促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明提供一种促进肝细胞miR?199b高表达的慢病毒表达载体，包括pCDH?CMV?MCS?EF1?Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿色荧光基因的Pri?miRNA?199b序列产物；所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色荧光基因的Pri?miRNA?199b序列产物正向插入所述多克隆位点序列中。本发明属于基因工程技术领域，本发明提供的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地提高miRNA?199b表达。
【专利说明】
促进肝细胞m i R-19%高表达的慢病毒表达载体及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其设及促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表 达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002] miRNA是一类进化保守的内源性的非编码小分子，普遍存在于多样性生物体内参 与基因调控。miRNA主要调控着编码蛋白的基因表达，其作用机制是降解与其互补结合的 mRNA或抑制不完全配对的mRNA翻译，具有非常重要的生物学作用。
[0003] miRNA是在细胞核内DNA聚合酶II作用下由DNA转录成为初级miRNA(pri-miRNA)。 miRNA在核内酶RNase III-化OSha的作用下加工剪切为六屯十个核巧酸序列的发夹结构前 体pre-miRNA，然后再依赖RNA的核转运受体家族成员输出蛋白EwOTtin-S的作用下转运到 胞浆。在胞浆RNase III Dicer酶作用下二次加工为单链的成熟miRNA,与RNA诱导沉默复合 物结合形成RISC,识别祀mRNA后抑制其翻译或通过去腺巧酸化和脱帽作用致使mRNA降解。
[0004] 通过miRNA祀基因预测软件查找能与SET基因3'-UTR互补结合的miRNAs，包括 miRNA-23a,miRNA-21,miRNA-199b,miRNA-20a,miRNA-29b,miRNA-194,miRNA-221,HiiRNA- 129 等。
[0005] 现有研究中已发现miR-199b在肝癌中异常低表达且与病人预后密切相关。李卫华 等人将miR-199b片段转染至尤文肉瘤细胞中，但利用的是脂质体瞬时转染而并非稳定转 染，质粒会随着细胞增殖而逐渐丢失。因此对于miR-199b在肝细胞中的功能研究受到限制。 目前尚未见在人源肝细胞中持续、稳定且高效表达miR-199b的重组载体。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢 病毒表达载体，通过将含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物与pCDH-CMV-MCS- EFl-化ro病毒载体连接得到的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可在 人源肝细胞中持续、高效、稳定地提高miRNA-199b表达。本发明中，miR-199b指miRNA-199b。
[0007] 本发明提供一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，包括pCDH-CMV- MCS-EFl-Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿 色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物;所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物正向插入所述多克隆位点 序列中。
[000引采用上述技术方案，本发明提供的含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物 插入pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro病毒载体构建得到的重组慢病毒表达载体具有转染效率高， 用量少的优点，可持续、高效、稳定地提高miRNA-199b表达，可应用于制备治疗miRNA-199b 表达异常相关疾病药物的开发中。
[0009] 优选地，所述含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物通过PCR扩增获得，W Pri-miRNA-199b重组质粒为模板，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列 为：CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即 SEQ ID N0:1，所述下游引物的序列为： CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即 SEQ ID NO: 2。采用上述模板和PCR 引物，通过PCR可 W 扩 增出含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列，减少了序列合成费用，成本较低且便于观 察检测转染效率。
[0010]更优选地，所述P;ri-miRNA-199b重组质粒包括pCI MammaLian Expression Vector表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Pri-miRNA- 199b序列；所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和Kpn I酶切位点，所述Pri-miRNA-199b序 列正向插入所述多克隆位点序列中。
[00川进一步优选地，所述Pri-miRNA-199b序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引 物和下游引物，所述上游引物的序列为:GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即沈Q ID NO: 3， 所述下游引物的序列为:GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO: 4。通过PCR扩增， 引进了EcoRI和KpnI两个特异性酶切位点。
