带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种带有标记基因的Tet?on诱导过表达的重组载体及构建方法，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了成本低而高效的载体系统及其相应的转基因方法来建立转基因细胞系，并通过可控诱导目的外源基因过表达来观察该基因在多能干细胞向造血分化过程中可能发挥的效应和功能。本发明中的载体也能够很好的应用于其他细胞或模式动物的转基因操作，以简化遗传研究的方法。
【专利说明】
带有标巧基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载 体及制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有的基因过表达载体主要有慢病毒载体，还原病毒载体，类腺病毒载体，转座子 载体和非整合质粒等。从建立稳定转基因细胞系的角度来看，整合载体是最适合于转基因 方法研究基因功能的。目前最有效的整合载体是慢病毒载体和转座子载体PiggyBac。
[0003] 慢病毒载体最大的优点是侵染效率和整合效率高，足够高的滴度条件下几乎可W 使全部目标细胞受到转染，包括一些很难转染的细胞型。但它的缺点也是很明显：
[0004] (1)首先它有物种特异性，受制于受体特异性，一般而言只能转染人类细胞；即使 经过基因改造，其应用的范围一般也不超过哺乳动物，应用面有限；
[0005] (2)载体本身体积太大而载体容量小，不能满足很多分子遗传学操作的需要；
[0006] (3)包装困难且花费高昂，往往针对特定基因的包装十分艰难甚至不可能，导致研 究方法的不可预见性，运是慢病毒载体的一个致命弱点；
[0007] (5)慢病毒载体整合到基因组W后很容易被基因沉默，其基因表达强度和持续性 往往较弱并且只在少数细胞群中有表达。
[000引基于转座子原理的载体系统，包括PiggyBac,Sleeping Beauty等等，其中效率最 高的是PiggyBac载体。WSBI公司生产的PB系列载体为例，作为基于PiggyBac的表达载体， 具有如下的显著优点：
[0009] (1)没有物种和细胞型的限制，可W转染几乎所有的模式生物和细胞类型；
[0010] (2)可W用脂质体、憐酸巧沉淀法或电转化方法转化各种细胞，也可W注射受精 卵，一般转染效率都很高；
[0011] (3)无需包装步骤，省时省力，而且几乎可W成功表达各种类型序列的表达框，基 本没有序列特异性的问题，最大程度降低了研究进度的不可预见性，比慢病毒系统大大节 省了时间，精力和花费；
[0012] (4)由于PB系列载体都含有特定的隔离子（insulator)保护，表达框不易被失活而 且表达持续而稳定，任何时期和任何类型细胞里都可W成功表达；
[0013] (5)载体容积很大，插入片段可W达到1业bW上，可W满足目前绝大多数分子遗传 学研究的需要，也为后续衍生载体的开发提供了巨大空间；
[0014] (6)载体体积相对较小，易于分子克隆操作，载体的重组变异可能性要小于病毒载 体。
[0015] (7)该系统配套的转座酶表达载体经过人源化改造，是目前重组效率最高的 PiggyBac转座酶，配套使用整合效率很高。
[0016] 但它的缺点在于该载体没有现成的适合我们需要的商品化Tet-on诱导表达系统， 重新改造载体工作量又相当大；
[0017] 本发明中的造血分化研究是从人类多能干细胞化PSC)开始向造血分化的，由于该 类细胞具有极其强烈的对于外源基因和载体表达的沉默特性，成为最难构建转基因细胞系 的细胞种类。同时hPSC对慢病毒的转导非常抗拒和敏感，极易导致基因沉默和细胞死亡W 及分化，难W有效应用已经极为成熟的慢病毒体系来实现基因的功能研究。而从hPSC向造 血分化过程中，会出现很多种细胞型，需要在各个不同的细胞型和发育时期实现基因的高 效持续过表达，运些都对载体系统提出了极为苛刻的要求。为了实现我们的实验目的，并创 造出兼具各自优点的载体系统，必须对其进行彻底的改造，来实现与满足在研究中的需要。
【发明内容】
[0018] 本发明所要解决的问题在于克服上述不足之处，提供一种带有标记基因的Tet-on 诱导过表达的重组载体及构建方法。
[0019]解决W上技术问题的一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的PiggyBac重组载 体，其特征在于:核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0020] 所述重组载体包括源于pTRIPZ的Tet-on顺式表达元件和反式表达元件，W实现成 功的诱导过表达;所述载体还包含源于PB513B-1的PiggyBac载体骨架、标记基因GFP及T2A 序列，W实现高效的基因整合和方便分子克隆。
[0021 ] 所述化t-〇n顺式表达元件包括TRE调控区域和CMV mini Promoter序列。
[0022] 所述Tet-on反式表达元件包括hUbC启动子、tTA3 CDS、内部核糖体插入位点 (IRES)元件、嚷岭霉素(Puromycin)抗性基因W及猴空泡病毒(SV 40化olyA。
[0023] 所述PiggyBac载体骨架包括边界与整合元件、隔离子、细菌克隆抗性筛选基因和 复制原点，等。
[0024] 本发明中构建具有带有标记基因的成熟的Tet-on诱导过表达的重组载体，并利用 PiggyBac载体骨架将其插入人类多能干细胞的基因组，构建能够持续高效而无渗漏性的外 源基因诱导表达转基因细胞系。
[0025] 本发明中一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方法，包括如 下步骤：
