专利名称：一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母及构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母及构建方法和应用。
背景技术：
由于矿物燃料资源的不可再生性，急需寻找替代能源。第一代生物能源主要以谷物食品等为原料，在成本和社会效益上均有限制。第二代生物能源则试图以废弃的农副产品如秸杆等木质纤维素为原料，不与人类争夺粮食资源，具有广阔发展前景。木质纤维素 (Iignocellulose)是地球上生物量最大的物质，是开发第二代生物能源的理想原料，应用前景非常诱人，其利用必须以转化为可发酵性糖为前提。
木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，但成分复杂、性质稳定，由半纤维素(Hemicellulose)、木质素(Lignin)、纤维素(Cellulose)组成，含量分别占三分之一左右，解构糖化后通过进一步发酵即可生成生物乙醇。
纤维素酶由内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶三种酶组成，可将纤维素彻底糖化水解为葡萄糖，进而通过发酵微生物如酵母的发酵进一步转化为生物乙醇。因此， 开发高活力纤维素酶对于发展第二代生物能源具有重要意义。
目前已研制的纤维素酶主要存在以下问题启动酶重组表达的启动子的活力不足，从而使酶的重组表达量不足；酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达。细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率。分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。
综上所述，启动酶重组表达的启动子活力不足以及酶的细胞内表达和分泌表达方式都严重影响纤维素酶活力。发明内容
本发明提供了一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母，利用该重组酿酒酵母表面展示纤维素酶，表达效率较高，表达量较大，能获得较高酶活的纤维素酶。
一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母，为含有重组质粒的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；所述酿酒酵母的GALl基因被GAL4基因替换；所述的重组质粒由酿酒酵母表达载体pGMAK和插入酿酒酵母表达载体pGMAK中GALl启动子下游MF α 1 信号肽与酿酒酵母的细胞壁α凝集素基因之间的纤维素酶基因组成。
所述的酿酒酵母为酿酒酵母ZD-I (Saccharomyces cerevisiae ZD-1)，为 2010 年 3月从柑橘果皮表面分离、筛选得到的，保藏于浙江大学生物系统工程与食品科学学院发酵工程实验室。
所述的纤维素酶基因为内切纤维素酶基因、外切纤维素酶基因或葡萄糖苷酶基因。纤维素酶是一种复合酶，包括内切纤维素酶、外切纤维素酶或葡萄糖苷酶三种，均可酶解纤维素。分别以三种酶的酶基因作为外源目的基因构建重组质粒，可获得能表面展示相应酶的重组酿酒酵母。
所述酿酒酵母的GAL4基因序列的Genbank号为NC 001148. 3 ；所述酿酒酵母的 GALl基因序列的Genbank号为NC 001134. 7。GAL4蛋白是酿酒酵母表达载体pGMAK上GALl 启动子的激活子，GALl基因缺失的重组酿酒酵母不能以乳糖为碳源，但具有双重GAL4基因的重组酿酒酵母可表达双倍量的GAL4蛋白，进而能显著增强GALl启动子的活力，提高外源目的基因在GALl启动子和MF α 1信号肽引导下的分泌表达水平。
所述酿酒酵母表达载体pGMAK的表达框从5’端到3’端依次为GAL1启动子 (Genbank号:AY428072)、MF α 1信号肽(Genbank号M17301)、酿酒酵母的细胞壁α凝集素基因(Genbank号iC8164) ,ADHl终止子。所述的GALl启动子能启动外源目的基因的表达；所述的MF α 信号肽能引导酶向细胞外分泌；所述的酿酒酵母的细胞壁α凝集素能锚定在酿酒酵母的细胞壁中，作为载体蛋白能使纤维素酶高密度展示表达在酿酒酵母细胞壁外表面，能有效提高酶的活性。
