去除效果的菌株W4，加入特定量的菌株培养液8 d后，铜绿微囊藻的去除率可达99.5%，该菌株分泌的抑藻活性物质为非蛋白质类物质。这些研究结果表明，海洋环境是发现和筛选新的放线菌物种和代谢产物的宝贵资源库，其中蕴藏着大量放线菌资源等待开发和利用。近年来，我国赤潮发生频率快速增加，赤潮发生规模急剧扩大，发生海域向全部近岸海域扩展，时间跨度逐渐加大，有毒、有害的赤潮生物持续增多。为应对国家高度关注的环境演变与海洋生态安全问题，鉴于我国频发的有害赤潮对经济发展造成的困扰，研究新型高效的赤潮调控方法，是当前该领域中亟待解决的重大问题之一。由于物理和化学方法治理赤潮存在难以大面积施用及易造成二次污染等不足之处，利用生物相互之间的生态作用来治理赤潮已成为当前研究热点。迄今为止，大多数筛选到的抑藻微生物是通过分泌特异的具有抑藻活性的物质来起抑藻作用的。已经报道的抑藻活性物质包括蛋白质(含胞外酶)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的抑藻化合物(Yoshikawa，K.，et al. Beta-cyanoalanineproduction by marine bacteria on cyanide-free medium and its specificinhibitory activity toward cyanobacteria. Applied and EnvironmentalMicrobiology,2000. 66(2) :718 ；Katoj J. ,et al.Development of a genetictransformation system for an alga-lysing bacterium. Applied and EnvironmentalMicrobiology,1998. 64(6) :2061-2064 ；KawanojY.，et al.Production of thiotropocinby a marine bacterium, Caulobacter sp. and its antimicroalgal activities. JournalofMarine Biotechnology,1997. 5(4):225-229 ；Hibayashi, R. and N. Imamura. Actionmechanism of a selective anti-cyanobacterial compound, argimicin A.Journalof Antibiotics, 2003. 56 (2):154-159 ；HaeyoungJeong,et al. Genomic blueprintof Hahella chejuensis，amarine microbe producing analgicid alagent. NucleicAcids Research, 2005 ；21. Berger, P.，J. Rhoj and H. Gunner. Bacterial Suppression ofChlorella by Hydroxylamine Production. Water Research 1979. 13:267-273.)。通过筛选高效、专一的抑藻活性物质成为开发抑藻剂用于赤潮治理的一个新思路
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效、专一地杀灭藻细胞的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法。本发明所述抑藻活性物质为化合物，分子式为CltlH15NO,名称为二异丁氧基苯基胺，分子量为165。所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，包括以下步骤I)将短杆菌(Brevibacterium sp. ) BSOl纯化后接种于新鲜海水配制的固体培养基平板上培养；挑取所述固体培养基平板上的单菌落接种于新鲜海水配制的液体培养基中培养，得到发酵液；所述短杆菌(Brevibacterium sp. ) BSOl保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No. 6481，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年8月28日；2)将步骤I)所得的发酵液离心后加入萃取剂萃取，将乙酸乙酯萃取相合并得到萃取物A，将萃取物A旋转蒸干，再加入甲醇溶解离心，去盐，去蛋白，得到粗提物A ；3)将步骤2)所得的粗提物A溶于萃取剂中，然后上样于硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱，在洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液进行层析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液；4)将在步骤3)所得的合并洗脱液置于旋转蒸发仪下真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性组分的粗提物B ；5)将步骤4)所得的粗提物B采用葡聚糖凝胶柱进一步分离，得到洗脱液；6)将步骤5)得到的洗脱液进行层析分析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液置于旋转蒸发仪真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性组分的活性物C ；7)将步骤6)所得的活性物C,经薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)分析检测，并经1H-NMR质谱检测，得到纯化合物，该纯化合物即为本发明所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺。在步骤I)中，所述固体培养基平板上培养可置于恒温培养箱中培养；所述恒温培养箱的温度可为25 32°C;所述液体培养基中培养可通过摇床培养3 5d,所述摇床的温度可为28 37°C，所述摇床的转速可为180 250rpm ;所述固体培养基可采用2216E培养基；所述液体培养基可采用2216E液体培养基。