[0026] 步骤一：设计5 ' 引物GFP-5 ' -XhoI和3 ' 引物T2A-3 ' -SwaI，WPB513B-1 载体为模板， PCR扩增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收；pTRIPZ的一个衍生载体 pHBTetOE-puro-Gatal，也经过趾O巧日MluI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段WT4 DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5a ;并进行酶切鉴定与基因序列的测 定，构建成抑BTet0E-GFP-T2A-C载体；
[0027] 步骤二：设计5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PB PCR扩增出2.化b 长的Tet-on相关元件，3 '用T4 PNK憐酸化，5 '引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化;PB513B- 1经过SpeI和化al双酶切后切胶回收;插入片段和载体片段WT4 DNA连接酶连接;将连接后 的产物转化感受态细胞D册a;并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB-Tet-on-OE载 体。
[0028] 所述步骤一中，引物为：
[0029] 5'引物GFP-5'-XhoI:
[0030] 5 ' TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3 '；
[0031] 3'引物124-3'-5讯曰1:
[0032] 日'TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTMATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3'。
[0033] 所述步骤二中，引物为：
[0034] 5 ' 引物I'et-on-S ' -PB-LVX: 5 ' CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3 ' ；
[0035] 3 ' 引物I'et-on-S ' -PB: 5 ' ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3 '。
[0036] 所述步骤一中，扩增程序为:98°C预变性1111111，98。(：变性1〇3,58。(：退火3〇3,72。(：延 伸 1111111，35个循环后72°(：1〇111111，4°(：保存。
[0037] 所述步骤二中，扩增程序为:94°C预变性1111111;94。(：变性153,60。(：退火3〇3,68。(：延 伸5min，32个循环后72°C10min，4°C保存。
[0038] 本发明中还有根据重组载体而得的基于人类抓NX化基因诱导过表达载体PB-Tet- on-GFP-T2A-hRunx 化。
[0039] 本发明所述载体在构建能诱导过表达RUNXlb的人类多能干细胞系W及该基因功 能研究中的应用。
[0040] 本发明的有益效果为：
[0041] 该载体的优点在于：
[0042] (1)保持了PTRIPZ绝大多数Tet-on顺反式元件，因此也就继承了其主要的优点，能 够在几乎所有生物和细胞型中正常表达并避免渗漏表达。同时避免了慢病毒载体的很多缺 点，如容易沉默，物种和细胞型限制，W及转导病毒可能带来的细胞毒性和免疫反应。
[0043] (2)保持了PiggyBac载体，特别是PB513B-1的基因组整合特性，包括经过改进的整 合序列和人源化转座酶，整合效率高，且可W用多种转染方法进行转基因操作。
[0044] (3)增大了Tet-on系统插入片段的范围，即使是很大基因片段的插入，也不影响载 体的转染、整合和正常过表达;而同样的操作在pTRIPZ衍生载体中会使载体长度超过病毒 包装的极限，导致包装效率极低甚至不能包装。利用PiggyBac载体骨架使得运个载体具有 很大的改造潜力，日后可W在运个载体上插入更多的元件，具有更多的功能。
[0045] (4)从PB513B-1引入隔离子元件（Insulator)保护Tet-on元件在插入任何物种或 细胞型的基因组的任何部位或者在细胞不同发育阶段都能正常过表达，大大提高了过表达 的效率和载体的有效作用时空点。
[0046] (5)该载体不仅可W在人类多能干细胞中有效使用，也能很好的应用于其他任何 生物体或不同的细胞系，其可移植性非常出色。构建一个成功的载体，就能迅速应用于其他 的模式生物或细胞系的转基因操作，可W大大加速基因功能的研究进程。
[0047] (6)由于引进了一个与目的基因共表达但又独自定位的GFP基因（green fluorescence protein)，使得在不影响目的基因功能定位的前提下，提供了一个监测其时 空表达的精确方式，使研究者能够用流式分析技术和其他免疫巧光技术准确分析和追踪目 的基因正常表达的细胞，使其生物学效应不被其他未整合或基因沉默的细胞所淹没。运是 目前绝大多数PiggyBac类型载体系统中所没有的，特别适合于沉默效应明显的研究系统 中。
[0048] 本发明构建了成本低而高效的载体系统及其相应的转基因方法来建立转基因细 胞系，并通过可控诱导目的外源基因过表达来观察该基因在多能干细胞向造血分化过程中 可能发挥的效应和功能。本发明中的重组载体也能够很好的应用于其他细胞型或模式动物 的转基因操作，W简化遗传研究的方法。
[0049] 化t-on过表达载体的优点：
[0050] 只需化g/ml多西环素(Doxycycline)即可进行强度很高的过表达，表达时间也很 持久，而如此低浓度的诱导剂对于宿主细胞的毒性很低，减低了研究的背景，也利于迅速打 开和关闭目的基因的过表达，有利于研究精度的提高；
