专利名称：加强了adpA表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过加强adpA基因在淀粉酶产色链霉菌的表达提高丰加霉素产量，属于基因工程技术领域。
背景技术：
丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C12H13N5O4,核糖C1连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。丰加霉素属于链霉菌的次级代谢产物，合成途径复杂，受到多种因素的限制与调控，导致丰加霉素合成水平较低，难以规模化生产。解决该问题的现有办法一般都是通过传统的诱变育种作为主要手段筛选高产优质的生产菌株，但筛选到高效菌株的不确定因素多、周期长。随着分子生物学等技术的发展，如何利用先进技术提高次级代谢产物的产量成为研究的热点。有研究表明，a办A基因是链霉菌A-因子调控网络中的中心转录多效调控因子，参与多种生命活动，可激活很多形态分化和次级代谢产物所需基因的表达。灰色链霉菌，天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的adpk基因均被成功克隆，研究发现adpk基因缺失株形态分化受阻，次级代谢产物合成量降低，通过基因互补可恢复突变株形态分化和次级代谢物合成能力。同时，将模式菌株天蓝色链霉菌3办八基因在其他链霉菌中的异源表达可以提高次级代谢产物的产量。但是此策略只在少数特定的菌株，及特定目标产物上成功过。对淀粉酶产色链霉菌来说，从表达体系的建立到目标产物的提高涉及到复杂的因素，目前尚无报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种加强了 adpA表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途。淀粉酶产色链霉菌^Streptomyces diastatochromogenes) 1628 是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的代谢工程分子改造方面的的研究报道。本发明首先从以淀粉酶产色链霉菌i^treptomyces diastatochromogenes) 1628(菌株的保藏编号为CGMC C N0.2060)中克隆出中心转录多效调控因子^办八基因，并将该基因与链霉菌整合表达型质粒PIB139连接，成功构建了携带aW基因的重组载体pIB139-aW，并利用接合转移法将其整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌，它的染色体上过量整合了中心转录多效调控因子adpk基因，具有比淀粉酶产色链霉菌{Streptomycesdi as ta tochromogenes) 1628更高的丰加霉素合成能力。所述的产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌的构建方法，过程如下:
1)构建表达载体pIB139-adpA；
2)利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。所述的方法，利用PIB139载体上的启动子permE*启动adpA基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139_adpA特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌iStreptomycesdi as ta tochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。所述的淀粉酶产色链霉菌工程菌生产丰加霉素的用途，重组菌丰加霉素合成途径的关键酶基因转录水平显著增强，与原始菌株相比，重组菌丰加霉素产量至少提高了31.6%。本发明的有益效果:
本发明加强中心转录多效调控因子a办A基因在淀粉酶产色链霉菌中过量表达后使其丰加霉素合成途径的关键酶基因toyF转录水平增强，最终合成丰加霉素的能力比原始菌提高了 31.6%。为进一步提高丰加霉素产量，早日实现工业化生产奠定了基础。
图1是重组质粒pIB139-adpA的构建示意图。图2是重组质粒pMD18-T_adpA的酶切验证。1.DNA Marker DL2000 ； 2.pMD18-T_adpA/M/e l+Not I ；3.adpA 基因。图3是重组穿梭表达质粒pIB139_adpA的酶切电泳验证图。1.adpk gene ；2.ρΙΒ139-3φΑ/Λ<3ι9 l+Not I ；3.λ YMk/Hin III Marker ；4.pIB139/M/e I。图4是重组菌1628-ADPA的PCR电泳验证图。1.原始菌株；2-5.基因工程菌株；6.DL2000 Marker。图5是重组菌1628-ADPA和原始菌toyF基因的转录水平分析图。1.重组菌1628-AD PA ;2.原始菌株。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步的说明。实施例1:目的基因的扩增及重组淀粉酶产色链霉菌的构建
以 51 di as ta tochromogenes 1628 染色体基因组为模板，以 PadpA F Nde I 和 PadpAR Not I为引物，PCR扩增获得含有Λ汝I和Afoi I两个酶切位点的aobA基因，与pMD18_TVector 连接，构建克隆载体 pMD18-T-ai//7A (.Nde I + Not I )，将克隆载体 pMD18-T_ai//7A(Me I + Not I)转化至受体大肠杆菌中，涂布于含Amp的LB琼脂平板上，37 1:培养过夜后，随机挑取阳性转化子酶切鉴定后送上海生工测序并进行序列分析，用I和Not I双酶切得到含有I和Not I两个酶切位点的<3办八基因，与同样双酶切的链霉菌整合型穿梭表达载体PIB139连接(图1)，得到重组穿梭表达载体pIB139-adpA经酶切验证后，将其转入E coli ET12567(pUZ8002)，在卡那抗性和阿泊拉霉素抗性的LB平板上筛选阳性转化子疋 coli ET12567(pUZ8002，pIB139-ai//7A)，以万.coli ET12567 (pUZ8002, ρΙΒ139-3φΑ)为供体，淀粉酶产色链霉菌为受体，利用接合转移法将pIB139-adpA整合在淀粉酶产色链霉菌51 di as ta tochromogenes 1628染色体上，在阿泊拉霉素抗性MS平板上筛选阳性转化子，即得到重组淀粉酶产色链霉菌1628-ADPA。以51 di as ta tochromogenes 1628染色体为模板，设计两条引物，PCR扩增adpA,引物设计如下:
adpA F Nde 1:5，-CGCCATATGATGAGCCAGGACTCCGC -3，adpA R Not 1:5，-CGCGCGGCCGCCTACGGGGCGCTGCGC-3，
