抗日本血吸虫药物作用靶标、药物筛选方法及药物先导化合物的制作方法

专利名称：：抗日本血吸虫药物作用靶标、药物筛选方法及药物先导化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物信息学和药理学技术筛选药物，具体涉及抗日本血吸虫药物作用靶标及用此靶标筛选抗血吸虫药物的方法。
背景技术：
：化疗是控制血吸虫病患病率的重要措施之一。自高效低毒的抗血吸虫药物吡喹酮广泛应用以来，血吸虫病的化疗有了突破性进展，实施周期性群体化疗已成为血吸虫病控制的重要手段[1'3，4]。然而，目前对五种感染人体的血吸虫均有效的药物仅吡喹酮一种，长期反复使用同一化学药物控制寄生虫感染，有可能导致抗药性的产生。最近，有报道显示在实验室已成功地用吡喹酮诱导曼氏血吸虫产生了抗性，埃及和塞内加尔的现场研究也显示了吡喹酮的极低治愈率，提示似乎已产生吡喹酮抗性[2'5]。虽然到目前为止动物实验尚未发现吡喹酮诱导日本血吸虫产生抗性，但是研究抗性产生机理和应对策略，以及积极研制新型的后备药物势在必行。此外，吡喹酮是一个对血吸虫成虫有效而对童虫无效的治疗药物，虽可降低人群的感染率，但不能防止重复感染。我国在七十年代末和八十年代初发现青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯具有抗血吸虫的作用，该类药物对各个虫期的血吸虫均有一定效果，特别是对血吸虫童虫有很强的杀灭作用，己于二十世纪末被发展成为预防血吸虫病的药物[5'6'7'8。蒿甲醚和青蒿琥酯的问世为血吸虫病的早期治疗提供了条件，但杀成虫的效果不佳。因此，WHO/TDR于2002年提出要发展一个治疗血吸虫病(抗血吸虫成虫)的新药，而且最好是既具有杀灭成虫又有杀童虫的效果的新药。目前，虽然国内外已有部分实验室开始进行抗血吸虫新药的研究，但尚无理想的二线侯选药物的报道。有多种原因制约了抗血吸虫新药的研制，其中包括现有抗血吸虫药物的作用靶点仍然不明确，药物杀虫的分子机制仍不清楚，传统的药物筛选方法不适合于高通量的新药筛选等[9'1()'11]。因此，专家认为抗日本血吸虫新药的研究需要技术创新，新的药物靶点的发掘将有助于抗日本血吸虫新药的开发。药物作用靶标包括受体、酶、转运蛋白、DNA、RNA等。在基因组时代，药物研究首先将是药物靶标的鉴定与确证，随后以药物作用靶标为基础，筛选或设计与靶标结构互补结合从而激活或抑制靶标介导的生理生化过程，具有治疗作用的药物先导化合物。这种基于药物作用靶标的结构的新药发现和设计技术，将有助于高效、快速地进行新药研究，并且有助于提高药物作用的特异性。现有研究显示，血吸虫的嘌呤代谢和终宿主存在明显差异。据研究，血吸虫不能利用简单化合物从头合成嘌呤核苷，而只能利用已形成的内源性和/或外源性嘌呤为原料通过补救途径合成嘌呤核苷[12'13];而且由于血吸虫与其终宿主在种系发生上存在的巨大差异，血吸虫嘌呤补救途径中的某些酶可能与终宿主存在着明显差别，利用这个特点可以设计针对血吸虫某些酶的特异性抑制剂或破坏性底物(subversivesubstrates)，发现在日本血吸虫中存在一个ADSS的同源序列。将该序列作为提问序列，对Pfam数据库进行结构域搜索，证实其第9到第430位氨基酸存在一个腺苷酸基琥珀酸合成结构域(adenylsucc—syntdomain)。因此，将该蛋白序列命名为SjADSS。已有研究将疟原虫的ADSS克隆表达和鉴定[21，并报道了其晶体结构[2()]，认为ADSS作为疟原虫嘌吟补救途径的关键酶之一。然而，在日本血吸虫的研究中，尚未见日本血吸虫ADSS可能成为潜在的抗日本血吸虫药物靶点的报道，更未见用其筛选新的抗血吸虫药物的报道。本发明者对日本血吸虫SjADSS的基因表达产物进行了深入的生物信息学分析，发现SjADSS是日本血吸虫嘌呤补救合成途径的关键酶。然后根据这一代谢途径筛选化合物，并进行虫体水平的测试，确证SjADSS是抗日本血吸虫药物作用耙标，用这一药物作用靶标筛选治疗和/或预防日本血吸虫药物，从而完成本发明。本发明的第一个目的是提供一种快速筛选治疗和/或预防日本血吸虫感染药物的药物作用靶标。本发明的第二个目的是提供这种药物作用耙标的构建方法。本发明的第三个目的是提供用这种药物靶标筛选治疗和/或预防日本血吸虫感染药物的方法。本发明的第四个目的是提供用这种药物作用靶标筛选出的治疗和/或预防日本血吸虫感染的药物先导化合物及其应用。