在步骤2)中，所述离心可采用离心机离心，离心力可为10，000 12，00(^，离心时间可为10 20min ;所述萃取剂的加入量按体积比可与发酵液等体积；所述萃取剂最好采用乙酸乙酯等，所述萃取的次数可为5次；所述旋转蒸干可采用旋转蒸发仪旋转蒸干。在步骤3)中，所述萃取剂可采用乙酸乙酯等；所述硅胶柱的规格可为170X30mm，200 300目；所述流动相梯度浓度洗脱最好依次经过以下(a) (h) 8个洗脱过程(a)采用石油醚洗脱2 2. 5个柱体积；(b)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚 乙酸乙酯=4 O. 5，总体积I. 5个柱体积；(c)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4 I. 5，总体积I. 5个柱体积；(d)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4 2. 5，总体积I. 5个柱体积；(e)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4 3. 5，总体积I. 5个柱体积；(f)采用乙酸乙酯洗脱I. 5个柱体积；(g)乙酸乙酯甲醇洗脱，按体积比，乙酸乙酯甲醇=25 1，总体积2个柱体积；(h)采用甲醇洗脱2个柱体积；所述间隔收集洗脱液的间隔时间可为10 15min ;所述层析可采用薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)分析方法进行层析。在步骤4)中，所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度可为28 32°C。在步骤5)中，所述分离的流程可为采用浓度为99%的甲醇为洗脱流动相，每间隔6min收集一次洗脱液，所述葡聚糖凝胶柱可采用型号为S印hadex LH-20的葡聚糖凝胶柱。在步骤6)中，所述层析分析可采用薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)分析；所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度可为28 32°C。与现有技术比较，本发明所述抑藻活性化合物是将用常规方法筛选获得的短杆菌(Brevibacterium sp. ) BSOl纯化后通过发酵培养,获得含有强抑藻活性化合物的发酵液，将发酵液离心，收集上清液，然后将上清液进行分离纯化，可获得本发明所述抑藻活性化合物。该制备方法简单，所得抑藻活性化合物物质经测试能够高效、专一地杀灭藻细胞，具有开发成抑藻剂的潜能，在生物降解藻类、治理赤潮方面具有广泛的应用。
图I为本发明所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的质谱图谱。在图I中，横坐标代表质荷比(m/z)，纵坐标代表各个峰的相对丰度。图2为本发明所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的核磁共振图谱。在图2中，横坐标表示共振磁场强度，纵坐标表示图谱中各个峰的相对丰度。图2的上图与下图为同一幅图，为了清晰起见，图2分为上图与下图两部分。图2的上图为化学位移在I. (Γ4. 5ppm区间的1H-NMR (600M)核磁共振图谱；图2的下图为化学位移在7. 45^7. 75ppm区间的1H-NMR (600M)核磁共振图谱。图3为本发明所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺抑藻效果图。在图3中，横坐标代表不同的处理时间Treatment time (h);纵坐标代表藻细胞个数Number of cells(cells/mL) ；CK :未经处理的对照组；DMSO :二甲基亚砜，为本发明所述抑藻活性物质的溶剂；用本发明所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺处理藻细胞时所使用的终浓度分别为5 μ g/mL、10 μ g/mL、15 μ g/mL、20 μ g/mL。图4为短杆菌株Brevibacterium sp. BSOl电镜图。在图4中，标尺为O. 5 μ m。
具体实施例方式—、准备阶段I、准备菌种、藻种与培养基菌种BS01来源于厦门大学应用与环境微生物研究所从福建省厦门水域中分离 的一株具有较强杀藻活性的放线菌，初步鉴定此菌为短杆菌属(Brevibacterium sp.)。藻种Alexandrium tamarense (AT)无菌株,藻种系由暨南大学水生生物研究所提供，经本实验无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株。藻类所用培养基为f/2培养基。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20±1°C,光照条件为12h光照12h黑暗。培养基筛选培养基(2216E):蛋白胨(Peptone) 5g,酵母提取物(Yeast Extract) Ig,磷酸高铁O. lg，琼脂粉IOg (固体培养基)，pH 7. 6 7. 8，陈海水定容到1L。2、测定方法浊度测定法取适当原液或是稀释的菌体发酵液，以2216E培养基为对照，采用分光光度计在波长600nm下测定光密度(OD6tltl)值。杀藻率取发酵培养后的无细胞滤液，按照1%的比例加入测试藻类中，作用24h后用鲁戈氏液固定染色，在光学显微镜下计数。Algicidal activity(%) = (Nc-Nt)/NeX 100,式中，Ne表示对照组中的活细胞数，Nt表示实验组中的活细胞数。