一种草菇电击法遗传转化方法

一种草菇电击法遗传转化方法
【专利摘要】本发明涉及一种草菇电击法遗传转化方法，包括：测定草菇菌丝对潮霉素的最低耐受浓度，在PDA培养基培养草菇菌丝，利用溶壁酶降解草菇菌丝细胞的细胞壁，收集草菇菌丝体；将构建完成的外源重组载体质粒与草菇菌丝体置于电击杯中，不同的外加电场的作用下完成电击过程，电击后的草菇菌丝体涂布于再生培养基中，在含有潮霉素的培养基上进行抗性筛选，分子检测正常生长的单克隆是否为阳性克隆。本发明为草菇分子生物学的研究提供新的方法，同时为建立草菇生物反应器开辟了方便而经济的途径，为有效解决草菇生产和储藏中的难题提供技术支持和保障。
【专利说明】
-种草茹电击法遗传转化方法
技术领域
[0001] 本发明属于草茹生物工程领域，特别设及一种草茹电击法遗传转化方法。
【背景技术】
[0002] 草茹(Volvariella volvacea)是一种重要的常见食用菌，其栽培起源于我国，具 有悠久的栽培历史，在国际上有"中国茹"之称。草茹是一种原产于热带及亚热带高溫多雨 地区的腐生性真菌，多生长在富含纤维的基质上，如稻草、香蕉叶等。属担子菌纲、伞菌目、 碟膏菌科、草茹属。草茹的栽培地区W亚洲为主，如中国东南沿海诸省及东南亚国家:新加 坡、马来西亚等。草茹具有丰富的经济价值：（1)营养价值高，草茹中含有多种人体必需氨基 酸--丝氨酸，丙氨酸，甘氨酸等；（2)药用价值高，含有多种维生素，经常食用可增进人体健 康，具有降胆固醇、降血压及抗肿瘤等作用。（3)能分泌纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶等 多种分解酶，因此可W在多种含纤维素、木质素的基质上生长。而且生产周期短，就更为草 茹生产提供方便，增加了经济效益。
[0003] 然而由于草茹不耐低溫冷冻，在常规低溫冷冻条件下(4°C)，其菌丝会发生自溶而 死;子实体亦会液化、腐烂。运一特性严重限制了草茹的菌种保藏和产后保鲜。草茹为同宗 结合真菌，生活史复杂，且菌丝间无锁状联合，杂种选择缺乏遗传标记，生物转化率低，草茹 的杂交育种因此变得十分困难。基因工程技术的发展，为解决运一难题提供了新的途径，即 通过建立高效的草茹遗传转化体系，将具有改良草茹工艺农艺性状的基因转入草茹中，获 得正常表达、遗传稳定的理想菌株。因而在草茹中导入抗冷冻蛋白基因能有效解决草茹不 耐低溫问题。
[0004] 目前用于草茹遗传转化的方法有多种，如PEG法，基因枪法，农杆菌介导转化法等。 王杰等采用阳G法将潮霉素抗性基因转入草茹的原生质体中，经过抗性筛选，得到了具有潮 霉素抗性的草茹转化子。PEG法的主要特点是操作简便，结果稳定，重复性好，无需昂贵的设 备，对原生质体的损伤相对较小，但变异率高，而且转化率也比较低，一般为i(T5-i(r6。郭丽 琼等W质粒pCAMBI Al 301为表达载体，优化基因枪法的试验条件，建立了草茹基因枪法遗传 转化体系，并证明外源基因 gus能够在转基因草茹的菌丝体中稳定表达;并将抗冻蛋白编码 基因（AFP)整合入草茹基因组。基因枪法转化特点是可不受原生质体制备及再生问题的限 审IJ，并可直接用于转化菌丝体、夏抱子、子实体。但该方法也存在一些问题，如转化频率低， 外源DNA整合机理不清楚，较难获得稳定遗传的转化子等。王杰等用农杆菌介导法转入抗冷 冻蛋白基因 AFP，探索不同的转化受体、农杆菌种类、乙酷下香酬的浓度、共培养的溫度和时 间等因素对转化效率的影响，试验结果表明AFP基因已整合到草茹的基因组中。农杆菌转化 法的特点是能转化完整的细胞，转化效率高，转化子稳定，但宿主范围较窄。
[0005] 电击法遗传转化方法具有操作方便，流程简单且投入成本低的优点，目前已在多 种食用菌中得到成功应用，然而目前国内外尚未见电击法遗传转化方法在草茹中应用的相 关报道。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种草茹电击法遗传转化方法，该方法为草茹 分子生物学的研究提供新的方法，同时为建立草茹生物反应器开辟了方便而经济的途径， 为有效解决草茹生产和储藏中的难题提供技术支持和保障。
[0007] 本发明的一种草茹电击法遗传转化方法，包括：
[0008] (1)测定草茹菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；
[0009] (2)将草茹菌种接种于液体PDA培养基中，32°C静置培养3~5天，得到草茹菌丝;将 草茹菌丝过滤，溶壁酶酶液酶解，离屯、，加入电击缓冲液制成菌丝液；
[0010] (3)向电击杯中加入电击缓冲液和菌丝液，再加入外源重组载体质粒吹打混匀，放 入冰中静置;用高压脉冲电击转化仪电击，电压为800V，冰上静置;随后恢复培养，加入液体 再生PDA培养基，摇床培养1~化；