发明概述本发明提供一种用于筛选治疗和/或预防日本血吸虫感染药物的药物作用耙标，所述靶标为日本血吸虫嘌呤代谢途径的关键酶一腺苷琥珀酸合成酶，其蛋白序列特征为:FPLH卿DRMEEELRGLNLLGTTKKGIGPAYSSKVTRNGLRVCDLIGDWDQFTAKYKELVNYVKRRYPALE雨EESLEQLKTYREMLSGMVCDSVLLINKLTESKQTKILVEGAQSCMLDIDFGTYPHVTSSNCSIGGVCTGLGLSPSRVGSVYGVIKAYTTRVGSGPFPTELLDGIGEYIQKKGNEWGVTTKRMRRIGWLDTVVIRYAHIINDFNALALTKIDVLDGLKEVKIARAYVDPETGNELSSFPADPFILSRVVVIYETLPGWKASTQNCRVYDELPPAAKTFIETVEKLLNIPIRWIGTGASRDSIIIRSV(序列表中的序列1)，所述的蛋白序列与IMP结合的功能区域序列编号为133LGTTKKGIGPAYSSKVTRNGLRVCDL158(序列表中的序列2)。本发明还提供筛选治疗和/或预防日本血吸虫感染药物的药物作用靶标的构建方法，包括以下步骤1)对SjADSS涉及的代谢途径进行生物信息学分析，揭示SjADSS是日本血吸虫的嘌呤补救途径的关键酶；2)用同源模建的方法构建SjADSS蛋白与底物分子IMP的三维复合结构，用分子模拟方法计算SjADSS蛋白与底物IMP的相互作用，确定SjADSS蛋白与底物IMP分子相互作用的区域。本发明的构建方法还包括用计算机虚拟筛选方法，针对SjADSS蛋白与IMP相互结合的区域，搜寻化合物数据库，找到阻止SjADSS和底物IMP结合的化合物，确证药物作用靶标的建立。本发明进一步提供用所述药物作用靶标筛选治疗和/或预防日本血吸虫感染药物的方法，包括如下步骤1)第一轮筛选采用并行版的Dock4.0对SPECS化合物库进行筛选，从ADSS/IMP复合物结构出发，确定一个含38个球的模型作为最终Dock筛选模型，保留能量打分最好的分子；2)第二轮筛选利用改良Lipinski法对步骤1)所得分子进行分子类药性的评价；采用FlexX分子对接程序，同时选择Sybyl6.8中C-score模块进行一致性打分；3)第三轮筛选采用上述同样的方法和模板模建人ADSS的结构，采用FlexX产生构象。将步骤3)筛选出的化合物针对人和日本血吸虫两个不同的耙标用AUTODOCK3.0进行自由能打分，测试筛选出对SjADSS结合自由能打分低而对HsADSS结合自由能打分高的化合物。以上第三轮筛选得到的化合物再通过体外抗血吸虫活性测试加以确证。本发明进一步提供用这种药物作用靶标筛选出的如下式a和式b化合物在制备治疗和/或预防日本血吸虫感染药物上的应用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>根据活性化合物结合构象、活性位点的分析进行结构改造，得到如下通式I所示化合物及其药学上可接受的盐或溶剂合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中，X、Y=CH2、NR、O、S;R,=(C,-C6)烷基、OR、NHR、齒素、CN、H;R2、R3、R4=烷基、取代芳基、取代杂芳基，其中所述R3、R4可和与其相连的氮原子连接形成五元或六元杂环。本发明进一步提供如通式I所示化合物在制备治疗和/或预防日本血吸虫感染药物上的应用。发明详述本发明者运用生物信息学方法对日本血吸虫转录组研究中发现的日本血吸虫蛋白序列SJCHGC05894进行了分析，发现其第9到第430位氨基酸存在一个腺苷酸基琥珀酸合成结构域(adenylsucc—syntdomain),证实该蛋白序列为日本血吸虫腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinatesynthase,SjADSS，EC:6.3.4.4)。随后的代谢途径分析表明SjADSS是日本血吸虫嘌呤补救合成途径的关键酶。本发明用同源模建方法构建了SjADSS蛋白的三维结构，用分子模拟方法计算了SjADSS蛋白与底物IMP的相互作用，构建了SjADSS蛋白与IMP复合物的结构，获得了SjADSS与IMP相互作用的区域；针对该区域，用计算机虚拟筛选方法搜寻了化合物数据库，发现了22个化合物可抑制IMP与SjADSS蛋白结合，而对IMP与人ADSS的结合影响较小；在体外培养的日本血吸虫虫体水平测试了这些化合物的抗血吸虫活性，确证了这一日本血吸虫耙标，并建立了相应的筛选方法。1、生物信息学分析和SjADSS蛋白与IMP复合物结构模拟在日本血吸虫中存在一个ADSS的同源序列SJCHGC05894。