[001^ 本发明提供的上游引物和下游引物均无引物二聚体，且上游引物和下游引物的退 火溫度差距较小。
[0013] 相应地，本发明还提供一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建 方法，包括如下步骤：
[0014] 51:口'1-11111?麻-19机的引物设计：通过11111?8日36库找到与561'基因关联的11111?麻- 199b基因的Pri-miRNA序列，并引进EcoR I和时n I特异性酶切位点，设计上游引物为： GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，良P SEQ ID N0:3;下游弓| 物为： GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC,即沈Q ID NO:4;上述引物通过PCR扩增得到的产物包含 EcoR I和Kpn I特异性酶切位点；
[00巧]S2: Pri-miRNA-199b序列的获得：提取人肝细胞总RNA后，利用RNA逆转录试剂盒将 RNA反转录为cDNA，WcDNA为模板，并用步骤Sl中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得 Pri-miRNA-199b 序列；
[0016] S3:P;ri-miRNA-199b重组质粒的获得：pCI MammaLian E邱ression Vector载体经 改造在化O巧此coR I位点插入了Zsgreen-绿色巧光基因后，和步骤S2获得的Pri-miRNA- 199b基因序列分别经EcoR I和Kpn I限制性内切酶双酶切后，T4 DNA连接酶连接得到连接 产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨节青霉素LB培养基平板上， 妇陳阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明Pri-miRNA- 199b序列插入成功的菌液进行测序鉴定，将测序鉴定正确的大肠杆菌培养并抽提，得到含 Pri-miRNA-199b 序列的 Pri-miRNA-199b 重组质粒；
[0017] S4:含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物的获得：W步骤S3得到的Pri- miRNA-199b重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引 物的序列为：CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即SEQ ID NO: 1，所述下游引物的序列为： CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即沈Q ID NO: 2，得到含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b 序列产物；
[001引 S5:促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建:将pCDH-CMV-MCS-EFl- 化ro病毒载体用化e I和BamH I限制性内切酶进行双酶切后，T4DNA连接酶将步骤S4获得的 含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物连接到pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro病毒载体， 得到重组慢病毒表达载体。
[0019] 优选地，所述人肝细胞为化-7702细胞，所述感受态大肠杆菌为JM 109。
[0020] 此外，本发明还提供所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体在制备 治疗SET基因或miR-199b基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括:本发明通过将扩增含有绿色巧光基因 的Pri-miRNA-199b序列产物，并插入pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro病毒载体构建得到稳定的重 组慢病毒表达载体，该慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、稳定 地促进人肝细胞miRNA-199b高表达，可应用于与miRNA-199b基因表达异常的研究中。本发 明还提供了特异促进肝细胞miRNA-199b高表达的慢病毒表达载体的构建方法，操作效果 好，减少了序列合成费用，成本较低且便于观察检测转染效率。
【附图说明】
[0022] 图1本发明实施例S中PCR扩增后的凝胶电泳图。
[0023] 图2本发明实施例S中Pri-miR-199b重组质粒的测序结果图。
[0024] 图3本发明实施例S中Pri-miRNA-199b重组质粒的双酶切结果图。
[0025] 图4 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro病毒载体的图谱。
[0026] 图5本发明实施例六中重组慢病毒表达载体的测序结果图。
[0027] 图6本发明实施例六中重组慢病毒表达载体的双酶切结果图。
[00%]图7本发明实施例八中病毒上清感染化-7702肝细胞后的巧光显微镜图。
[0029] 图8本发明实施例八中实时巧光定量PCR检测miR-199b的相对表达结果图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0031] 本发明中所用到的材料可通过市售得到或通过本领域的常规方法得到。如:化- 7702细胞购自中国科学院上海细胞库，pCI MammaLian Expression Vector表达载体购自 美国Promega公司，pCDH-CMV-MCS-EFl-化ro病毒载体购自深圳市博奥康生物技术有限公司 foieasy Mini Kit试剂盒和逆转录试剂盒购自德国QIAGEN公司，Endo-free Plasmid Maxi Kit购自美国Omega公司，病毒包装辅助试剂盒购自日本化kara公司，T4DNA连接酶购自宝生 物工程(大连)有限公司。
[0032] 实施例一 Pri-miRNA-199b的引物