所述的内切纤维素酶基因可以来自木霉(Trichoderma reesei)，Genbank号为 DQ178347. 1 ；所述的外切纤维素酶基因可以来自木霉(Trichoderma reesei), Genbank号为M55080. 1 ；所述的葡萄糖苷酶基因可以来自曲霉(Aspergillus aculeatus)，Genbank号为 D64088.1。
本发明还提供了所述的重组酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤将纤维素酶基因插入酿酒酵母表达载体pGMAK中GALl启动子下游MF α 1信号肽与酿酒酵母的细胞壁α 凝集素基因之间，构建获得重组质粒；采用同源重组技术将所述酿酒酵母的GALl基因替换为GAL4基因，将所述重组质粒转入该细胞，获得重组酿酒酵母。
采用所述的同源重组技术，用酿酒酵母的GAL4序列替换酿酒酵母染色体组中的 GALl序列，该酵母系统染色体组中原有的GAL4基因仍然保留，从而可使该酵母系统具有双重GAL4基因并且GALl基因缺失(dGAL4 Δ GALl型)。
本发明还提供了所述的重组酿酒酵母在制备纤维素酶制剂中的应用，包括以下步骤将所述的重组酿酒酵母接种于含稻壳粉和半乳糖的YPD培养基中进行发酵培养，发酵培养36 72小时后离心收集菌体，制得纤维素酶制剂。
优选地，以重量百分比计，所述YPD培养基中稻壳粉的浓度为3-8%，半乳糖的浓度为0. 5-2%，最有利于酵母的生长和纤维素酶的表达。
优选地，所述的发酵培养时间为40-45小时，此条件下分泌表达的纤维素酶酶活最尚。
本发明通过同源重组技术将酿酒酵母细胞内的GALl基因替换为GAL4基因，获得具有双重GAL4基因的重组酿酒酵母，可有效提高重组质粒GALl启动子的表达效率，增加纤维素酶的表达量；同时，重组质粒末端连接的细胞壁α凝集素基因所表达的细胞壁α凝集素，能将纤维素酶高密度展示表达在酿酒酵母细胞壁外表面，能显著提高纤维素酶的酶活。 试验证明，与使用出发菌株酿酒酵母作为展示表达宿主相比，使用本发明所构建的重组酿酒酵母展示表达纤维素酶，表达获得的纤维素酶酶活更高。
具体实施方式
实施例1具有双重GAL4基因且GALl基因缺失的酿酒酵母的构建
采用同源重组技术，用酿酒酵母ZD-I (Saccharomyces cerevisiae ZD-1)的 GAL4 基因(GerAank号NC 001148. 3)替换该酿酒酵母染色体组中的GALl基因(Genbank号NC 001134. 7)，使该酵母系统具有双重GAL4基因并且GALl基因缺失(dGAL4 Δ GALl型)，具体步骤如下
(1)人工合成KanMX抗性基因(Genbank号S78175. 1)，该基因两端分别含GALl蛋白5’端和3’端序列，各为47bp。
(2)将两端分别含GALl蛋白5’端和3’端序列的KanMX抗性基因通过电击转化入酿酒酵母ZD-I，以置换GALl基因。电击转化程序为
①从YEPD平板上挑取单个酵母菌落，接种于5ml YEPD培养基中，30°C、200rpm振荡培养过夜后，取100 μ 1菌液接种于含IOml YEPD培养基的三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养 8-IOh 至 OD6qq = 1.3-1.5。
②分装菌液到灭菌的2ml离心管中，冰上放置15min后5500rpm 4°C离心5min收集细胞。去离子水洗涤1-2次，弃上清，每管用320 μ 1灭菌超纯水重悬，加40 μ 1 10ΧΤΕ 以及 40 μ 1 10\1^々(；，混勻，301 85rpm 振荡 45min，加 20μ 1 DTT 至终浓度为 25mM，30°C 85rpm 振荡 15min。5500rpm 4°C离心 5min 收集细胞。
③用Iml预冷过的灭菌超纯水重悬细胞沉淀，5500rpm 4°C离心5min收集细胞，重复该步骤2次。
④用Iml预冷过的IM D-山梨醇重悬细胞沉淀，5500rpm 4°C离心5min，再用 100 μ 1预冷过的IM D-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混勻，此为酵母感受态细胞，置于冰上用于电击转化。