[0051] 没有添加 Doxycycline时无渗漏型表达，属于严谨控制的诱导表达体系，有助于减 少对宿主细胞的毒性和降低表达背景，提高研究的精度和可信度；
[0052] 目标基因的启动子是CMV，反式激活因子的启动子是P邮C，都没有物种和细胞型的 表达特异性，适应面很广。
[0053] 由于顺式表达元件和反式调控元件都在一个载体上，单个载体发生整合即能使 Tet-on系统有效运作，大大提高了获得良好转基因细胞系和成功诱导表达的机率。
[0054] 本发明不仅适合于在转基因多能干细胞向造血分化过程研究中，也试用其他细胞 及动物模型的相关转基因和诱导过表达研究。
【附图说明】
[0化5]图1为本发明中的带有GFP标记基因的成熟Tet-on诱导过表达系统PB-Tet-on-OE 的质粒示意图。
[0056]图 2-1，2-2 为转染了PB-Tet-on-OE 和 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的人类多能干 细胞化1)进行诱导表达的巧光图
[0057]图3为本发明中qPCR法鉴定过表达水平结果图
[005引图4-1为本发明中Western Blot法在蛋白水平鉴定过表达结果图，图4-1中（A为 Runxl特异性抗体检测的Western Blot结果，B为GAPDH特异性抗体检测的Western Blot结 果，Al，B1为DOX未诱导的PB-Tet-0n-GFP-T2A-hRunx化hESC总蛋白抽提样品，A2，B2为DOX 诱导过表达的PB-Tet-0n-GFP-T2A-hRunx化hESC总蛋白抽提样品，[,PageRuler预染蛋白 Ladder，D0X诱导过表达样品检测到一个52. Skd的主带，与人类RUNX化蛋白的分子量吻合； 还有一个79. Skd的次带，是未被蛋白酶切开的人类Runxlb蛋白与GFP蛋白连接在一起的全 长肤段）
[0059] 图4-2中A图为GFP特异性引物扩增PCR产物检测结果，B图为hRurudb特异性引物扩 增口0?产物检测结果；41，81:^?8-1日1-〇11-6。？-124-11咖^化1165〔旨日11〇1111〇0臟为模板，^ GFP或hRunx化特异性引物扩增的PCR产物;A2，B2:WPB-Tet-on-0EhESCgenomicDNA为模 板，WGFP或hRunx化特异性引物扩增的PCR产物;A3，WPB-Tet-on-OE质粒DNA为模板，WGFP 特异性引物扩增的PCR产物；B3，WPB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb质粒DNA为模板，WhRurudb 特异性引物扩增的PCR产物;Ml:肥B化b ladder,M2:肥B IOObp ladder)
[0060] 图5-1,5-2为本发明中流式细胞检测结果图
[0061 ]图6-1，6-2为转基因1165(：系向^胚层分化的巧光检测图
[0062] 图 7-l，7-2为转基因hESC系PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx化（编号96)和PB-Tet-on- 0E(编号53)多能性的巧光检测图
[0063] 图8-1到图8-7为转基因hESC系向造血分化过程D4的重要造血分化相关基因qPCR 检测图，比较有无hRUNX化过表达对于运些基因转录水平表达的影响
【具体实施方式】
[0064] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述，其中的分子 克隆步骤参照《分子克隆实验指南》相关章节进行，试剂盒试剂等相关材料均为市售商品， 具体如下：
[0065] 本发明中W下实施例中所用pTRIPZ及其衍生载体购自汉恒公司，PB513B-1载体购 自SBI公司；限制性内切酶及DNA修饰酶购自肥B公司；
[0066] hESCs细胞系Hl由中国医学科学院实验血液学国家重点实验室于2011年9月提供； mAGM-S3取自小鼠的AGM区，自1998年在本实验室维持并保持稳定高效的造血能力；
[0067] 其中，试剂：BSA美国Sigma A9418，IMDM培养基美国GIBCO 12440053，DMEM培养基 美国Sigma D5796，F12培养液美国GIBCO 21700-075，KSR美国Gibco N10828-028，mTeSRl STEMCE化 05850，Y-27632(ROCK抑制剂）MERCK 688000,改良型a-MEM美国Hyclone 細3〇265.〇18，非必需氨基酸（肥44)美国6化。〇〇7796，0-琉基乙醇51旨111曰，〇.25%1'巧93111/ EDTA G化CO 25200056,胎牛血清(FBS)Hyclone 0078，bFGF WAKO 060-04543,血管内皮细 胞生长因子(VEGF)WAKO 229-01313，心谷氨酷胺Gibco 25030081，青霉素/链霉素Gibco 15070063，May-Giemsa染液德国MERCK,台吩蓝（Tiypan Blue stain)G;Lbco公司，抗坏血酸 (Ascorbic acid)Sigma公司，转铁蛋白（Transferrin)Sigma公司，Mahigel 抓公司；实时 巧光定量PCR试剂盒Roche FastS^d Universal SYBR Green Master(R0X)04913914001， 逆转录试剂盒Bio-rad iScript TM Cdna Synthesis Kit 170-8891。
[006引实施例1