[0033] 通过miRBase库找到与沈T基因关联的miRNA-199b基因的Pri-miRNA序列，并引进 EcoR巧日Kpn I特异性酶切位点，设计上游引物为:GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即沈Q 10顯：3;下游引物为：6666140：0：410：1'(：1'〔461'(：刊0：1'(：，即569 10顯:4，交由上海生工生 物公司合成。
[0034] 实施例二Pri-miRNA-199b序列的获得
[0035] 培养化-7702肝细胞至对数生长期时，用PBS缓冲液清洗细胞S次后，将残留PBS缓 冲液吸取干净，按照化easy Mini Kit试剂盒说明书进行操作，得到总RNA。利用RNA逆转录 试剂盒将RNA反转录为cDNA，WcDNA为模板，并用实施例一中的上游引物和下游引物进行
[0( PCR扩增，获得Pri-miRNA-199b序列。PCR扩增反应体系如表1所示，PCR扩增反应条件如表2所示。[0036] 表1 PCR扩增反应体系[0037]
[0(
[0040] 实施例S Pri-miRNA-199b重组质粒的获得
[0041 ] pCI MammaLian Expression Vector载体经过深圳博奥康生物科技有限公司改造 插入了Zsgreen-绿色巧光基因，绿色巧光基因的插入位点为趾Ol和EcoRI。改造后的pCI MammaLian E邱ression Vector载体和步骤S2获得的P;ri-miRNA-199b基因序列分别经EcoR I和Kpn I限制性内切酶双酶切后，T4 DNA连接酶连接得到连接产物。将该连接产物转化到 感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨节青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养 保存菌液并进行PCR初步鉴定，PCR扩增后的凝胶电泳图如图1所示，结果说明菌落PCR鉴定 结果为阳性，可用于挑取质粒进行扩大培养。将初步鉴定结果说明Pri-miRNA-199b序列插 入成功的菌液进行测序鉴定，结果如图2所示，与预期相符。将测序鉴定正确的大肠杆菌培 养，并使用化do-free Plasmid Maxi Kit进行抽提，得到含P;ri-miRNA-199b序列的Pri- miRNA-199b重组质粒;对提取的Pri-miRNA-199b重组质粒进行双酶切鉴定，结果如图3所 示，说明Pri-miRNA-199b重组质粒构建成功。
[0042] 实施例四含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物的获得
[0043] W实施例S得到的Pri-miRNA-199b重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR引物包括上
[00少 游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即SEQ ID NO: 1，所述下游引物的序列为:CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即沈Q ID NO: 2，得到含有绿 色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物。PCR扩增体系如表3所示，PCR扩增反应条件如表4 所示。[004^1 圭9 DrD扩+齡从《
[004d
[0047
[004引实施例五促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建
[0049] 将pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro病毒载体用化e I和BamH I限制性内切酶进行双酶切 后，T4DNA连接酶将实施例四获得的含有绿色巧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物连接到 pCDH-CMV-MCS-EF 1 -Puro病毒载体，得到重组慢病毒表达载体。pCDH-CMV-MCS-EF 1 -Puro病 毒载体的图谱如图4所示。
[0050] 实施例六促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的鉴定
[0051] 将实施例五得到的重组慢病毒表达载体转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含 氨节青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定。将初 步鉴定结果说明Pri-miRNA-199b序列插入成功的菌液进行测序鉴定，结果如图5所示，与预 期相符。将测序鉴定正确的大肠杆菌培养，并使用化do-free Plasmid Maxi Kit进行抽提， 得到重组慢病毒表达载体;对抽提的重组慢病毒表达载体进行双酶切鉴定，结果如图6所 示，说明重组慢病毒表达载体构建成功。
[0化2] 实施例屯转染Pri-miRNA-199b重组慢病毒表达载体进行病毒包装
[0053]培养293T细胞，取实施例六抽提的重组慢病毒表达载体转染293T细胞，按照病毒 包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，4化后收集P;ri-miR-199b病毒上清，5000g离屯、IOmin 后取上清，计算出病毒的滴度为3.4x106IFU。
[0化4] 实施例八Pri-miRNA-199b重组病毒载体的病毒上清感染效果的检测
[0055] 将Pri-miR-199b病毒上清感染化-7702肝细胞，3化后在巧光显微镜下观察到病毒 感染效果如图7所示，从图7可知病毒上清的感染效率很高。
[0化6] Pri-miR-199b重组病毒上清感染化-7702肝细胞后，将感染成功的肝细胞和未感 染的正常肝细胞培养2个月后的总RNA分别提取后，进行实时巧光定量PCR检测miR-199b的 相对表达情况，结构如图8所示，con指未感染的对照组。从图8可知，P;ri-miR-199b重组病毒 感染化-7702肝细胞后的miR-199b的相对表达量远远高于对照组的相对表达量。
[0057] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护化围。
【主权项】