将SJCHGC05894作为提问序列，对Pfam数据库进行结构域搜索，证实SJCHGC05894的第9到第430位氨基酸存在一个腺苷酸基琥珀酸合成结构域(adenylsucc—syntdomain)。因此，将SJCHGC05894命名为SjADSS。以SjADSS蛋白序列为提问序列，用PSI-BLAST对Swissprot蛋白序列库进行搜索。按照同源性的高低及蛋白的性质，选取了MOUSE-MUSCLE腺嘌呤琥珀酸合成酶(PDB号为1IWE)为模板进行结构模建。先利用InsightII(Version2000)/Homology模块中的多重联配的方法进行序列联配，然后经过手动调节得到合理的序列联配，在联配的基础上，采用Insight11/Homology中的模块进行结构的构建。随后采用InsightlI/Homok)gy模块中的refme菜单进行结构优化。首先对lo叩区进行能量优化，然后放开限制，进行整体优化。对于得到的结构，采用不同的评价方法进行了评价。PROCHECK方法主要是评价键长、键角和二面角是否合理；Profile3D方法是对三维结构与一级序列的相容性打分，结果给出每个残基的打分数值，从而评价结构的优劣。最后通过在图形工作站上比较和检测结合口袋部位的结构，最终确定一个模型。2、SjADSS蛋白与IMP相互作用活性位点由SjADSS蛋白与IMP复合物三维结构模型，可以获得SjADSS蛋白与底物IMP相互作用活性位点的信息。3、针对SjADSS与IMP底物复合物的虚拟筛选获得比较合理的靶标蛋白结构以后，就可以进行虚拟筛选。本发明者对约ll万个小分子的SPECS化合物库进行了虚拟筛选。首先采用并行版的Dock4.0对SPECS化合物库进行了第一轮筛选。本发明者从SjADSS/IMP复合物结构出发，结合位点的分子表面用Dock4.0内的AutoMS产生，再用Sphgen程序产生描述活性位点的球集，对口袋部位的分子表面的位点进行聚类，确定口袋部位的球集，分子对接程序利用这些球集加快对接时小分子与大分子活性部位的匹配速度。最后产生一个空间盒子将这一球集包含进去，确定grid程序的计算范围，对口袋部位进行grid计算，计算盒子内静电作用和范德华作用能的网格文件。经过对模型的验证，最终确定一个含38个球的模型作为最终Dock筛选模型。保留能量打分最好的10,000个分子进入第二轮筛选。第二轮筛选主要是进行分子类药性的评价。这个方法是在Lipinski的五规则基础上发展起来的，综合了考虑了分子量、疏水性、氢键受体、氢键供体、柔性键和环化度等方面。通过这轮筛选后，有3329个小分子进入下一轮。用于第三轮分子对接的程序是FlexX。Dock能量打分函数只包括了静电相互作用和范德华相互作用两项，FlexX考虑了配体与受体结合时，配体的内旋转键被冻结而引起的结合自由能的变化和氢键作用能对结合自由能的贡献，因此两者可以互为补充。此外，本发明者还选择Sybyl6.8中C-score模块进行一致性(Consensus)打分，该方法采用五种打分函数(Chem—score、D—score、F—score、G—score和PMF—score)来评价配体对活性口袋的亲合性，最高分为5分，对接的结果只取打分为5和4的化合物。最后，本发明者和经验丰富的药物化学研究人员一起挑选出了87个化合物。为了进一步设计具有高选择性的SjADSS抑制剂，本发明者用上述同样的方法和模板模建了人ADSS的结构，采用FLEXX产生构象。将这87个化合物针对两个不同的靶标进一步用AUTODOCK3.0进行自由能打分。通过比较这87个化合物对这两个靶标的差异，本发明者最终挑选了对血吸虫ADSS结合自由能打分低而对人ADSS结合自由能打分高的化合物。4、获选化合物抗血吸虫活性测试为验证上述获选化合物的抗血吸虫活性，本发明选用体外培养日本血吸虫成虫进行虫体水平的抗血吸虫活性测试。测试原理日本血吸虫在体外培养一周左右，加入受测化合物共培养，通过与阳性药物比较对血吸虫的活动能力、形态、生理活动产生的影响，判别受测化合物是否具有抗血吸虫活性。测试方法收取释放的日本血吸虫尾呦，采用腹部感染的方法，每只小鼠感染数百头尾蚴，经尾蚴感染一个多月的小鼠采用剪断颈动脉放血的方法处死，然后利用冰冷的HBSS平衡液经胸主动脉灌注，收集成虫。受测试的样品均采用DMSO溶解，配制成原药液，将衡氏盐平衡液配制成含热灭活的小牛血清、青霉素、琏霉素的培养基。在24孔培养板中加入现配的培养基，然后，将充分洗净的合抱虫体置入培养板，每孔两对虫。将板置于含C02培养箱中培养。待虫体稳定后，将受测化合物按不同的浓度梯度加入培养板的孔中。加药前要从培养基中吸取出相应的加药体积，以确保每孔的终体积保持不变。