[0069] 一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体，核巧酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
[0070] 构建方法，包括如下步骤：
[0071] 步骤一：设计5' 引物GFP-5'-XhoI和3' 引物T2A-3'-SwaI，WPB513B-1 载体（SBI公 司）为模板，PCR扩增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收;pTRWZ的一个衍 生载体P皿TetOE-puro-Gatal (汉恒公司），也经过化〇1和MluI双酶切后切胶回收;插入片段 和载体片段WT4 DNA连接酶连接;将连接后的产物转化感受态细胞DH5a ;并进行酶切鉴定 与基因序列的测定，构建成抑BTet0E-GFP-T2A-C载体；
[0072] 步骤二：设计5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PBPCR扩增出2.化b长 的Tet-on相关元件，3 '用T4 PNK憐酸化，5 '引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化;PB513B-1 经过SpeI和化al双酶切后切胶回收;插入片段和载体片段WT4 DNA连接酶连接;将连接后 的产物转化感受态细胞D册a;并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB-Tet-on-OE载 体。
[0073] 所述步骤一中，引物为：
[0074] 5 ' 引物GFP-5 ' -XhoI: 5 ' TTTCCCCTCGAGCCAC CATGGAGAGCGACG 3 ' ； 3 ' 引物124-3'- SwaI:5 ' TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3 '。
[0075] 所述步骤一中，扩增程序为:98°C预变性lmin，98°C变性10s，58°C复性30s，72°C延 伸 1111111，35个循环后72°(：1〇111111，4°(：保存。
[0076] 步骤一中反应体系如下表1:
[0077]表1 [007引
[0079] 所述步骤二中，引物为：
[0080] 5'引物16*-〇11-5'斗8-1^￥乂：5乂64661'1'押464〔6461'7^(：1'〔0：3'；3'引物161-〇11- 3'-PB:5'ATTGTT CCAGACGCGAACTCAGG 3'。
[0081 ] 所述步骤二中，扩增程序为:94°C预变性lmin;94°C变性153,60°(：复性3〇3,68°(：延 伸5min，32个循环后72°C10min，4°C保存。
[0082] 步骤二中反应体系如下表2:
[0083] 表 2 「OORAl LUU狀」 买砸例2
[0086] 其它内容如实施例1中的内容，本发明中重组载体包括源于pTRIPZ的Tet-on顺式 表达元件和反式表达元件，W实现成功的诱导过表达;所述载体还包含源于PiggyBac载体 骨架，W实现高效的基因整合和方便分子克隆。
[0087] !"61:-011顺式表达元件包括TRE调控区域和CMV mini Promotor序列。
[008引 Tet-on反式表达元件包括WJbC启动子、tTA3 CDSJRES元件、Puromycin抗性基因 W及SV 40 化lyA。
[0089] PiggyBac载体骨架包括边界与整合元件、隔离子、细菌克隆抗性筛选基因和复制 原点，等。
[0090] 本发明中构建具有带有标记基因的成熟的Tet-on诱导过表达载体，并利用 PiggyBac载体骨架将其插入人类多能干细胞的基因组，构建能够持续高效而无渗漏性的外 源基因诱导表达转基因细胞系。
[00川试验例：
[0092] 本发明中的试验例W人类RUNX化诱导过表达的多能干细胞系为例：
[0093] 基于人类RUNXb基因诱导过表达载体PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化的构建：
[0094] 1，如图1所示，该载体WPB-Tet-on-OE质粒为出发质粒。设计引物Runxla,b-5'- ATG(5'ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAG 3'）和Runxlb，c-3'coding(5' TTTAAAGCGGCCGCGAATTCATTAATAGGGCCTCCACACGGCCTCCTC 3 '）（该序列不引入多余的氨基酸 序列到hRUNX化），并WpcDNA3-Rurudb质粒上的人类Rurudb CDS为模板进行PCR扩增反应， 获得5'端含有ATG起始密码子和3'端携带有EcoRI酶切位点的人类Runxlb编码区序列 (1359bp)。利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物后用T4PNK进行末端憐酸化并用EcoRI酶 切，PB-Tet-on-OE质粒进行SwaI和EcoRI双酶切并切胶回收，WT4DNA连接酶连接。将连接后 的产物转化感受态细胞D册a,并进行酶切鉴定与基因序列的测定。
[00巧]2,基于Hl的转基因细胞系PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化及其载体对照PB-Tet-on- OE的建系过程：