⑤取40μ 1酵母感受态菌，与5μ 1 IOmM KanMX抗性基因溶液混合，移入电击转化杯，冰浴5min后，置电转仪上电击转化。条件为电压1.51^，电容2511 ，电阻200 0，时间5毫秒。
⑥立即加入Iml冰浴的YEPD培养基，将混合物转到1. 5ml Ependorf管中，30°C振荡池，其间每隔30min轻轻颠倒混勻一次。
⑦5500rpm室温离心5min，弃上清，用灭菌超纯水洗涤一次后，5500rpm室温离心5min，用200μ 1灭菌超纯水悬浮细胞，将菌液涂布于含G418 QOO μ g/ml)或 Zeocin (150 μ g/ml)的YPD培养板，30°C倒置培养培养2_3天，长出的阳性菌落即为GALl基因被KanMX抗性基因置换成功者。
(3)人工合成GAL4蛋白基因，该基因两端分别含GALl蛋白5’端和3’端序列，各为 47bp。
(4)将两端分别含GALl蛋白5’端和3’端序列的GAL4蛋白基因通过电击转化入酿酒酵母ZD-I，以置换KanMX抗性基因。电击转化程序为
①-⑥同步骤O)中的相关部分；
⑦5500rpm室温离心5min，弃上清，用灭菌超纯水洗涤一次后，5500rpm室温离心5min，用200μ 1灭菌超纯水悬浮细胞，将菌液涂布于不含G418 QOO μ g/ml) 或&0(^11(15(^8/1111)的YPD培养板后，再用硝酸纤维素膜覆盖平板后，复印到含G418(200y g/ml)或Zeocin (150 μ g/ml)的YPD培养板，如此则2种平板互为影印平板。 30°C倒置培养培养2-3天，如果在含G418 (200 μ g/ml)或Zeocin (150 μ g/ml)的YPD培养板上的某位置无菌落长出，而在不含G418 QOO μ g/ml)或kocin (150 μ g/ml)的YPD培养板上相应长出菌落，则该菌落即为KanMX抗性基因被GAL4基因置换成功。
通过步骤(1)至步骤的操作，酿酒酵母ZD-I的GALl基因先被KanMX抗性基因置换，然后KanMX抗性基因被GAL4基因置换，最终实现GALl基因被GAL4基因置换，构建获得具有双重GAL4基因并且GALl基因缺失(dGAL4 Δ GALl型)的酿酒酵母。
实施例2表面展示内切纤维素酶的重组酿酒酵母
(1)内切纤维素酶展示表达框的构建
将内切纤维素酶基因(来自木霉Trichoderma reesei, Genbank 号DQ178347· 1) 插入酿酒酵母表达载体PGMAK中GALl启动子(Genbank号AY428072)下游MFa 1信号肽 (Genbank号M17301)与酿酒酵母细胞壁α凝集素基因(Genbank号IC8164)之间，构建获得内切纤维素酶展示表达框(从N端到C端)GAL1启动子+1^^1信号肽+内切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因，具体步骤如下
①人工合成MF α 1信号肽(5，端带EcoR I位点，3，端带BamH I位点)，GALl启动子(GALlp，5’端带BamH I位点，3’端带Hind III位点)，内切纤维素酶基因(ECE，5’端带 Hind III位点，3’端带Mc I位点)和酿酒酵母细胞壁α凝集素基因C端序列(aAGc，5’ 端带Mc I位点，3，端带Ml I位点)。
②BamH I酶切MF α 1信号肽序列和GALlp序列，将带3，BamH I粘末端的MF α 1 信号肽序列和带5，BamH I粘末端的GALlp序列通过T4DNA连接酶连接，成为MF α I-GALlp 嵌合序列。
③Hind III酶切MF α I-GALlp嵌合序列和ECE序列，将带3’ Hind III粘末端的 MFa I-GALlp嵌合序列和带5，Hind III粘末端的ECE序列通过1MDNA连接酶连接，成为 MFa Ι-GALlp-ECE 嵌合序列。
④Mc I酶切MF a 1-GALlp-ECE嵌合序列和a AGc序列，将带3’ Mc I粘末端的 MF a 1-GALlp-ECE嵌合序列和带5，Mc I粘末端的a AGc序列通过T4DNA连接酶连接，成为MF a 1-GALlp-ECE- a AGc嵌合序列，即内切纤维素酶展示表达框(从N端到C端)GAL1 启动子+MF al信号肽+内切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因。