每块板均需设置空白对照，包括纯培养基空白对照以及含用药孔的最大剂量的DMSO对照。于倒置显微镜下观察虫体的活动能力及形态生理结构上的变化。5、抗血吸虫活性化合物的优化为获得活性更高的抗血吸虫活性化合物，以上述经过试验验证获得的活性化合物为基础，基于SjADSS结合口袋的结构和性质，对活性化合物结构进行改造和优化。改造流程为确定活性化合物结合构象；活性位点分析；结构改造；衍生物吸收、分布性质预测。本发明者首先采用AutoDock将式a所示化合物(编号为AN-988/40788227)与SjADSS进行自动对接，从而确定AutoDock对接构象为化合物改造的初始构象。然后采用Cerius2软件包的STRBASEDFOCUSING模块对SjADSS的口袋进行活性口袋分析(ActiveSiteAnalysis,ASA)，分析结果包含三个部分配体疏水作用优势区、配体氢键供体优势区、配体氢键受体优势区。根据这些区域与起始结构的相对位置，本发明者主要依据配体氢键受体优势区对初始结构进行了改造，在这些区域分别引入羟基以增强化合物与SjADSS之间的相互作用，得到7个活性化合物衍生物。采用AutoDock对衍生物进行对接，发现对接构象与初始构象基本一致，引入的羟基与口袋氨基酸形成了更多的氢键，预测结合自由能有一定降低，达到了提高活性的目的。最后采用PreADMET(http:〃preadmet.bmdrc.org/preadmet/)网络服务计算衍生物的吸收和分布性质。如上所述，本发明的一个方面是通过生物信息分析，鉴定了日本血吸虫的腺苷琥珀酸合成酶SjADSS。根据小鼠ADSS与底物IMP复合物的晶体结构，模建了日本血吸虫SjADSS蛋白与IMP复合物的三维结构模型。SjADSS作为日本血吸虫嘌呤补救合成途径的关键酶，可以和IMP形成复合物催化IMP生成AMP，据此可以利用SjADSS为靶标筛选其抑制剂作为筛选抗血吸虫药物的方法。按一般药物靶标确证的原则，必须根据假设的靶标筛选出活性化合物。于是，本发明针对SjADSS与IMP相互作用的结合口袋，用虚拟筛选的方法筛选了Specs公司的化合物数据库，获得了一批与SjADSS具有较强亲和力而与人的ADSS亲和力较低的获选化合物，本发明继而对这些获选化合物进行虫体水平的体外抗血吸虫活性测试，发现有两个化合物具有明显的抗血吸虫活性，呈现良好的剂量关系。为了进一步获得具有良好抗血吸虫活性的药物先导化合物，本发明对获得的活性化合物进行了优化，合成了一系列活性化合物衍生物，并进行虫体水平的体外抗血吸虫活性测试。根据以上生物信息学分析、代谢途径分析、分子模拟、虚拟筛选和虫体水平的抗血吸虫活性测试，本发明确定日本血吸虫腺苷琥珀酸合成酶SjADSS蛋白及其与底物IMP的相互作用是治疗和/或预防日本血吸虫感染的药物作用靶标。本发明另一方面设计根据确定的药物作用靶标SjADSS蛋白与底物IMP的相互作用，采用分子模拟方法建立了SjADSS蛋白与IMP结合的复合物三维结构模型，确定了SjADSS蛋白与IMP相互结合的关键部位和氨基酸残基。在此基础上，用虚拟筛选方法获得了能阻断SjADSS蛋白与IMP结合的候选物，经虫体水平的抗血吸虫活性测试，筛选出靶标生物功能抑制剂。靶标生物功能抑制剂为与靶标SjADSS蛋白与底物IMP结合功能区域相互结合、并阻断所述SjADSS蛋白与底物IMP结合的化合物，它们可以是小分子有机化合物、多肽化合物或寡糖化合物或核苷类化合物或单克隆抗体。本发明者根据靶标筛选出来的化合物进行结构改造，获得了如下通式I的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中，X、Y=CH2、NR、0、S;Rj=烷基、OR、NHR、卤素、CN;R2、R3、R4=烷基、取代芳基、取代杂芳基，其中所述R3、R4可和与其相连的氮原子连接形成五元或六元杂环。通式I化合物可制成其药学上可接受的盐或溶剂合物。其药学上可接受的盐的例子包括(但不限于)通式(I)化合物与无机碱如选自碱金属(钠、钾或锂)、碱土金属(如钙或镁)的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐。还包括与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)或与有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、马来酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、双羟萘酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸)形成的酸加成盐。