二、抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，包括以下步骤I)将短杆菌(Brevibacterium sp. ) BSOl纯化后接种于新鲜海水配制的固体培养基平板上，然后置于恒温培养箱中培养；挑取所述固体培养基平板上的单菌落接种于新鲜海水配制的液体培养基中培养，通过摇床培养3 5d后得到发酵液；所述固体培养基采用2216E固体培养基；所述恒温培养箱的温度为25 32°C ;所述液体培养基采用2216E液体培养基；所述摇床的温度为28 37°C，转速为180 250rpm。所述2216E固体培养基的组分可为细菌蛋白胨5g，酵母粉lg，磷酸高铁O. Olg，琼脂 10 12g，海水 1000mL，2mol/L NaOH 溶液调 pH 值 7. 6 7. 8，121° C，灭菌 20min;所述2216E液体培养基的组分可为细菌蛋白胨5g，酵母粉lg，磷酸高铁O. Olg,海水 1000mL，2mol/LNa0H 溶液调 pH 值 7. 6 7. 8，121° C，灭菌 20min。2)将步骤I)所得的发酵液通过离心机离心后加入等体积萃取剂进行萃取5次，将乙酸乙酯萃取相合并得到萃取物A，将萃取物A采用旋转蒸发仪旋转蒸干，再加入甲醇溶解离心，去盐去蛋白，得到粗提物A ;所述离心机的离心力为10，000 12，000g，离心时间为10 20min ;所述萃取剂采用乙酸乙酯,所述萃取的次数为5次。3)将步骤2)所得的粗提物A溶于萃取剂中，然后上样于硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱；所述萃取剂为乙酸乙酯、所述硅胶柱的规格为170 X 30mm，200 300目；所述流动相梯度浓度洗脱依次经过以下(a) (h)8个洗脱过程(a)采用石油醚洗脱2 2. 5个柱体积；(b)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4:0.5，总体积1.5个柱体积；(c)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4:1. 5，总体积
I.5个柱体积；(d)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4:2. 5，总体积I. 5个柱体积；(e)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4:3. 5，总体积I. 5个柱体积；(f)采用乙酸乙酯洗脱I. 5个柱体积；(g)乙酸乙酯甲醇洗脱，按体积t匕，乙酸乙酯甲醇=25:1，总体积2个柱体积；(h)采用甲醇洗脱2个柱体积。4)在步骤3)洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液采用薄层层析(thin-layerchromatography, TLC)分析方法进行层析,采用紫外显色,碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液；所述间隔收集洗脱液的时间为间隔10 15min。5)将在步骤4)所得的合并洗脱液置于旋转蒸发仪下真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性组分的粗提物B ;所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度为28 32°C。6)将步骤5)所得的粗提物B采用葡聚糖凝胶柱进一步分离，得到洗脱液；所述分离流程为采用浓度为99%的甲醇为洗脱流动相，每间隔6min收集一次洗脱液，所述葡聚糖凝胶柱型号为S印hadex LH-20。7)将步骤6)得到的洗脱液利用薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)分析，采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液置于旋转蒸发仪真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性组分的活性物C ;所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度为28 32°C。8)将步骤7)所得的活性物C,经薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)分析检测，并经1H-NMR质谱检测，得到纯化合物，该纯化合物即为本发明所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺。下面给出附图的具体说明参见图1，分子离子峰、[Μ+Na]+和[M+K]+正离子加合峰分别为164. 97和187. 88，203.78。分子量为165。参见图2，利用核磁共振技术IH-NMR(600M)、13C-NMR、DEPT和H-1H COSY谱图。推测化合物结构式见图4，化学分子式为CltlH15NO,分子量为165. 2322，m/z为165. 1154(100. 0%)，166. 1187 (10.8%)。与Sci Finder数据库比较得知，化合物为二异丁氧基苯基胺，英文名称为(2-isobutoxyphenyl) amine,其 CAS 为 104065-95-4。经过MALDI-T0F-MS确定相对分子质量之后，再经核磁共振图谱解谱而来，所得物质为二异丁氧基苯基胺，相对分子量约为165，其结构式如下
权利要求