[0096] (1)转染质粒的制备：将含有质粒 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE的 D册a菌株的冻存菌液在含有Amp的固体LB培养基平皿中划线接种，37°C过夜培养获得单个 菌落。挑单个菌落到3ml的Amp-LB液体培养基中37 °C 28化pm培养8小时后，1/500接种到含有 Amp的100mL LB液体培养基中，37°C280rpm过夜培养。利用化reLink? HiPure Plasmid Midiprep Kitdnvi化Ogen,cat:K2100-05)制备质粒，并利用分光光度法测定0D260/280及 核酸浓度，-80°C保存备用。
[0097] (2)人类多能干细胞系的细胞培养与传代
[0098] 本研究中使用的基础细胞系为人类胚胎干细胞系Hl，培养条件为商品化的mTeSRl 培养基(Stem cell公司）37°C、5%C02的培养箱中培养。在细胞成长汇合至80%后，WD-PBS 洗涂细胞一次，再W专口的商品化酶Re 1 eSR(Stem Ce 11，cat: 05872)37°C消化5分钟。再W mTeSR培养基将细胞团吹成适当小片，Wl: 3的比例分装到Matrigel (Invitrogen ,cat: A1413301)打底的培养皿中继续培养。
[0099] (3)多能干细胞系的转染和抗性筛选
[0100] 按1:3的培养面积比接种Hl细胞到Ma化igel打底的24孔板中并培养1-2天，当hESC 克隆达到适当大小时，加入脂质体与质粒的混合物进行转染。具体方法如下:在第一个无菌 的 0.6ml eppendo;rf 管添加SOul 〇pti-MEM@ Medium ,然后加入0.5]ig转座子载体 transposon(PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunxlb或PB-Tet-on-0E)与转座子辅助载体 transposase(PB200A-l ,SBI公司）的混合物，其mol比为1:3，再加入化 1 LP3000? Reagent， 混合均匀；在第二个无菌的0.6ml eppendoW管添加50]ilOpti-MEM及:Medium,然后加入 0.75]il Lipol'ccUiminc货3000 Reagent，混合均匀；最后将两个管中的成分迅速混匀后室溫 解育5min，然后加入到相应的含有50化1 mTeSRl培养基的24孔板的孔中，混合均匀后37°C、 5%C02的培养箱中继续培养2天，其中第二天添加25化1 mTeSRl培养基;保留一个孔为不加 任何DNA的转染阴性对照。之后吸去上清，添加新鲜的50化1 mTeSRl培养基，继续培养2-3 天，每天换液;最后换成含有化g/ml Puromycin的mTeSRl培养基，每天换液，直至所有没有 被转染的hESC被杀死而具有化romycin抗性的克隆长到足够大又不互相融合的时候，挑取 5-10个状态最好而较大的克隆到Ma1:;rigeI打底的96孔板中用含有Ijig/ml Puromycin的 mTeSRl继续培养。待其生长汇合之后连续传代，从96孔板到48孔板，再到24孔板，最后传到 35-mm培养皿中。运之后再用不含化romycin的mTeSRl培养基继续扩大培养。最后当hESC生 长汇合后每35-mm培养皿用ReleSR解离后重悬于含有20%DMS0的mTeSRl培养基中并分装到 2个冻存管中，先放到室溫的冻存盒（Nelgene,Oyo 1 °Cfreezing Container ,cat: 5100- 0001)中，在-80°C低溫冰箱中降溫过夜，然后转移到液氮罐中永久保存。
[0101] 3,转染 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE 的 Hl 细胞系的转基因和诱导 过表达鉴定：
[0102] (1)转基因整合鉴定：培养于35-mm培养皿的转基因Hl细胞系用QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen ,cat :51104)提取基因组 DNA，然后用Runxla，b-5'-ATG/Runxlb，c-3' coding^相应基因组DNA为模板进行PCR扩增人类RUNX化CDS及GFP CDS序列，Wl %琼脂糖 胶IxTAE电泳系统检测PCR产物大小，证实其符合预期大小。
[0103] (2)qPCR进行转录水平的检测
[0104] 培养于24孔板的转基因细胞中加入化g/ml DoxycyclineW诱导GFP及RUNX化过表 达，10小时及24小时后用倒置巧光显微镜进行观察和拍照(如图2-1，2-2)。用Trizol试剂抽 提0〇巧巧(31;[]16诱导24小时或未诱导的转基因细胞系总1?酷并用15(31'1口1了^。0臟87]1化6313 Kit (Bio-Rad，cat: 170-8891)逆转录成cDNA, WRunxlb/c-EX7B-F( 5 ' TCTGCAGAACTTT CCAGTCG 3'）和Runx化/c-EX8-R(5'GTCGGGGAGTAGGTGAAGG 3'）作为检测引物，^640口护 EX7-F(5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3'）和GADPH-EX8-R巧'ACCACCCTGTTGCTGTA GCCAA 3'） 作为内参引物，用I^astStart Universal SYBR Green Master kit(Roche,cat: 04913850001)在巧光定量PCR仪(Bio-rad Q5)上进行实时巧光定量检测，W确定诱导表达 的hRUNX化含量上升的倍数。
[01 05] qPCR法鉴定过表达水平结果如图3，PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化（编号为MF96)的 hESC在Doxycycline诱导（D0X+)或不诱导（D0X-)条件下RUNX化表达的转录水平比较，前者 是后者的大约37倍。
[0106] (3)Western Blot进行蛋白水平的检测
