专利名称：一种对变形链球菌电击转化方法
技术领域：
本发明涉及一种电击转化方法，具体地说关于一种对变形链球菌电击 转化方法。
背景技术：
龋病是危害人类口腔健康的主要疾病之一，在龋病的发生发展过程 中，口腔内常驻菌变形链球菌具有着极强的产酸耐酸能力而起着重要作 用。作为主要致龋菌，变形链球菌目前受到了广泛的重视与研究。通过
DNA重组技术向其导入外源性DNA片段以研究变形链球菌致病相关基 因已成为研究其致病机制的一个重要手段。
常见对变形链球菌的基因转化，是通过电穿孔转化方案进行，即利 用脉冲电场造成细胞壁的改变从而将外源DNA导入细胞内，但变形链球 菌作为革兰氏阳性球菌，由于有着致密的细胞壁而影响到了常规电击转化
的效率与可重复性。对于革兰氏阳性菌目前有研究报道采用甘氨酸的加入 作为胞壁弱化剂，从而增强转化效率。大量研究表明甘氨酸(glycine)的加 入对于细胞壁的削弱有显著的增强作用，因为甘氨酸可以置换胞壁脂双层 中肽间桥的丙胺酸(L-ZD- alanine)，通过这一置换干扰菌细胞对胞壁的合 成与修复，有利于维持电击转化后在胞壁上形成的通道而增强转化效率。
目前有研究报道培养菌细胞于含甘氨酸的培养基内可增强转化效率，但对 于不同实验菌抹，由于甘氨酸有着一定的细胞毒性，因此在甘氨酸的加入 时间与模式上仍有争议。
在对于变形链球菌的电击转化研究中，研究者们发现将变形链球菌 培养于含甘氨酸培养基内进行电击转化会引致大量菌细胞死亡，从而使得
转化的重复性不佳，推测可能正是由于甘氨酸本身具有的细胞毒性所致。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对变形链球菌电击转化方法。 本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明在变形链球菌菌 细胞生长达对数生长期后加入最适浓度的胞壁弱化剂甘氨酸，以获得最适 的胞壁弱化效果，而同时确保有足够量的活细胞成为感受态细胞，从而获 得最佳的转化效率。本发明的具体技术方案如下
一种对变形链球菌电击转化方法，包括以下步骤 a)提供变形链球菌UA159抹、外源性DNA、电转緩冲液； P)变形链J求菌感受态细胞的制备； (3)电击转化感受态细胞。
其中，步骤(2)中变形链球菌接种至BHI培养基内，于37。C摇床孵育
至吸光度OD660nm-0.5,加入甘氨酸溶液。甘氨酸溶液浓度为8%_12%。甘
氨酸溶液优选浓度为10°/。。步骤(l)中外源性DNA是pGL3 basic质粒。 步骤(1)中电转緩沖液EPB配制如下5mM磷酸钾，0.4M山梨醇，10% 甘油，调节pH至4.5， 4"C下保存，使用时冰浴中预冷。步骤(3)中电转条件1.6KV, 25^F。
本发明所公开一种对变形链球菌电击转化方法，其优点表现在通过 在达到菌细胞对数生长期后加入胞壁弱化剂甘氨酸，以克服甘氨酸对细胞 的毒性作用，并筛选出了甘氨酸的最适加入浓度，显著增强了对变形链球 菌的电击转化效率与可重复性。是对变形链球菌进行基因转化的研究的有 效手段，可用于对变形链球菌致龋机制的研究。
图1显示不同终浓度甘氨酸对于变形链球菌电击转化效率的影响， *表示实验组与对照组相比有统计学意义(P<0. 05)
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。 实施例1
1.实验菌纟朱，质粒与试剂配制
实验采用变形链球菌UA159抹(从武汉大学口腔医学院购买)，以具 有氨苄青霉素抗性的pGL3 basic质粒(pGL3 basic质粒购自美国Thermo Fisher Scientific, Inc.公司)作为转化的外源性DNA。
电转緩冲液(EPB)酉己制如下5mM磷酸钾(potassium phosphate), 0.4M 山梨醇(sorbitol), 10%甘油(glycerol),调节pH至4.5, 4。C下保存，使用
时冰浴中预冷。
2. 变形链球菌感受态细胞的制备
挑取单菌落接种至BHI培养基内，于37。C摇床孵育至吸光度OD660nm =0.5，加入终浓度为10%的甘氨酸溶液，继续于37。C孵育lhr。培养液 置水浴预冷15min后，于4。C下3000rpm离心15min，收集沉淀之菌细胞。 以预冷之电转緩沖液EPB( 5mM磷酸钾，0.4M山梨醇，10%甘油，pH 4.5 ) 洗涤沉淀两次，于4。C下3000rpm离心15min，收集菌细胞。以EPB緩冲 液IOO倍浓缩菌细胞配制成电转感受态细胞悬液，液氮速冻后冻存于 -70。C待用。
3. 电击转化感受态细胞
