一类核苷类抗生素及其在制备抗菌药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于天然产物和海洋微生物代谢工程领域，具体涉及一类核苷类抗生素及 其在制备抗菌药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 在过去的十年间，海洋放线菌已成为新颖生物活性天然产物发现的新源泉。例 如，Salinispora属放线菌，可产生多种结构新颖和生物活性广泛的化合物，如海洋放线 菌Salinispora tropica可产生化合物salinosporamide A，作为高效的蛋白酶体抑制剂 该化合物已经进入癌症治疗的临床试验了。本研究单位（中国科学院南海海洋研究所） 从中国南海北部深海海沟的沉积土里分离得到一个放线菌新属菌种Marinactinospora thermotolerans SCSI000652,该菌株生产核苷类抗生素 A201A，对革兰氏阳性菌具有显著 抑制作用。
[0003] 与抗生素生物合成相关的基因往往成簇排列，包括自我抵抗基因、转运基因和调 控基因。抗生素生物合成基因簇成功克隆后，可利用分子生物学基础上的组合生物合成 (combinatorial biosynthesis)和代谢工程（metabolic engineering)技术来定向创造新 结构、新活性化合物，这无疑将大大丰富已有的资源，从而为解决或部分解决临床上病原微 生物的耐药性日益严重的问题。
[0004] 近年来发展起来的PCR-Targeting技术和接合转移技术已在多种链霉菌中成功 应用。PCR-Targeting技术是以RED重组技术为基础的，RED同源重组系统由源于λ噬菌 体的exo、bet、gam基因组成，在这3个基因产物的作用下，该系统能介导36bp以上的同源 片段产生同源重组。接合转移技术是发生在大肠杆菌与链霉菌之间，可以避开胞外核酸酶 的影响，使DNA免遭核酸酶的降解，在某种程度上可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰 从而提高转化效率，而且操作程序简单，因此应用较为广泛。PCR-Targeting技术和接合转 移技术为通过基因工程对链霉素中抗生素生物合成基因簇进行遗传改造提供了一种方便 而有效的途径。
【发明内容】
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[0005] 本发明的第一个目的是提供一类具有抑菌作用的核苷类抗生素。
[0006] 本发明的核苷类抗生素或其药用盐，其结构式如式（I )或式（II )所示：
[0007]
[0008] 式（I )中，化合物 I :R1 = H，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = H，X = H ;化合物 2 :R1 =Me，R2 = OH，R3 = OMe，R4 = H，X = H ;化合物 3 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OH，R4 = H， X = H ;化合物 4 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = OH，X = H ;化合物 5 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = H，X = F ;化合物 6 :R1 = Me，R2 = OMe，R3 = OMe，R4 = H，X = Cl ;
[0009] 式（II )中，化合物 7 :R = OMe ;化合物 8 :R = OH。
[0010] 本发明的第二个目的是提供上述核苷类抗生素或其药用盐在制备抗菌药物中的 应用。
[0011] -种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的上述核苷类抗生素或 其药用盐，和药学上可以接受的载体。
[0012] 优选，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌或苏云金 芽孢杆菌的药物。
[0013] 进一步优选，当为化合物5或6时，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、藤黄微 球菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌的药物。
[0014] M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 1 在制备化合物 1 中的应 用，所述的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 1 是 mtdMl 基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0015] M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ2 在制备化合物 2 中的应 用，所述的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652- Δ 2 是 mtdM2 基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0016] M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ3 在制备化合物 3 中的应 用，所述的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652- Δ 3 是 mtdM3 基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0017] M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ4 在制备化合物 4 中的应 用，所述的M. thermotolerans SCSIO 00652突变株00652-Δ 4是mtdH基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0018] M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 5 在制备化合物 5 和 / 或 6 中 的应用，所述的Mthermotolerans SCSIO 00652突变株00652-Δ 5是mtdV基因失活的 M.thermotolerans SCSIO 00652〇