[0107] 在培养于35-mm培养皿的转基因多能干细胞中加入化g/ml DoxycyclineW诱导 hRUNX化过表达，然后用0.5mM抓TA将其消化成单细胞并重悬于D-PBS，离屯、沉淀W后用500 iil RIPA(含有ImM PMSF和Roche的Ix蛋白酶抑制剂)重悬，冰浴30min并震荡促使其裂解，最 后12000X g 4°C5min沉淀不溶组分，上清按50山分装并冻存于-80C。用BCA法与标准蛋白进 行比较蛋白样品浓度，并W此为根据调整上样样品的蛋白总量一致。用标准SDS-PAGE(10% 分离胶/5%浓缩胶)在Tis-甘氨酸缓冲电泳体系中分离蛋白样品，然后转至PVGF膜上，用鼠 抗人Runxl-抗（DW71,SC-IOl 146 ,Santa cruz公司）或鼠抗人GAPDH-抗（内参对照，KC- 5G4,Kang化en公司）结合目标，然后用Goat Anti-Mouse IgG HfcL(HRP)Preadsorbed二抗 (ab97040，Abcom公司）结合一抗，最后用Amersham? E化? Prime蛋白印迹试剂（RPN2232， GE Healthcare)显色，用Image如ant LAS 4000 mini拍照记录结果（如图4-1，图4-2)。
[0108] DOX诱导过表达样品检测到一个52. Skd的主带，与人类Runx化蛋白的分子量吻合； 还有一个79. Skd的次带，应该是未被蛋白酶切开的人类Runxlb蛋白与GFP蛋白连接在一起 的全长肤段，而对照未诱导样品没有明显条带。
[0109] 4,转染 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE 的 Hl 细胞系的多能性和向 S 胚层分化能力鉴定
[0110] (1)转基因多能干细胞系的多能性检测
[0111] 转基因人类多能干细胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的克隆细 胞团在0.1%化itonX-100通透后，分别与相应的人类多能干细胞特征性抗体(SSEA4、TRA- l、0ct4和化nog-抗)结合，再与相应的带切3或FITC巧光标记的二抗结合，最后用核DNA染 料DAPI染色，在巧光显微镜下进行巧光检测，如图7-1，7-2。
[0112] 检测结果说明W上两个细胞系都具有正常的人类多能干细胞特征性基因表达，可 W进一步用于向造血分化的研究。
[0113] (2)转基因多能干细胞系向S胚层分化能力的检测
[0114] 转基因人类多能干细胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的克隆细 胞团在 Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(C027 ,R&D Systems公司）的诱导下分别向内胚层，中胚层和外胚层分化。在化iton X-IOO通透后,分别 与相应的特征抗体(S0X17 ,Brachyury和0TX2-抗)结合，再与相应的带切3巧光标记的二抗 结合，最后用核DNA染料DAPI染色，在巧光显微镜下进行巧光检测，如图6-1，6-2。
[0115] 检测结果说明W上两个细胞系都具有正常的向=胚层分化的能力，可W进一步用 于向造血分化的研究。
[0116] 5,共培养系统检测hRUNX化过表达对于人类多能干细胞向造血分化过程的效应。
[0117] (1)转基因hESCs(PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化和 PB-Tet-on-OE)维持未分化培养 采用无基质细胞培养方法，根据W上描述的方法进行培养和传代；
[0118] (2)mAGM-S3基质细胞的准备
[0119] 复苏液氮冻存的mAGM-S3细胞株于明胶包被的IOOmrn培养皿中，培养基为含有5% 胎牛血清的MEM ALPHA M孤(S册0265.Ol ,Hyclone公司），37°C，5%C02培养至细胞完全汇合 之后，用0.05%膜酶消化重悬，用冰的D-PBS和培养基终止消化，传代至明胶包被的12孔板 中，轻柔摇匀，37°C5%C02培养1-2天。当细胞融合度不低于90%时（约2 X 105细胞/孔），13 Gray X射线福照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用。
[0120] (3化ESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞并诱导hRUNX化过表达
[0121] 用2(K)化枪头枪尖在显微镜下将转基因hESCs未分化集落划分成0.5-1 X IO3细胞 的小集落片，W35个集落/12孔板每孔（约2 X 105hESCs/孔）的密度接种集落于福照过的 mAGM-S3细胞上，加1.5ml hESCs未分化细胞维持液，轻柔摇匀，37°C5%C〇2培养3天，然后换 成造血诱导分化液（IMDM 515ml，去补体化FBS 60ml(终浓度10%)，肥AA 5111^心谷氨酷胺 10ml，50mg/ml AA 60化1，转铁蛋白40山，VEGF 10yg，2-ME扣1)再培养14天(从运一天开始 计算开关W后的天数，记为DX)，并从DO开始加或不加Doxycycline来比较有无hRUNX化过表 达对于造血分化的影响，每天换液(D6W后根据细胞培养情况可一天换液2次），至D14将产 生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用。
[0122] (4)流式分析