电击转化前取出5(HU感受态细胞于冰浴中解冻，加入1吗质粒DNA, 充分混匀后加入至预冷的无菌电转杯中。采用1.6KV, 200Q， 25pF的电 转条件。电击完毕后，加入lml含0.4M山梨醇(sorbitol)的BHI培养基， 于37。C低速摇床复苏2hr后，4。C下3000rpm离心5min，取150(il悬液均 匀涂布于含1(Vg/ml的Bffl琼脂培养基上，37"C孵育10hr后筛选阳性克 隆。
实施例2
不同终浓度甘氨酸对于变形链球菌电击转化效率影响的实验 实验采用变形链球菌UA159抹(从武汉大学口腔医学院购买)，以具 有氨苄青霉素抗性的pGL3 basic质粒(pGL3 basic质粒购自美国Thermo Fisher Scientific, Inc.公司)作为转化的外源性DNA。
电转緩沖液(EPB)配制如下5mM磷酸钟(potassium phosphate), 0.4M 山梨醇(sorbitol), 10。/。甘油(glycero1)，调节pH至4.5， 4。C下保存，使用 时冰浴中预冷。
变形链球菌感受态细胞的制备挑取单菌落接种至BHI培养基内，
于37。C摇床孵育至吸光度OD66Qnm-0.5，加入不同浓度的甘氨酸溶液(0，
2%, 5%， 10%, 20% ),继续于37。C孵育lhr。培养液置水浴预冷15min后， 于4。C下3000rpm离心15min,收集沉淀之菌细胞。以预冷之电转緩沖液 EPB (5mM磷酸钾，0.4M山梨醇，10%甘油，pH 4.5 )洗涤沉淀两次， 于4。C下3000rpm离心15min,收集菌细胞。以EPB緩沖液100倍浓缩菌 细胞配制成电转感受态细胞悬液，液氮速冻后冻存于-7(TC待用。
电击转化感受态细胞电击转化前取出50pl感受态细胞于水浴中解 冻，加入l吗质粒DNA，充分混匀后加入至预冷的无菌电转杯中。采用 1.6KV， 200。， 25pF的电转条件。电击完毕后，迅速加入冰冷的lml含 0.4M山梨醇(sorbitol)的BHI培养基，于37。C低速摇床复苏2hr后，4。C下 3000rpm离心5min,取150^1悬液均匀涂布于含10pg/ml氨苄青霉素的 BHI琼脂培养基上，37。C孵育10hr后筛选阳性克隆。
对不同终浓度甘氨酸孵育后的感受态细胞进行电击转化后，比较各组 转化克隆的菌落数，研究数据采用SPSS 10.0统计软件分析，选用单因素 方差分析的DunneU双侧检验，在a=0.05的情况下比较各实验组与对照 组之间差异有无统计学意义。结果见图1，可见与对照組相比仅10%甘氨 酸(P〈0.05)与20。/。甘氨酸(PO.05)孵育组转化率明显升高，但这两个浓度
组间并无显著差异(PX).05)。而考虑到甘氨酸本身的细胞毒性，因此推荐 使用10%浓度的甘氨酸作为胞壁弱化剂的最适浓度。
权利要求
1. 一种对变形链球菌电击转化方法，包括以下步骤(1)提供变形链球菌UA159株、外源性DNA、电转缓冲液；(2)变形链球菌感受态细胞的制备；(3)电击转化感受态细胞。
2、 根据权利要求1所述的电击转化方法，其特征在于步骤(2)中变 形链球菌接种至BHI培养基内，于37。C摇床孵育至吸光度OD660nm = 0.5，力口 入甘氨酸;容液。
3、 根据权利要求2所述的电击转化方法，其特征在于甘氨酸溶液浓 度为8%-12%。
4、 根据权利要求3所述的电击转化方法，其特征在于甘氨酸溶液浓 度为10%。
5、 根据权利要求1所述的电击转化方法，其特征在于步骤(l)中外 源性DNA是pGL3 basic质粒。
6、 根据权利要求1所述的电击转化方法，其特征在于步骤(l)中电 转緩冲液EPB配制如下5mM磷酸钾，0.4M山梨醇，10%甘油，调节pH 至4.5, 4X:下保存，使用时水浴中预冷。
7、 根据权利要求1所述的电击转化方法，其特征在于步骤(3)中电 转条件1.6KV， 200Q， 25pF。
全文摘要
本发明涉及一种电击转化方法，具体地说关于一种对变形链球菌电击转化方法。该电击转化方法，包括以下步骤(1)提供变形链球菌UA159株、外源性DNA、电转缓冲液；(2)变形链球菌感受态细胞的制备；(3)电击转化感受态细胞。其中，步骤(2)中变形链球菌接种至BHI培养基内，于37℃摇床孵育至吸光度OD<sub>660nm</sub>＝0.5，加入10％甘氨酸溶液。本发明所公开一种对变形链球菌电击转化方法，其优点表现在显著增强了对变形链球菌的电击转化效率与可重复性。是对变形链球菌进行基因转化的研究的有效手段，可用于对变形链球菌致龋机制的研究。
文档编号C12N15/87GK101205546SQ20061014774
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者正 刘, 黄正蔚 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院