(2)展示表达内切纤维素酶的重组酿酒酵母的构建
将包含内切纤维素酶展示表达框的重组质粒转化入dGAL4AGALl型酿酒酵母细胞中，构建重组酿酒酵母，具体包括
①将本实施例中步骤(1)构建的内切纤维素酶展示表达框通过电击转化入实施例1构建的dGAL4AGALl型酵母中，电击转化步骤见实施例1。
②完成电击转化后，将酵母菌液涂布于含5%纤维素的YPD平板，30°C倒置培养培养2-3天，菌落大且周围出现透明圈者即为带内切纤维素酶展示表达框的dGAL4AGALl型酵母(Sc-dGAL4 Δ GALl-ECE- a AGc)。
(3)内切纤维素酶的展示表达和酶活测定
将上述步骤O)构建的重组酿酒酵母k_dGAL4 Δ GALl-ECE-a AGc接种于IOml YEPD中，30°C、200rpm振荡培养8-10h至OD600 = 1. 3-1. 5后，取ImL菌液接种于5%稻壳粉和半乳糖的YPD培养基中，经42小时后，培养体系中内切纤维素酶活力达到679U/mL。
其中，内切纤维素酶酶活的测定内切纤维素酶从纤维素分子内部切断糖苷键，使大分子纤维素断裂为小分子纤维素，露出更多的还原端，故可通过测定还原糖增加量评价内切纤维素酶活力。内切纤维素酶活力定义以CMC-Na(—种纤维素钠盐)为底物，ImL酶液每分钟产生1 μ mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个内切纤维素酶活力单位，记为U。
内切纤维素酶展示表达后酶活的比较
实施例2根据上述步骤(1)至步骤(3)的结果，本实施例使用dGAL4 Δ GALl型酿酒酵母作为展示表达宿主，内切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MFa 1信号肽+内切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因”；经测定，展示表达的内切纤维素酶活力达到679U/mL。
对比例1按照实施例2中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用出发菌株酿酒酵母ZD-I作为展示表达宿主，内切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MFa 1信号肽+内切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因”，其余步骤相同；经测定，展示表达的内切纤维素酶活力达到245U/mL。
对比例2按照实施例2中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用出发菌株酿酒酵母ZD-I作为分泌表达宿主，内切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MFa 1信号肽+内切纤维素酶基因”，其余步骤相同；经测定，分泌表达的内切纤维素酶活力达到106U/mL。
对比例3按照实施例2中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用dGAL4 Δ GALl型酿酒酵母作为分泌表达宿主，内切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+内切纤维素酶基因”，其余步骤相同；经测定，分泌表达的内切纤维素酶活力达到168U/mL。
实施例3表面展示外切纤维素酶的重组酿酒酵母
(1)外切纤维素酶展示表达框的构建
将外切纤维素酶基因(来自木霉Trichoderma reesei, Genbank号=M55O8O. 1) 插入酿酒酵母表达载体PGMAK中GALl启动子(Genbank号AY428072)下游MF α 1信号肽 (Genbank号Μ17301)与酿酒酵母细胞壁α凝集素基因(Genbank号IC8164)之间，构建获得外切纤维素酶展示表达框(从N端到C端):GAL1启动子+MF α 1信号肽+外切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因，具体步骤如下