[0123] 共培养开关后14天(D14)的共培养细胞用D-PBS洗涂2遍，用枪头刺破造血克隆后 用0.25%1'巧93111/邸14 37°(：处理5-7111111，冰0斗85及含血清培养液终止膜酶作用，用11111枪 头反复吹打直至无大细胞团块凝集，收集到离屯、管中，13(K)rpm室溫离屯、5min，弃上清，重悬 于SM buffer(含有2%FBS的D-PBS)，70皿滤膜过滤。大约每0.5ml加入普通兔血清5-lOul混 匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗体抗原非特异性结合位点，再加入特异性抗体(CD34-APC、 CD45-PE各化1)，震荡混匀，冰上避光反应20-30min，lml SM buffer洗涂1次，400xg室溫离 屯、5min，弃上清，SM buffer液20化1重悬于流式上样管中，用抓化nt〇n流式细胞仪进行检 测，实验数据使用FlowjolO软件进行分析。
[0124] 分别针对GFP+和GFP-两个亚群进行CD34+/CD45+细胞群统计分析，发现对于DOX诱 导过表达的PB-Tet-on-OE而言，GFP+和GFP-两个亚群中CD34+/CD45+是接近的；但在DOX诱 导过表达的PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb hES cell line中，CD34+/CD45+细胞群的含量在 GFP-中比GFP+要高出10倍W上。由于人类Rurudb基因和GFP是共表达的，W上检测结果很清 楚的表明Rurudb的过表达对于CD34+/CD45+细胞群的产生具有强烈的抑制作用。（如图5-1， 图 5-2)
[0125] (5)qPCR分析造血分化早期hRUNXlB过表达对于造血分化相关基因表达的影响（如 图8-巧Ij图8-7)
[0126] A，总RNA 抽提
[0127] 用W上的方法来培养和获得PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化和PB-Tet-on-OE开关后 D4的共培养细胞，400xg室溫离屯、5min，弃上清，采用化izol提取总RNA，冻存于-80°C储存， 实时巧光定量PCR方法检测目标基因的表达；
[012引 B，逆转录cDNA
[01巧]逆转录20]iL反应体系：
[0130]
[0131] 反应程序：251：5111111;421：3〇111111;851：5111111;4°(：保存。获得的。0魁样本分装后-80 °C储存；
[0132] C，qPCR 分析
[0135] GAPDH(管家基因）引物序列：[0136] GADPH-EX7-F 5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3'
[0133] WF'astStart Universal SYBR Green Master kit(cat:04913850001 ,Roche)进 如 T A祐^ 历"c 玄I1、
[0134]
[0137] GADPH-EX8-R 5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3'
[013引 Gatal引物序列：
[0139] Gatal-E^-F5'CACGACACTGTGGCGGAGAAAT3'
[0140] Gatal-Ex6-R 日'TTCCAGATGCCTTGCGGTTTCG 3'
[0141] GATA3引物序列：
[0142] GATA3-EXN1-F 5'GCGAGACAGAGCGAGCAA 3'
[0143] GATA-3-EXN2-R 5'ACTGGGTACGGCAGAATAAAA 3'
[0144] LMO巧I物序列：
[0145] LM02-EX2-F 5'GCGCCTCTACTACAAACTGGGC 3'
[0146] LM02-EX3-R 5，CTCATAGGCACGAATCCGCTTG 3，
[0147] PC畑I巧I物序列：
[0148] PCDH12-EX3-F 5，GACCTCTCTGTGAAGCAACTGC 3，
[0149] PCDH12-EX4-R 5'CACATTGTCACGGTAGTTGGTGG 3'
[0150] Runxla 引物序列：
[0151] Runxla-Ex6-F 5'ACAGCCATGAGGGTCAGC 3'
[0152] Runxla-Ex7A-R 5'ATCTCCAGGGTGCTGTGTCT 3'
[0153] SPIl引物序列：
[0154] SPI1-EX2-F 5'GACACGGATCTATACCAACGCC 3'
[0155] SPI1-EX3-R 5'CCGTGAAGTTGTTCTCGGCGAA 3'
[0156] vWF引物序列：
[01 巧]VWF-EX27-F 5'CCTTGAATCCCAGTGACCCTGA 3'
[0158] VWF-EX28-R 5'GGTTCCGAGATGTCCTCCACAT 3'
[0159] 如图8-巧^图8-7结果显示，包括GATA1，GATA3，LM02，PCDH12(VE-CAD)，抓NXla (Runxl的另一种重要剪切体），SPIl，vWF等造血相关重要基因，相比PB-Tet-on-OE(编号 MF53)，在PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化（编号MF96)过表达的D4共培养细胞中被大幅下调， 运可能是其向造血分化被抑制的直接原因。
[0160] W下试验例中主要溶液的配制如下：
[0161] (1)人源化ESC培养基配制
[0162] ml'eSRTMlBasal Medium 400mL
[0163] ml'eSRTMl 放 Supplement IOOmL
[0164] 共500ml，混匀，置于4°C冰箱备用。
[0165] (2)AGM培养液配制
[0166] Q-MEM SOOmL