优选硫酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、盐酸盐等。其药学上可接受的溶剂合物的例子包括(但不限于)通式(I)化合物与水、乙醇、丙二醇等形成的溶剂合物。其中优选的是通式(I)化合物的一水合物，本发明者通过实验发现，通式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物可以有效地抑制SjADSS蛋白与底物IMP的结合，具有较明显的抑制体外培养的日本血吸虫的活性，因此，具有治疗和/或预防日本血吸虫感染的用途。图1显示SjADSS的多序列联配结果。图2显示SjADSS与作为同源模建模板的小鼠ADSS的序列联配结果。图3为Ramachandran图，评价键长、键角和二面角是否合理的模型评价的结果。图4显示同源建模所得日本血吸虫ADSS蛋白三维结构。图5显示与日本血吸虫蛋白特异结合的小分子化合物虚拟筛选的流程。具体实施方案下面用实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。实施例1:SjADSS蛋白序列的多重比对SjADSS蛋白序列为顧KGIERSVSWLGAQWGDEGKGKLVDLLSESSTVVCRCQGG丽AGHTVVAGGKEYFFHLLPSGI證NVLAIIGNGVVVNLEALFOEINEAVNKGLLDVASRLRJSDRCHLVFPLHQEIDRMEEELRGLNLLGTTKKGIGPAYSSKVTRNGLRVCDLIGDWDQFTAKYKELVNYVKRRYPALE雨EESLEQLKTYREMLSGMVCDSVLL皿LTESKQTKILVEGAQSCMLDIDFGTYPHVTSSNCSIGGVCTGLGLSPSRVGSVYGVIKAYTTRVGSGPFPTELLDGIGEYIGKKGNEWGVTTKRMRRIGWLDTWIRYAHIINDFNALALTKIDVLDGLKEVKIARAYVDPETGNELSSFPADPFILSRVVVIYETLPGWKASTQNCRVYDELPPAAKTFIETVEKLLNIPIRWIGTGASRDSIIIRSV从NCBI中选取如下物种的ADSS蛋白序列，包括大肠杆菌(ACCESSION:P0A7D4)、酵母(ACCESSION:P0A7D4)、症原虫(ACCESSION:AAF06822)、果蝇(ACCESSION:NP_650918)、小鼠(ACCESSION:1MF1A)、人(ACCESSION:NP—001117)、日本血吸虫(SJCHGC05894,ACCESSION:AAW27751)、曼氏血吸虫(C605888.1),采用ClustalX进行多序列联配分析。图1是ADSS多序列比对的结果。其中，方框分别显示磷酸结合环状结构、IMP结合位点和鸟嘌呤特异性结合区域；空心箭头所指为一个单体与形成二聚体有关的赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R);黑色箭头所指为对应单体上的的天冬氨酸(Asp，D);黑色星号所示为IMP上的5，磷酰基与ADSS同型二聚体的一个单体接触的Thrl41、Asn51、Thr247;空心星号所示为对称单体上的Argl55。多序列联配分析显示SjADSS含有推定的GTP结合位点的氨基酸残基，表明该蛋白存在一个鸟嘌呤特异性结合区域TKID((N/T/Q)KXD)、一个IMP结合位点，并且在其N端有一个富含甘氨酸的与磷酸结合的环状结构GDEGKGK(GXXXXGK)[19]。此外，已知ADSS是一种同型二聚体，本研究在SjADSS蛋白氨基酸序列上发现其具有两个单体ADSS发生相互作用所必须的氨基酸残基，即空心箭头所指的两个氨基酸赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)和另一个对应单体上的的天冬氨酸(Asp，D)(黑色箭头所指)发生相互作用[19]。ADSS与IMP的结合主要是通过与IMP的5'磷酰基接触而完成，在疟原虫中，5，磷酰基与ADSS同型二聚体一个单体上的Thrl41、Asn51、Thr247接触(黑色星号所示)，同时和对称单体上的Argl55接触(空心星号所示)[2()；日本血吸虫ADSS也具有这四个氨基酸残基。