重组质粒pMD18-T-adpA以限制性内切酶I和Not I双酶切验证如图2所示，重组质粒pMD18-T-adpA双酶切获得约1.2 kb和2.7 kb的DNA片段，分别与adpA基因片段和质粒pMD18-T的大小一致，说明重 组克隆载体连接正确。对重组质粒pMD18-T-adpA进行测序，序列分析表明插入片段为1263 bp的序列，编码420个氨基酸，相对分子量大小分别约为46 kDa，与已报道的许多链霉菌属的3办六基因具有较高的同源性，其中最高为89%。扩增获得的adpA基因GenBank登录号为:JX847412.1。整合型重组穿梭表达质粒pIB139_adpA的酶切验证结果如图3所示，重组质粒pIB139-adpA经Λ汝I和Not I双酶切释放1.2 kb的片段与aobA基因大小一致，说明质粒pIB139_adpA构建正确，以接合转移法将其整合在淀粉酶产色链霉菌{Streptomycesdi as ta tochromogenes) 1628的染色体上,在阿泊拉霉素抗性平板上随机挑取若干单菌落于CP培养基中培养多次后，提取染色体。PCR均能扩增出阿泊拉霉素抗性基因a/Tr (图4)，证明重组淀粉酶产色链霉菌1628-ADPA构建成功，且遗传稳定。实施例2 =AdpA基因的表达对丰加霉素合成关键酶基因转录水平的影响
重组淀粉酶产色链霉菌1628-ADPA和原始菌株分别在CP培养基中培养48h，收取菌体，使用试剂盒提取总RNA以及除去DNA。通检测260和280 nm处光吸收的比值和琼脂糖凝电泳来确定RNA样品的纯度和质量。检测260处的光吸收来调整各RNA样品的浓度，使其一致，使用试剂盒一步法进行RT-PCR。基因是丰加霉素生物合成的关键酶基因之一，使用引物:toyF F: 5’ -CTGTCGCTGGAGCTGGTGCG ；toyF R: 5’ -CAGCGACGAGGGCGCGGCGG.可以扩增出 toyF 基因的 400 bp 片段，16SrDNA 作 RT-PCR 分析的参照。16S rDNA F: 5’-CGATTACTAGCAACTCCGAC ;16S rDNA R:5’-GGGGTGATGGGGACTCACAG.可以扩增出16S rDNA基因的200 bp片段。与原始菌株1628相比基因的过量表达增强了丰加霉素合成途径关键酶基因toyF的转录水平(如图5所示)。实施例3:淀粉酶产色链霉菌原始菌及重组菌的发酵性能验证
对重组菌1628-ADPA以及原始菌51 di as ta tochromogenes 1628进行250 mL摇瓶发酵实验，从发酵角度对淀粉酶产色链霉菌中adpk基因的过量表达对丰加霉素产量的提高作用进行验证。往复式摇床转速为200 r/min，28°C，发酵96h，对照组为淀粉酶产色链霉菌出发株。发酵结束后，测定发酵液中丰加霉素含量。如表I所示，在整个发酵过程中重组菌丰加霉素的产量均高于原始菌，且重组菌丰加霉素最终产量达到177.62 mg/L，较原始菌提高了约31.6%。且重复性良好。说明在丰加霉素生产菌株51 di as ta tochromogenes 1628中增强次级代谢网络多效调控基因一AdpA的表达有助于提高发酵过程中丰加霉素的产量。表I重组菌与原始菌最终丰加霉素产量的比较
权利要求
1.一种加强了 a办A表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于:它表达了生物合成丰加霉素代谢网络的多效调控基因<3办八，具有比淀粉酶产色链霉菌印tomycesdi as ta tochromogenes) 1628更高的丰加霉素表达能力。
2.如权利要求1所述的加强了adpk基因表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于:所述的原始菌为淀粉酶产色链霉菌kStreptomyces diastatochromogenes) 16280
3.如权利要求1所述的加强表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于:所述的代谢网络的多效调控基因a办A来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌(S trep tomyces di as ta tochromogenes)。
4.如权利要求1所述的加强了表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于:所述的多效调控基因adpk整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌染色体。
5.一种如权利要求1所述的加强表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于，过程如下: 1)构建表达载体pIB139-a办A； 2)利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用PIB139载体上的启动子permE*启动adpk基因的表达，利用接 合转移法将载体pIB139-ai//7A特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌{Streptomyces di as ta tochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。
7.一种利用如权利要求1所述的加强了表达的重组淀粉酶产色链霉菌的用途，其特征在于，重组菌丰加霉素合成途径的关键酶基因toyF转录水平增强，与原始菌株相比，重组菌丰加霉素产量至少提高了 31.6%。
全文摘要
本发明公开了一种加强了adpA表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途。它过量表达了次级代谢网络中心转录调控因子adpA，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628更高的丰加霉素合成能力。构建过程如下1)构建表达载体pIB139-adpA；2)利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。利用pIB139载体上的启动子permE*启动adpA基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-adpA特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。与原始菌株相比，重组菌丰加霉素合成途径的关键酶基因toyF转录水平显著增强，丰加霉素产量至少提高31.6%。为进一步提高丰加霉素产量，早日实现工业化生产奠定了基础。
文档编号C12N15/31GK103233018SQ20131016806
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者马正, 俞晓平, 陶立彬, 申屠旭萍, 边亚琳, 郝培应, 许益鹏 申请人:中国计量学院