[0167] FBS(去补体化） 25mL
[0168] 共525ml，混匀，0.22皿滤器过滤，置于4°C冰箱备用。
[0169] (3化ESC未分化细胞维持液配制
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174] ... 。
[01巧]共590ml，混匀，0.22皿滤器过滤，置于4。(：冰箱备用。
[0176] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 带有标记基因的Tet-On诱导过表达的重组载体，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的所述带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体，其特征 在于:所述重组载体包括源于PTRIPZ的Tet-on顺式表达元件和反式表达元件，还包括源于 PB513B-1的PiggyBac载体骨架、标记基因 GFP及T2A序列。3. 根据权利要求2所述的所述带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体，其特征 在于:所述Tet-on顺式表达元件包括TRE调控区域和CMV mini Promoter序列。4. 根据权利要求2所述的所述带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体，其特征 在于:所述Tet-on反式表达元件包括hUbC启动子、tTA3 Q)S、IRES元件、Puromycin抗性基因 以及SV 40 PolyA。5. 根据权利要求2所述的所述带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体，其特征 在于:所述PiggyBac载体骨架包括边界与整合元件、隔离子、细菌克隆抗性筛选基因和复制 原点。6. -种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方法，其特征在于:包括 如下步骤： 步骤一： 设计5 '引物GFP-5 ' -XhoI和3 '引物T2A-3 ' -SwaI，以13B-1载体为模板，PCR扩增出 GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收;pTRIPZ的一个衍生载体pHBTetOE-puro-Gatal，也经过XhoI和MluI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4 DNA连接酶连 接;将连接后的产物转化感受态细胞DH5a;并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成 pHBTetOE-GFP-T2A-C 载体； 步骤二： 设计5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PB PCR扩增出2.7kb长的Tet-on相 关元件，3 '用T4 PNK磷酸化，5 '引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化;PB513B-1经过SpeI和 HpaI双酶切后切胶回收;插入片段和载体片段以T4 DNA连接酶连接;将连接后的产物转化 感受态细胞DH5a;并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB-Tet-on-OE载体。7. 根据权利要求6所述的一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方 法，其特征在于:所述步骤一中，引物为： 5'引物 GFP-5'-XhoI: 5'TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3'； 3'引物 T2A-3'-SwaI : 5. TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTMATGGGCCGGGATTCTCCTC CA 3 '。8. 根据权利要求6所述的一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方 法，其特征在于:所述步骤二中，引物为： 5 ' 引物Tet-on-5 ' -PB-LVX: 5 ' CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3 ' ； 3 ' 引物丁〇卜〇11-3'-PB:5' ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3'。9. 根据权利要求6所述的一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方 法，其特征在于：所述步骤一中，扩增程序为：98 °C预变性Imin，98 °C变性IOs，58 °C退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 个循环后 72°C 10min，4°C 保存； 所述步骤二中，扩增程序为：94 °C预变性Imin ; 94 °C变性15s，60 °C退火30s，68 °C 延伸5 min, 32个循环后72°C 10 min，4°C保存。
【文档编号】C12N15/85GK105925609SQ201610552748
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】陈波, 马峰, 周涯
【申请人】中国医学科学院输血研究所