实施例2:SjADSS蛋白与底物IMP复合物构建以SjADSS蛋白序列为提问序列，用PSI-BLAST对Swissprot蛋白序列库进行搜索，按照同源性的高低及蛋白的性质，选取MOUSE-MUSCLE腺嘌呤琥珀酸合成酶(PDB号为1IWE)为模板进行下一步结构模建。首先利用InsightII(Version2000)/Homology模块中的多重联配的方法对SjADSS与MOUSE-MUSCLE腺嘌呤琥珀酸合成酶进行序列联配，然后经过手动调节得到合理的序列联配，结果如图2所示。结果显示SjADSS蛋白与模板蛋白的序列一致性为55X。在联配的基础上，采用InsightlI/Homology中的模块进行结构的构建。构建产生的结构通常会有一些不合理的原子间碰撞，因此必须对结构进行能量优化。我们采用InsightlI/Homology模块中的refine菜单进行结构优化。首先对loop区进行能量优化，此时对结构保守区的主链原子加上一个简谐限制以避免它们有较大的结构偏离；然后放开限制，进行整体优化。对于得到的结构，采用不同的方法进行评价。PROCHECK方法主要是评价键长、键角和二面角是否合理，其结果以Ramachandran图(图3)的形式给出。数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>最优区域的碱基数字较大，是结构合理的一个必要条件，在本例中此项残基含量为87.2%，这个含量是可以接受的。不被允许区域的残基数字较小，这也是结构合理的一个必要条件，在本例中此项残基含量为零，这个含量是非常好的。Profile3D方法是对三维结构与一级序列的相容性打分，结果给出每个残基的打分数值，从而评价结构的优劣。对得到的结果，通过在图形工作站上比较和检测结合口袋部位的结构，最终确定一个模型，如图4所示。实施例3:SjADSS蛋白与IMP相互作用活性位点由SjADSS蛋白与IMP复合物三维结构模型，可以获得SjADSS蛋白与底物IMP相互作用活性位点的信息。SjADSS的底物结合口袋呈狭长的凹槽形状，分为两个部分，即IMP结合口袋和GTP结合口袋。在SjADSS口袋中，IMP的5'磷酰与Thr136、Asn44、Thr244侧链形成氢键，IMP嘌呤环上的Nl也与Aspl9侧链羧基形成一个氢键，使IMP与酶很好地结合在一起。同时，IMP嘌呤环与Val278侧链碳原子之间有较强的疏水相互作用。蛋白底物间形成的氢键和疏水相互作用分别列于表1和表2。表l氢键供体、氢键受体及两者间距离<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例4:阻止SjADSS蛋白与底物IMP相互作用化合物的虚拟筛选本发明者对约11万个小分子的SPECS化合物库进行了虚拟筛选，筛选流程如图5。首先采用并行版的Dock4.0对SPECS化合物库进行了第一轮筛选。本发明者从SjADSS/IMP复合物结构出发，结合位点的分子表面用Dock4.0内的AutoMS产生，再用sphgen程序产生描述活性位点的球集，对口袋部位的分子表面的位点进行聚类，确定口袋部位的球集，分子对接程序利用这些球集加快对接时小分子与大分子活性部位的匹配速度。最后产生一个空间盒子将这一球集包含进去，确定grid程序的计算范围，对口袋部位进行grid计算，计算盒子内静电作用和范德华作用能的网格文件。经过对模型的验证，最终确定一个含38个球的模型作为最终Dock筛选模型。保留能量打分最好的10，000个分子进入第二轮筛选。第二轮筛选主要是进行分子类药性的评价。这个方法是在Lipinski的五规则基础上发展起来的，综合了考虑了分子量、疏水性、氢键受体、氢键供体、柔性键和环化度等方面。通过这轮筛选后，有3329个小分子进入下一轮。用于第三轮分子对接的程序是FlexX。Dock能量打分函数只包括了静电相互作用和范德华相互作用两项，FlexX考虑了配体与受体结合时，配体的内旋转键被冻结而引起的结合自由能的变化和氢键作用能对结合自由能的贡献，因此两者可以互为补充。此外，本发明者还选择Syby16.8中C-score模块进行一致性(Consensus)打分，该方法采用五种打分函数(Chem—score、D—score、F—score、G—score禾BPMF—score)来评价配体对活性口袋的亲合性，最高分为5分，对接的结果只取打分为5和4的化合物。最后，本发明者和经验丰富的药物化学研究人员一起挑选出了87个化合物。为了进一步设计具有高选择性的SjADSS抑制剂，本发明者用上述同样的方法和模板模建了人ADSS的结构，采用FLEXX产生构象。将这87个化合物针对两个不同的靶标进一步用AUTODOCK3.0进行自由能打分。