[0011] (4)取经过步骤(3)转化处理后的菌丝液涂布于无潮霉素的再生PDA平板上，32°C 培养，切取新生长的菌丝，转入含有最低耐受浓度潮霉素的再生PDA平板上，进行筛选;选取 能够继续生长的菌块，转入含有最低耐受浓度潮霉素的液体PDA培养基中，于32°C培养，得 到转化子;提取转化子基因组DNA基因组，进行PCR分子检测，成功扩增出外源基因则为阳性 转化子。
[0012] 所述步骤(1)中的最低耐受浓度选择范围为2.5~22.5ug/ml。
[0013] 所述步骤(2)中的液体PDA培养基的组成为:马铃馨200g/L，葡萄糖20g/L。
[0014] 所述步骤(2)中的溶壁酶酶液的制备方法为:取0.0：3g溶壁酶，用0.6M甘露醇溶液 溶解，定容至2mL，粗酶液在3000;r/min离屯、15min，取上清液经0.22凹1微孔滤膜过滤除菌后 使用;酶解时间为3~化。
[0015] 所述步骤(2)中的离屯、具体为在2000~4000rpm下离屯、5~lOmin，然后用渗透压稳 定剂离屯、洗涂2次。
[0016] 所述渗透压稳定剂为0.6mol/L甘露醇溶液。
[0017] 所述步骤(2)和(3)中的电击缓冲液的组成为甘露醇0.6mol/L，肥阳S Immol/L。
[0018] 所述步骤(3)中的液体再生PDA培养基的组成为马铃馨200g/L，葡萄糖20g/L，甘露 醇0.6mol/L。
[0019] 所述步骤（4)中的再生PDA平板的组成为马铃馨200g/L，葡萄糖20g/L，甘露醇 0.6mol/L，琼脂 1.5%。
[0020] 本发明首次将电击法成功应用于草茹的遗传转化，克服了基因枪转化过程复杂， 成本高的缺点，W及农杆菌转化不稳定的特点。电击法遗传转化体系的建立为草茹分子生 物学的研究提供新的方法，同时为建立草茹生物反应器开辟了方便而经济的途径，为有效 解决草茹生产和储藏中的难题提供技术支持和保障。
[0021] 有益效果
[0022] (1)本发明流程简单，可操作性强，不要求操作者拥有丰富的分子生物学实验的操 作经验；
[0023] (2)本发明与其他遗传转化方法相比，成本低廉，不需要使用商业试剂盒或委托业 务，转化过程中所需的试剂都是常规性的生物化学试剂，完成一个样品的遗传转化成本仅 需要10元，远低于目前草茹中的常用遗传转化方法一基因枪转化法(50元/样品）；
[0024] (3)本发明为草茹的遗传转化建立了新的方法，开拓了草茹外源基因转入和耐低 溫草茹培育的新途径，为有效解决草茹生产和储藏中的难题提供技术支持和保障。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1的草茹菌株V23对潮霉素的敏感性测定;其中，B-I培养基的 潮霉素浓度分别为5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5ug/ml，A为不含潮霉素对照；
[0026] 图2为本发明实施例1的草茹遗传转化子基因组DNA中卡那基因的扩增情况；
[0027] 图3为本发明实施例2的重组载体PCAMBIA1300: :AFP构建图谱；
[002引图4为本发明实施例2的草茹遗传转化子基因组中外源基因 AFP的扩增情况；
[0029] 图5为本发明实施例2中低溫处理原始菌株和含有转化子PCAMBIA1300: :AFP的转 化菌丝的处理情况。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0031] 实施例1
[0032] 1)草茹菌株V23对潮霉素的敏感性测定:配制含有2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、 20、22.5ug/ml潮霉素的PDA平板，每个浓度处理3次重复。之后在超净台上，在每个平板上接 入边长为5mm的正方形状的菌种，W不加潮霉素的PDA平板作为对照。接种后置于32°C的恒 溫培养箱中培养，每天观察并记录。潮霉素对草茹V23的生长速度影响很大，在15ug/ml时菌 丝生长极慢，20ug/ml时即停止生长，并且22.5ug/ml时菌丝也不生长。故选择潮霉素作为草 茹的抗性筛选试剂，并且确定V23在PDA平板上的最佳筛选浓度为20ug/ml。
[0033] 2)草茹V23菌丝的培养:将菌种接种于IOOmL的液体PDA培养基（马铃馨200g/L，葡 萄糖20g/L)中，32°C静置培养3天。