①人工合成MF α 1信号肽(5，端带EcoR I位点，3，端带BamH I位点)，GALl启动子(GALlp，5’端带BamH I位点，3’端带Hind III位点)，外切纤维素酶基因(XCE，5’端带 Hind III位点，3’端带Mc I位点)和酿酒酵母细胞壁α凝集素基因C端序列(aAGc，5’ 端带Mc I位点，3，端带Ml I位点)。
②BamH I酶切MF α 1信号肽序列和GALlp序列，将带3，BamH I粘末端的MF α 1 信号肽序列和带5，BamH I粘末端的GALlp序列通过T4DNA连接酶连接，成为MF α I-GALlp 嵌合序列。
③Hind III酶切MF α I-GALlp嵌合序列和XCE序列，将带3’ Hind III粘末端的 MFa I-GALlp嵌合序列和带5，Hind III粘末端的XCE序列通过T4DNA连接酶连接，成为 MFa Ι-GALlp-XCE 嵌合序列。
④Mc I酶切MF a 1-GALlp-XCE嵌合序列和a AGc序列，将带3’ Mc I粘末端的 MF a 1-GALlp-XCE嵌合序列和带5，Mc I粘末端的a AGc序列通过T4DNA连接酶连接，成7为MF α 1-GALlp-XCE- α AGc嵌合序列，即外切纤维素酶展示表达框(从N端到C端)GAL1 启动子+MF α 信号肽+外切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因。
(2)展示表达外切纤维素酶的重组酿酒酵母的构建
将包含外切纤维素酶展示表达框的重组质粒转化入dGAL4AGALl型酿酒酵母细胞中，构建重组酿酒酵母，具体包括
①将本实施例中步骤(1)构建的外切纤维素酶展示表达框通过电击转化入实施例1构建的dGAL4AGALl型酵母中，电击转化步骤见实施例1。
②完成电击转化后，将酵母菌液涂布于含5%纤维素的YPD平板，30°C倒置培养培养2-3天，菌落大且周围出现透明圈者即为带外切纤维素酶展示表达框的dGAL4AGALl型酵母(Sc-dGAL4 Δ GALl-XCE- α AGc)。
(3)外切纤维素酶的展示表达和酶活测定
将上述步骤(2)构建的重组酿酒酵母k_dGAL4 Δ GALl-XCE-α AGc接种于IOml YEPD中，30°C、200rpm振荡培养8-10h至OD600 = 1. 3-1. 5后，取ImL菌液接种于5%稻壳粉和半乳糖的YPD培养基中，经42小时后，培养体系中外切纤维素酶活力达到^7U/mL。
其中，外切纤维素酶酶活的测定外切纤维素酶通过从纤维素分子端部切断糖苷键产生寡聚糖而起糖化作用，所形成寡聚糖带还原端，故可通过测定还原糖增加量评价外切纤维素酶活力。外切纤维素酶活力定义以CMC-Na(—种纤维素钠盐)为底物，ImL酶液每分钟产生1 μ mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个外切纤维素酶活力单位，记为 U。
外切纤维素酶展示表达后酶活的比较
实施例3根据上述步骤(1)至步骤(3)的结果，本实施例使用dGAL4 Δ GALl型酿酒酵母作为展示表达宿主，外切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+外切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因”；经测定，展示表达的外切纤维素酶活力达到^7U/mL。
对比例4按照实施例3中步骤(1)至步骤(3)的操作，其中，使用出发菌株酿酒酵母ZD-I作为展示表达宿主，外切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+外切纤维素酶基因+细胞壁α凝集素基因”，其余步骤相同；经测定，展示表达的外切纤维素酶活力达到136U/mL。
对比例5按照实施例3中步骤(1)至步骤(3)的操作，其中，使用出发菌株酿酒酵母ZD-I作为分泌表达宿主，外切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+外切纤维素酶基因”，其余步骤相同；经测定，分泌表达的外切纤维素酶活力达到106U/mL。