通过比较这87个化合物对这两个靶标的差异，本发明者最终挑选了22个对血吸虫ADSS结合自由能打分低而对人ADSS结合自由能打分高的化合物。实施例5:获选化合物的体外抗血吸虫活性测试1.材料1)日本血吸虫尾蚴安徽株，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供;2)昆明鼠体重在18—22g之间，由上海实验动物中心提供。2.活性测试步骤1)将小鼠用橡皮筋固定于木板上，然后用电剃刀将其腹部毛剔净。采用腹部感染的方法，每只鼠感染80—100头尾蚴。收虫时将经尾蚴感染32—38天的小鼠采用剪断颈动脉放血的方法处死，然后利用冰冷的HBSS平衡液经胸主动脉灌注，收集成虫。2)从Specs公司购买实施例3挑选的22个化合物中的19个，将受试的小分子化合物样品，均采用DMSO溶解，配制成浓度为5mg/ml的原药液，备用。3)成虫的体外培养将pH为7.2~7.4间的衡氏盐平衡液配制成含20%热灭活的小牛血清，300iu/ml青霉素，300iu/ml琏霉素以及0.25mg/mL的培养基。在24孔培养板中加入现配的培养基，按2mL/孔，然后，将充分洗净的合抱虫体置入培养板，每孔两对虫。将板置于含5%(:02培养箱中培养。培养30分钟，待虫体稳定后，将受测化合物按不同的浓度梯度加入培养板的孔中。加药前要从培养基中吸取出相应的的加药体积，以确保每孔的终体积为2mL。每块板均需设置空白对照，包括纯培养基空白对照以及含用药孔的最大剂量的DMSO对照。4)药效观察分别在加药后4、12、24、48和72小时，于倒置显微镜下观察虫体的活动能力以及形态生理结构上的变化。5)经体外72小时连续用药培养发现，受试的19个化合物中，大部分化合物对虫体的生存以及生理形态并无显著影响，而其中两个，其Specs编号分别AN-988/40788227(式a)和AN-988/15131257(式b)，其结构如下所示，效果明显。AN-988/40788227AN-988/15131257对于上述两个化合物，在加药后的4h内，虫体不论是在形态结构还是活动能力上均与对照组的相差无几。然而在12h后，用药组虫体的体表首先出现变化，主要表现为有细小空泡出现，且其活动能力减弱，活动僵直，不能灵活自如。在12-24h的时间段内，虫体的形态结构开始发生显著变化。突出表现在虫体表面出现大面积的空泡以及严重的皮损，此时的雄虫往往表现为收縮，局部肿胀等，而相对于雄虫，雌虫的变化不太明显，一般表现为活动能力减弱，卵黄腺浑浊以及身体的局部肿胀等。24h以后，体表已发生变化损伤的虫体，其受损程度进一步加剧。到48h时，部分虫体已经死亡。直至72h，大剂量组雄虫已基本死亡，雌虫虽未死亡，但与对照组相比，其也有一定的损伤，比如卵黄腺肿胀、肠管停止蠕动等。实施例6:活性化合物系列衍生物的优化设计与合成本发明者以试验验证获得的活性化合物为基础，基于SjADSS结合口袋的结构和性质，对活性化合物结构进行改造和优化。改造流程为确定活性化合物结合构象；活性位点分析；结构改造；衍生物吸收、分布性质预测。首先采用AutoDock将AN-988/40788227与SjADSS进行自动对接，对接构象与实施例4的结果基本一致，从而确定AutoDock对接构象为化合物改造的初始构象。然后采用Cerius2软件包的STRBASEDFOCUSING模块对SjADSS的口袋进行活性口袋分析(ActiveSiteAnalysis,ASA),分析结果包含三个部分配体疏水作用优势区、配体氢键供体优势区、配体氢键受体优势区。根据这些区域与起始结构的相对位置，本发明者主要依据配体氢键受体优势区对初始结构进行了改造，在这些区域分别引入羟基以增强化合物与SjADSS之间的相互作用，得到7个活性化合物衍生物。采用AutoDock对衍生物进行对接，发现对接构象与初始构象基本一致，引入的羟基与口袋氨基酸形成了更多的氢键，预测结合自由能有一定降低，达到提高活性的目的。最后采用PreADMET(http:〃preadmet.bmdrc.org/preadmet/)网络服务计算衍生物的吸收和分布性质，计算结果与AN-988/40788227相近，表明衍生物具有与AN-988/40788227相似的吸收、分布性质。该衍生物具有如下通式I的结构其中，X、Y=CH2、NR、O、S;Rj=(C广C6)烷基、OR、NHR、卤素、CN、H;R2、R3、R4=垸基、取代芳基、取代杂芳基，其中所述R3、R4可和与其相连的氮原子连接形成五元或六元杂环.通式I化合物可制成其药学上可接受的盐或溶剂合物。