[0034] 3)制备酶解菌丝:酶液的配制:称取0.0：3g溶壁酶，用0.6M甘露醇溶液溶解，定容到 2mL，粗酶液在3000;r/min离屯、15min，取上清液经0.22皿微孔滤膜过滤除菌后使用(现配现 用）。取培养好的菌丝，用二层灭菌的纱布过滤，然后用无菌水冲洗=次。用无菌纸吸干水分 后悬浮于适量已配制好的酶液中，32 °C，1 OOrpm振荡酶解;酶解3小时后，400化pm离屯、5min。 用渗透压稳定剂（〇.6mol/L甘露醇溶液）离屯、洗涂2次，加入SOOiiL电击缓冲液（甘露醇 0.6mol/L，肥阳S Immol/L)制成菌丝液，最后用血球计数板计数。每个处理设5个重复。
[0035] 4)转化:纯水冲洗电击杯，用无水乙醇浸泡1-化，超净工作台中放置化吹干。向电 击杯中加入IOOul的电击缓冲液和150ul的菌丝液，再加入20ul的双元载体PCAMBIA1301质 粒吹打混匀，放入冰中IOmin。用高压脉冲电击转化仪电击，电压为800V，冰上放置IOmin。恢 复培养，加入液体再生培养基Iml，摇床上培养化(32°C，170巧m)。
[0036] 5)电击法转化子的筛选:取IOOul转化处理后的草茹菌液涂布于无潮霉素的再生 PDA平板（马铃馨200g/L，葡萄糖20g/L，甘露醇0.6mol/L，琼脂1.5 % )上，放入32°C培养，一 周后，切取新生长的菌丝，转入20ug/ml潮霉素的再生PDA平板上，继续筛选。一周后，选取在 20ug/ml潮霉素的再生PDA平板上继续生长的菌块，转入20ug/ml潮霉素 PDA液体培养基中， 于32°C培养。能在液体培养基中生长的菌块认为是转化子。
[0037] 6)阳性转化子的分子鉴定:对能够在含有潮霉素的抗性平板上正常生长的菌丝体 进行培养，提取基因组D N A基因组，对其进行P C R分子检测（检测引物^5'- TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3-，R 5 --GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3- JCR扩增体系为20ul，10 X hq Buffer 化L，dNTPs Mixture(各 10mmol/L)0.化L,上下游引物（10皿ol/L)各0.化 (抓/化)0.化L，模板DNA 2化，d地2〇补至20化。PCR反应条件为：95°C预变性5min; 95 °C变性 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环;72°C延伸10min，4°Cforever)，成功扩增出外 源基因卡那基因则为阳性转化子，扩增结果参见图2。
[003引实施例2
[0039] 1)构建利用载体PCAMBIA1300上多克隆位点中的SacI和KpnI,将胡萝h中的抗冻基 因 AFP构建到双元载体PCAMBIA1300中形成重组载体PCAMBIA1300: :AFP，载体构建图谱如图 3所示。
[0040] 2)将菌种接种于IOOmL的液体PDA培养基中，32°C静置培养2天。
[0041] 3)酶解液配置方法同实施例1。培养好的菌丝，用二层灭菌的纱布过滤，然后用无 菌水冲洗S次。用无菌纸吸干水分后悬浮于适量已配制好的酶液中，32°C，IOOrpm振荡酶 解;酶解5小时后，200化pm离屯、IOmin。用渗透压稳定剂离屯、洗涂2次，加入5(K)化电击缓冲液 制成菌丝液，最后用血球计数板计数。每个处理设5个重复。
[0042] 4)转化:纯水冲洗电击杯，用无水乙醇浸泡1.化，超净工作台中放置化吹干。向电 击杯中加入1 OOul的电击缓冲液和150u 1的菌丝液，再加入20u 1质粒吹打混匀，放入冰中 lOmin。用高压脉冲电击转化仪电击，电压为800V，冰上放置lOmin。恢复培养，加入液体再生 培养基Iml，摇床上培养化(32°C，170巧m)。
[0043] 5)电击法转化子的筛选:取IOOul转化处理后的草茹菌液涂布于无潮霉素的再生 PDA平板上，放入32°C培养，一周后，切取新生长的菌丝，转入20ug/ml潮霉素的再生PDA平板 上，继续筛选。一周后，选取在20ug/ml潮霉素的再生PDA平板上继续生长的菌块，转入20ug/ ml潮霉素 PDA液体培养基中，于32°C培养。能在液体培养基中生长的菌块认为是转化子。