对比例6按照实施例3中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用dGAL4 Δ GALl型酿酒酵母作为分泌表达宿主，外切纤维素酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+外切纤维素酶基因”，其余步骤相同；经测定，分泌表达的外切纤维素酶活力达到124U/mL。
实施例4表面展示葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母
(1)葡萄糖苷酶展示表达框的构建
将葡萄糖苷酶基因(来自曲霉Aspergillus aculeatus, Genbank 号=DMO88. 1) 插入酿酒酵母表达载体PGMAK中GALl启动子(Genbank号AY428072)下游MFa 1信号肽 (Genbank号M17301)与酿酒酵母细胞壁α凝集素基因(Genbank号IC8164)之间，构建获得葡萄糖苷酶展示表达框(从N端到C端)GAL1启动子+MF α 1信号肽+葡萄糖苷酶基因+细胞壁α凝集素基因，具体步骤如下
①人工合成MF α 1信号肽(5’端带EcoR I位点，3，端带BamH I位点)，GALl启动子(GALlp，5’端带BamH I位点，3’端带Hind III位点)，葡萄糖苷酶基因(GTS，5’端带 Hind III位点，3’端带Mc I位点)和酿酒酵母细胞壁α凝集素基因C端序列(aAGc，5’ 端带Mc I位点，3，端带Ml I位点)。
②BamH I酶切MF α 1信号肽序列和GALlp序列，将带3，BamH I粘末端的MF α 1 信号肽序列和带5，BamH I粘末端的GALlp序列通过T4DNA连接酶连接，成为MF α I-GALlp 嵌合序列。
③Hind III酶切MF α I-GALlp嵌合序列和GTS序列，将带3，Hind III粘末端的 MFa I-GALlp嵌合序列和带5，Hind III粘末端的GTS序列通过1MDNA连接酶连接，成为 MFa Ι-GALlp-GTS 嵌合序列。
④Sac I酶切MF α 1-GALlp-GTS嵌合序列和α AGc序列，将带3' Sac I粘末端的 MF α 1-GALlp-GTS嵌合序列和带5，Me I粘末端的α AGc序列通过T4DNA连接酶连接，成为MF α 1-GALlp-GTS- α AGc嵌合序列，即葡萄糖苷酶展示表达框(从N端到C端)GAL1启动子+MF α 信号肽+葡萄糖苷酶基因+细胞壁α凝集素基因。
(2)展示表达葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母的构建
将包含葡萄糖苷酶展示表达框的重组质粒转化入dGAL4AGALl型酿酒酵母细胞中，构建重组酿酒酵母，具体包括
①将本实施例中步骤(1)构建的葡萄糖苷酶展示表达框通过电击转化入实施例1 构建的dGAL4AGALl型酵母中，电击转化步骤见实施例1。
②完成电击转化后，将酵母菌液涂布于含5%纤维素的YPD平板，30°C倒置培养培养2-3天，菌落大且周围出现透明圈者即为带葡萄糖苷酶展示表达框的dGAL4AGALl型酵母(Sc-dGAL4Δ GALl-GTS- α AGc)。
(3)葡萄糖苷酶的展示表达和酶活测定
将上述步骤O)构建的重组酿酒酵母k_dGAL4 Δ GALl-GTS-α AGc接种于IOml YEPD中，30°C、200rpm振荡培养8-10h至OD600 = 1. 3-1. 5后，取ImL菌液接种于5%稻壳粉和半乳糖的YPD培养基中，经42小时后，培养体系中葡萄糖苷酶活力达到454U/mL。
其中，葡萄糖苷酶酶活的测定葡萄糖苷酶从纤维素分子末端切断糖苷键产生葡萄糖，故可通过测定还原糖增加量评价葡萄糖苷酶活力。葡萄糖苷酶活力定义以 CMC-Na (—种纤维素钠盐)为底物，ImL酶液每分钟产生1 μ mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个葡萄糖苷酶活力单位，记为U。
葡萄糖苷酶展示表达后酶活的比较
实施例4根据上述步骤(1)至步骤(3)的结果，本实施例使用dGAL4 Δ GALl型酿酒酵母作为展示表达宿主，葡萄糖苷酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+葡萄糖苷酶基因+细胞壁α凝集素基因”；经测定，展示表达的葡萄糖苷酶活力达到454U/mL。