本发明的实验发现，通式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物可以有效地抑制SjADSS蛋白与底物IMP的结合，具有较明显的抑制体外培养的日本血吸虫的活性，因此，具有治疗和/或预防日本血吸虫感染的用途。参考文献周述龙等，《血吸虫学》(科学出版社)，2001,Ismail,M.etal.Resistancetopraziquantel:directevidencefromSchistosomamansoniisolatedfromEgyptianvillagers.Am,J.Trop.Med,Hyg.1999;60:932-935[3]FenwickA.etal.Drugsforthecontrolofparasiticdiseases:currentstatusanddevelopmentinschistosomaisis.TrendsParasitol.2003;19(11):509-515[4]DonatoCetal.Praziquantel.Parasitol.Res.,2003;90:S3-S9肖树华等，蒿甲醚预防血吸虫感染的实验研究。中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1995;13(4):241-248[6]肖树华等，蒿甲醚预防血吸虫感染的现场研究。中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1995;13(3):170-173[7]吴铃娟等，青蒿琥酯预防急性血吸虫病的实验研究。中国血吸虫病防治杂志。1997;9(5):284-286[8]吴铃娟等，青蒿琥酯对日本血吸虫童虫体内四种酶活性的研究。中国血吸虫病防治杂志，1996;8(5):267-269KohnABetal.Schistosomecalciumchannel|Jsubunits.J.Bio.Chem.2001;276(40):36873-36876[10]MeshnickSRetal.Artemisinin:mechanismsofaction,resistanceandtoxicity.Int.J.Parasitol.2002;32:1655-1660OlliaroPLetal.Possiblemodesofactionoftheartemisinin-typecomponounds.TrendsParasitol.2001;17(3):122-126SenftAW,C.G.(1983)."Purinemetabolismintheschistosomes:potentialtargetsforchemotherapy."PharmacolTher20(3):341-56[13]HuangZuo-yue，ChangHui-lingetal,ThemetabolismofpyrimidineandpurineinSchistosomajaponicum.ChineseMedicalJounal,1984;97(9):698-706;[14]elKouniMH.Potentialchemotherapeutictargetsinthepurinemetabolismofparasites.PharmacolTher.2003Sep;99(3):283-309.Review.[15]Smyth,J.D.(1994)."IntroductiontoAnimalParasitology."NelsonDJ，LaFonSW，ElionGB,MarrJJ，BerensRL.Comparativemetabolismofanewantileishmanialagent,allopurinolriboside,intheparasiteandthehostcell.AdvExpMedBiol.1979;122B:7-12.[17]CarlsonHE,ChangRJ,MeyerNV,LuKH,JuddHL.Effectofcimetidineonserumprolactininnormalwomenandpatientswithhyperprolactinaemia.ClinEndocrinol(Oxf).1981Nov;15(5):491-8,[18]StaytonMM,RudolphFB,FrommHJ.Regulation,genetics,andpropertiesofadenylosuccinatesynthetase:areview.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