1.抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于所述二异丁氧基苯基胺的分子式为C10H15NO ； 所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，包括以下步骤 1)将短杆菌(Brevibacteriumsp. ) BSOl纯化后接种于新鲜海水配制的固体培养基平板上培养；挑取所述固体培养基平板上的单菌落接种于新鲜海水配制的液体培养基中培养，得到发酵液；所述短杆菌(Brevibacterium sp. ) BSOl保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No. 6481 ； 2)将步骤I)所得的发酵液离心后加入萃取剂萃取，将乙酸乙酯萃取相合并得到萃取物A，将萃取物A旋转蒸干，再加入甲醇溶解离心，去盐，去蛋白，得到粗提物A ； 3)将步骤2)所得的粗提物A溶于萃取剂中，然后上样于硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱，在洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液进行层析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液； 4)将在步骤3)所得的合并洗脱液置于旋转蒸发仪下真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性组分的粗提物B ； 5)将步骤4)所得的粗提物B采用葡聚糖凝胶柱进一步分离，得到洗脱液； 6)将步骤5)得到的洗脱液进行层析分析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液置于旋转蒸发仪真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性组分的活性物C ； 7)将步骤6)所得的活性物C,经薄层层析(thin-layerchromatography, TLC)分析检测，并经1H-NMR质谱检测，得到纯化合物，该纯化合物即为本发明所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺。
2.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述固体培养基平板上培养是置于恒温培养箱中培养；所述恒温培养箱的温度为25 32°C ;所述液体培养基中培养可通过摇床培养3 5d，所述摇床的温度可为28 37 °C，所述摇床的转速可为180 250rpm。
3.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述固体培养基采用2216E固体培养基；所述液体培养基采用2216E液体培养基。
4.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述离心采用离心机离心，离心力为10，000 12，000g，离心时间为10 20min;所述萃取剂的加入量按体积比可与发酵液等体积。
5.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述萃取剂采用乙酸乙酯，所述萃取的次数可为5次；所述旋转蒸干可采用旋转蒸发仪旋转蒸干。
6.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述萃取剂采用乙酸乙酯；所述硅胶柱的规格为170 X 30mm，200 300目。
7.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述流动相梯度浓度洗脱最好依次经过以下(a) (h) 8个洗脱过程(a)采用石油醚洗脱2 2. 5个柱体积；(b)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4 O. 5，总体积I. 5个柱体积；(c)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4 I. 5，总体积I. 5个柱体积；(d)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚乙酸乙酯=4 2. 5，总体积I. 5个柱体积；(e)采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积t匕，石油醚乙酸乙酯=4 3. 5，总体积I. 5个柱体积；(f)采用乙酸乙酯洗脱I. 5个柱体积；(g)乙酸乙酯甲醇洗脱，按体积比，乙酸乙酯甲醇=25 1，总体积2个柱体积；(h)采用甲醇洗脱2个柱体积；所述间隔收集洗脱液的间隔时间可为10 15min ;所述层析可采用薄层层析分析方法进行层析。
8.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度为28 32°C。
9.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述分离的流程为采用浓度为99%的甲醇为洗脱流动相，每间隔6min收集一次洗脱液，所述葡聚糖凝胶柱可采用型号为Sephadex LH-20的葡聚糖凝胶柱。
10.如权利要求I所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述层析分析是采用薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)分析；所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度可为28 32°C。
全文摘要
抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，涉及一种具有强杀藻活性作用的苯胺类化合物。用短杆菌BS01制备发酵液，离心后加入萃取剂，将萃取物蒸干，再加入甲醇溶解离心去盐去蛋白得粗提物；再溶于萃取剂中，上样于硅胶柱，洗脱，收集洗脱液，层析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分得合并洗脱液；蒸干后再溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取具有抑藻活性组分的粗提物；采用葡聚糖凝胶柱分离得洗脱液；层析分析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，合并相似组分得合并洗脱液，蒸干后溶解于DMSO验证抑藻活性，选取具有抑藻活性组分的活性物；经层析，1H-NMR质谱检测得产物。
文档编号C12P13/00GK102911972SQ201210455749
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者郑天凌, 安新丽, 张化俊, 傅丽君, 李 东 申请人:厦门大学