[0044] 6)阳性转化子的分子鉴定:对能够在含有潮霉素的抗性平板上正常生长的菌丝体 进行培养，提取基因组D N A基因组，对其进行P C R分子检测（检测引物^5'- TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3-，R 5 --GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3- JCR扩增体系为20ul，10 X hq Buffer 化L，dNTPs Mixture(各 10mmol/L)0.化L,上下游引物（10皿ol/L)各0.化 (抓/化)0.化L，模板DNA 2化，d地2〇补至20化。PCR反应条件为：95°C预变性5min; 95 °C变性 30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环;72°C延伸10min，4°Cforever)，成功扩增出外 源基因 AFP基因则为阳性转化子，扩增效果如图4所示。
[0045] 7)草茹转化子菌丝的低溫耐受比较试验:32°C培养阳性转化子，3天后转置4°C培 养箱，分别处理1，2，3，4，5，6，7，8，9，10天，培养后放置32 °C培养箱恢复培养，观测菌丝体的 生长情况，如图5所示。转化子比对照表现出较强的低溫耐受能力（表1)。对照在4 °C低溫胁 迫下仅能存活2d，而转化子能耐受3-6d的4°C低溫胁迫。
[0046] 表1不同转化子和对照在4°C低溫胁迫下的存活天数
【主权项】
1. 一种草燕电击法遗传转化方法，包括： (1) 测定草菇菌丝对潮霉素的最低耐受浓度； (2) 将草菇菌种接种于液体PDA培养基中，32°C静置培养3~5天，得到草菇菌丝;将草菇 菌丝过滤，溶壁酶酶液酶解，离心，加入电击缓冲液制成菌丝液； (3) 向电击杯中加入电击缓冲液和菌丝液，再加入外源重组载体质粒吹打混匀，放入冰 中静置；用高压脉冲电击转化仪电击，电压为800V，冰上静置;随后恢复培养，加入液体再生 PDA培养基，摇床培养1~2h; (4) 取经过步骤(3)转化处理后的菌丝液涂布于无潮霉素的再生TOA平板上，32°C培养， 切取新生长的菌丝，转入含有最低耐受浓度潮霉素的再生PDA平板上，进行筛选;选取能够 继续生长的菌块，转入含有最低耐受浓度潮霉素的液体HM培养基中，于32°C培养，得到转 化子;提取转化子基因组DNA基因组，进行PCR分子检测，成功扩增出外源基因则为阳性转化 子。2. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤（1)中 的最低耐受浓度选择范围为2.5~22.5ug/ml。3. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(2)中 的液体PDA培养基的组成为:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。4. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(2)中 的溶壁酶酶液的制备方法为:取0.03g溶壁酶，用0.6M甘露醇溶液溶解，定容至2mL，粗酶液 在3000r/min离心15min，取上清液经0.22μπι微孔滤膜过滤除菌后使用;酶解时间为3~5h。5. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(2)中 的离心具体为在2000~4000rpm下离心5~IOmin，然后用渗透压稳定剂离心洗涤2次。6. 根据权利要求5所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述渗透压稳定 剂为0.6mol/L甘露醇溶液。7. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(2)和 (3)中的电击缓冲液的组成为甘露醇0.6mol/L，HEPES lmmol/L。8. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(3)中 的液体再生PDA培养基的组成为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，甘露醇0.6mol/L。9. 根据权利要求1所述的一种草菇电击法遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(4)中 的再生PDA平板的组成为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，甘露醇0.6mol/L，琼脂1.5%。
【文档编号】C12N15/80GK105925600SQ201610369245
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】吕贝贝, 唐雪明, 蒋玮, 吴潇, 武国干, 王金斌, 李鹏, 白蓝, 刘华, 于海龙, 王荣谈, 孙斌, 张静芳
【申请人】上海市农业科学院, 上海瑞丰农业科技有限公司