1. 一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括PCDH-CMV-MCS-EF卜Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿 色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物;所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物正向插入所述多克隆位点 序列中。2. 根据权利要求1所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于： 所述含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物通过PCR扩增获得，以Pri-miRNA-199b 重组质粒为模板，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为： CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即 SEQ ID N0:1，所述下游引物的序列为： CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID N0:2。3. 根据权利要求2所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于： 所述Pri-miRNA_199b重组质粒包括pCI MammaLian Expression Vector表达载体的基本序 列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Pri-miRNA-199b序列;所述多克隆位点 包括EcoR I酶切位点和Kpn頂每切位点，所述Pri-miRNA-199b序列正向插入所述多克隆位 点序列中。4. 根据权利要求3所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于： 所述Pr i-miRNA-199b序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游 引物的序列为:GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即SEQ ID NO: 3，所述下游引物的序列为： GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID N0:4。5. -种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于:包括 如下步骤： Sl:Pri-miRNA-199b的引物设计:通过miRBase库找到与SET基因关联的miRNA-199b基 因的Pri-miRNA序列，并引进EcoR I和Kpn I特异性酶切位点，设计上游引物为： GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，_PSEQ ID N0:3;下游弓丨物为： GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC,BPSEQ ID N0：4； S2: Pri-miRNA-199b序列的获得:提取人肝细胞总RNA后，利用RNA逆转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，以cDNA为模板，并用步骤Sl中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得 Pri-miRNA_199b 序列； S3:Pri-miRNA_199b重组质粒的获得：pCI MammaLian Expression Vector载体经改造 在Xho I和EcoR I位点插入了Zsgreen-绿色荧光基因后，和步骤S2获得的Pri-miRNA-199b 基因序列分别经EcoR I和Kpn I限制性内切酶双酶切后，T4DNA连接酶连接得到连接产物， 将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上，挑取 阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明Pri-miRNA-199b 序列插入成功的菌液进行测序鉴定，将测序鉴定正确的大肠杆菌培养并抽提，得到含Pri-miRNA-199b 序列的 Pri-miRNA-199b 重组质粒； S4:含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物的获得：以步骤S3得到的Pri-miRNA-199b重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引 物的序列为:CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即SEQ ID NO: 1，所述下游引物的序列为： CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即 SEQ ID NO: 2，得到含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b 序列产物； S5:促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建:将pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 病毒载体用Nhe I和BamH I限制性内切酶进行双酶切后，T4 DNA连接酶将步骤S4获得的含 有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物连接到pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro病毒载体，得 到重组慢病毒表达载体。6. 根据权利要求5所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建方法， 其特征在于:所述人肝细胞为HL-7702细胞，所述感受态大肠杆菌为JM 109。7. 权利要求1至6中任一项所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体在制 备治疗SET基因或miR-199b基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
【文档编号】C12N15/66GK105925613SQ201610325842
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】任晓虎, 刘建军, 黄新凤, 钟佳成, 阮嘉雯
【申请人】深圳市疾病预防控制中心