[0019] M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ7 在制备化合物 7 中的应 用，所述的M. thermotolerans SCSIO 00652突变株00652-Δ 7是mtdW基因失活的 M. thermotolerans SCSI000652〇
[0020] M. thermotolerans SCSIO 00652突变株00652-Δ 8在制备化合物8中的应用，所 述的 Μ. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 8 是 mtdW基因和 mtdM4 基因失活的 M.thermotolerans SCSIO 00652〇
[0021] 本发明提供了一类具有抗菌活性的核苷类抗生素化合物1-8,从而为研制新的抗 菌药物提供了新的先导化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。
[0022] 用于本发明的 M. thermotolerans SCSIO 00652 已经在专利号：ZL201110340905. X，发明名称为一种核苷类抗生素 A201A高产菌株及其构建方法中公开了。
【具体实施方式】：
[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] 实施例 I :M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 1 等突变株的构建
[0025] Μ. thermotolerans SCSIO 00652 能够产生核苷类抗生素 Α201Α，Α201Α 生物合成 基因簇的DNA序列已储存在GenBank中，其注册号为JN651966。
[0026] 突变株是采用了 λ-RED介导的PCR-Targeting技术和接合转移技术。构建 M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 1 的流程如下：
[0027] 1.从基因组文库中筛选包含核苷类抗生素 Α201Α生物合成基因的克隆，其中编号 为142Η的克隆包含核苷类抗生素 Α201Α全部的基因簇序列，被用于突变株的构建。
[0028] 2.将142Η粘粒转化入E.coli BW25113/pIJ790中，由此得到细胞命名为： BW25113/pIJ790/142H〇
[0029] 3.以EcoRI和HindIII双酶切过的pIJ773质粒为模板，用mtdMl基因突变引物 (MldF :5' -gccacggaggtcatggcgtcggcccttccctaccctgtcATTCCGGGGATCCGTCGAC-3' ；MldR : 5' -gtccccggccagccgttccagcagcgcgccgtcggcgagTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3'，小写字母代 表与mtdMl基因同源）进行PCR扩增反应，切胶回收阿普拉霉素（Apramycin，Apr)抗性片 段并转化 BW25113/pIJ790/142H细胞中，用 LB+Kan (终浓度 50 μ g/mL) +Apr (终浓度 50 μ g/ mL)筛选阳性克隆，得到筛选到的重组粘粒。
[0030] 4.筛选到的重组粘粒用验证引物（MltF :5'-AGTACGACACCCGATCACGA-3' ；MltR : 5'-GAGCTGGTGCGGATGATGGT-3'）进行PCR进行验证，如能够扩增出1905bp片段则为正确。随 后，将验证过的重组粘粒转化E. coli ET12567/pUZ8002,得到包含重组粘粒的菌株E. coli ET12567/pUZ8002。
[0031] 5.接合转移：将野生型M. thermotolerans SCSIO 00652的菌丝体在TSB培养 液中，28 °C震荡培养1~2天，累计生物量；将包含重组粘粒的菌株E. coli ET12567/ PUZ8002在含有卡那霉素（Kan，终浓度50 μ g/mL)、氨苄青霉素（Amp，终浓度100 μ g/mL)、 氯霉素（Cml，终浓度25 μ g/mL)和Apr (终浓度50 μ g/mL)的LB培养液中培养至光密度 值OD = 0. 6,离心收集细胞，用不添加抗生素的LB培养基洗涤两次，然后与离心后收集的 野生型M. thermotolerans SCSIO 00652菌丝体进行混合，混合液平铺在加有IOmM MgS04 的M-ISP4固体培养基（在ISP4培养基上加有0. 1%蛋白胨、0.05%酵母提取物和3%海 盐）上；在28°C生长20小时后，每个固体培养基平板上涂布800 μ L加有抗生素药物的 无菌水，其中含抗生素药物：甲氧节氨啼啶（Tmp, 50mg/mL) 30 μ L，Apr (50mg/mL) 20 μ L ;让 其在37°C培养箱下生长2-4天，直到接合子出现；接合子在不加抗生素的M-ISP4固体培 养基平板上连续传代3代后，挑选表型为Kan sAprR (即耐受Apr，不耐受Kan)的接合子，提 取基因组DNA，用验证引物（MltF和MltR)进行PCR，如PCR产物仅有1905bp突变带，而无 野生带则表明接合子即为mtdMl被突变的突变株00652-Δ 1，由此得到MtdMl基因失活的 M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 1〇
[0032] 本发明中的其他突变株的构建方法与M. thermotolerans SCSIO 00652突变株 00652-Δ 1类似，突变引物和验证引物见表1。
[0033] 由此得到 M. thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ 1 (对 mtdMl 基因进 行突变，使其失活，该mtdMl基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966 的 12136-12840 位碱基所示）、E thermotolerans SCSIO 00652 突变株 00652-Δ2(对 mtdM2基因进行突变，使其失活，该mtdM2基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登 陆号为：JN651966 的 31045-32109 位碱基所示）、M. thermotolerans SCSIO 00652 突变 株00652- △ 3 (对mtdM3基因进行