对比例7按照实施例4中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用出发菌株酿酒酵母ZD-I作为展示表达宿主，葡萄糖苷酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+葡萄糖苷酶基因+细胞壁α凝集素基因”，其余步骤相同；经测定，展示表达的葡萄糖苷酶活力达到 212U/mL0
对比例8按照实施例4中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用出发菌株酿酒酵母ZD-I作为分泌表达宿主，葡萄糖苷酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+葡萄糖苷酶基因”，其余步骤相同；经测定，分泌表达的葡萄糖苷酶活力达到137U/mL。
对比例9按照实施例4中步骤⑴至步骤(3)的操作，其中，使用dGAL4 Δ GALl型酿酒酵母作为分泌表达宿主，葡萄糖苷酶表达框为“GAL1启动子+MF α 1信号肽+葡萄糖苷酶基因”，其余步骤相同；经测定，分泌表达的葡萄糖苷酶活力达到118U/mL。
权利要求
1 一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母，为含有重组质粒的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，所述酿酒酵母的GALl基因被GAL4基因替换； 所述的重组质粒由酿酒酵母表达载体PGMAK和插入酿酒酵母表达载体pGMAK中GALl启动子下游MF α 信号肽与酿酒酵母的细胞壁α凝集素基因之间的纤维素酶基因组成。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述的纤维素酶基因为内切纤维素酶基因、外切纤维素酶基因或葡萄糖苷酶基因。
3.如权利要求1所述的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤将纤维素酶基因插入酿酒酵母表达载体PGMAK中GALl启动子下游MFa 1信号肽与酿酒酵母的细胞壁α凝集素基因之间，构建获得重组质粒；采用同源重组技术将所述酿酒酵母的GALl基因替换为GAL4基因，将所述重组质粒转入该细胞，获得重组酿酒酵母。
4.如权利要求1或2所述的重组酿酒酵母在制备纤维素酶制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤将所述的重组酿酒酵母接种于含稻壳粉和半乳糖的YPD培养基中进行发酵培养，发酵培养36 72小时后离心收集菌体，制得纤维素酶制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，以重量百分比计，所述YPD培养基中稻壳粉的浓度为3-8%，半乳糖的浓度为0. 5-2%。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养时间为40-45小时。
全文摘要
本发明公开了一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母及构建方法和应用。该重组酿酒酵母的构建方法为将纤维素酶基因插入酿酒酵母表达载体pGMAK中GAL1启动子下游MFα1信号肽与酿酒酵母的细胞壁α凝集素基因之间，构建获得重组质粒；采用同源重组技术将酿酒酵母的GAL1基因替换为GAL4基因，将所述重组质粒转入该细胞，获得重组酿酒酵母。本发明通过同源重组技术获得了具有双重GAL4基因的重组酿酒酵母，可有效提高GAL1启动子表达效率；同时，细胞壁α凝集素能将纤维素酶高密度展示表达在酿酒酵母细胞壁外表面。利用该重组酿酒酵母表面展示纤维素酶，表达效率较高，表达量较大，能获得较高酶活的纤维素酶，且酵母发酵培养后可直接作为纤维素酶制剂使用。
文档编号C12N15/81GK102517224SQ20111044667
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者何国庆, 吴渊, 周陈伟, 张延 , 徐娟, 杜珊珊, 杨璐, 纪晓燚, 阮晖 申请人:浙江大学