专利名称：从全基因组中富集甲基化dna的方法及其所用层析柱组的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从全基因组中富集甲基化 DNA的方法及其所用层析柱组。
背景技术：
正常细胞功能的发挥与细胞本身的遗传信息、遗传调控和表观遗传调 控相关，随着人类基因组计划的实施，国内外对基因组所携带的遗传信息 在疾病发生、发展中的重要作用己有比较深入的研究。相对而言，染色质 所携带的表观遗传信息在疾病发生、发展中的重要作用才刚开始被认识， 表观遗传学基因组正在兴起。表观遗传学的过程包括DNA甲基化，组蛋白 的修饰和ATP依赖的染色质的修饰，都可以引起基因表达的改变。其中 DNA的甲基化是目前的一个研究热点。
疾病的发生、发展是细胞内遗传本身、遗传调控和表观遗传调控的紊 乱。大量的临床和基础研究结果表明除了遗传因素，环境因素在大多数疾 病发生、发展中有巨大的影响，而表观遗传调控机制在遗传因素和环境因 素的互动关系中起了桥梁的作用，已有的研究结果表明表观遗传因素的作 用占百分之七十左右。近年的研究更进一步指出表观遗传调控机制在多种 疾病发生中起主导作用。基因表达的表观遗传调控是保证细胞内基因的时 空正确表达所必需的。因此，当表观遗传调控出现异常时，在胚胎发育阶 段可能引起各种先天性的发育缺陷，在成体阶段可能造成各种疾病的发
生。后基因组时代表观遗传学的兴起为解开生命奥秘及征服疾病带来了希 望。
.在哺乳类动物中，胞嘧啶的甲基化是惟一已知的DNA内源性修饰方 式，即通过DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)的催化作 用，将甲基基团加在胞嘧啶的5' C位置处。在哺乳类动物细胞中，大多 数5，-甲基胞嘧啶(5mC)以双核苷酸CpG的形式出现。CpG双核苷酸在 人类基因组中的分布很不均匀，其中密度较高的区域称为CpG岛(CpG island)。人类50% 60%的基因有CpG岛，据估计整个基因组有45,000 个CpG岛，并且几乎总是位于基因启动子和(或)外显子周围。除了印记 基因和女性失活的X染色体的几个基因外，正常情况下，在CpG岛的CpGs 总是非甲基化的，而大多数CpG岛之外的CpGs则是甲基化的。
DNA甲基化的机制及其作用尚未完全清楚，目前认为它与控制基因表 达、DNA修复、外源基因的识别和剔除、以及染色体的稳定性等相关。已 证实，CpG岛的甲基化可以直接导致相关基因的表观遗传学沉默，启动子 区域CpG岛甲基化是与基因突变和缺失相并列的抑癌基因失活的第3种途 径，并成为近年来肿瘤研究的热点之一。
随着生物技术的进步，DNA甲基化的检测手段日渐丰富，常用技术 的基本原理主要可以归纳为四个方面:一种是依赖化学物质对甲基化和非 甲基化胞嘧啶的化学活性不同，将甲基修饰基团的差别转变为碱基序列的 不同，从而加以分离；另一种是依赖甲基化和非甲基化胞嘧啶对特定的限 制性内切酶处理的不同反应而实现；第三种是依据差异性杂交的原理；第 四种则是依靠甲基化CpG结合(methyl-CpG-binding domain, MBD)蛋白
家族对甲基化以及非甲基化的CpG序列的结合能力的不同进行分离。此 外，还有单核苷酸法、甲基化接受力的检测法等多种技术，这些技术极大 地促进了表观遗传学的研究，推动了表观基因组学研究的开展。目前虽然 已经存在较多的DNA甲基化的检测技术，但是每种方法都有一定的局限 性，难以达到大规模和全基因组范围的分析。例如目前大量使用的基于 亚硫酸氢钠对DNA的修饰的各项技术，包括甲基化特异性的PCR，即MSP， 以及被视为金标准的亚硫酸盐测序法，即BSP，均由于亚硫酸氢钠对DNA 修饰技术本身的瓶颈——改变了原有DNA的二级结构，导致DNA不稳定； 难以准确有效的保证亚硫酸氢盐对DNA的修饰程度;改变了原有DNA的碱 基序列，增加了后续实验室操作，包括PCR等的难度，而难以得到大规模 的应用；同样的，基于限制性内切酶的检测技术由于受到酶切位点的限制， 也难以在全基因组的范围内大规模应用。现有的表观基因组学急需在高通 量、大规模的研究技术方面得到突破，以满足全面地了解在疾病的发生过 程中甲基化谱式的改变的需要。如果能出现一种灵敏而特异的富集甲基化 和/或非甲基化DNA的方法，将有效规避上述几种常用实验技术的弊端， 大大增加大规模DNA甲基化检测的发展和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从全基因组中富集甲基化DNA 的方法，能有效提高甲基化DNA富集的特异性和敏感性。为此，本发明还 要提供该方法所用的层析柱组。
为了解决上述技术问题，本发明从全基因组中富集甲基化DNA的方法 包括如下步骤(1) 制备层析柱组，该层析柱组包括甲基化DNA特异的亲和层析柱和 非甲基化DNA特异的亲和层析柱；
(2) 抽提待测样品DNA;
(3) 将待测样品DNA与步骤(1)制备的非甲基化DNA特异的亲和层 析柱进行结合反应，以去除待测样品DNA中的非甲基化DNA;
(4) 把经步骤(3)所得的滤过液与甲基化DNA特异的亲和层析柱进行 结合反应，以富集甲基化DNA。
一种适用于上述方法的层析柱组，包括甲基化DNA特异的亲和层析柱 和非甲基化DNA特异的亲和层析柱。
本发明从全基因组中富集甲基化DNA的方法，显著提高从全基因组范 围内富集甲基化DNA的效率，且能明显增加甲基化DNA富集的特异性和敏 感性。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。 附图是本发明从全基因组中富集甲基化DNA的方法的流程图。
具体实施例方式
本发明从全基因组中富集甲基化DNA的方法，利用特异性非甲基化 CpG结合蛋白和甲基化CpG结合蛋白制成DNA亲和层析柱组，对基因组DNA 进行初步筛选，对甲基化的DNA进行富集，具体实验步骤如下(见附图) l.制备DNA层析柱组
包括甲基化DNA特异的亲和层析柱和非甲基化DNA特异的亲和层析 柱，其中
1) 构建CGBP蛋白(丽—014593 ， Homo sapiens CpG binding protein) 的质粒表达载体，在原核表达系统内进行表达，得到的蛋白经纯化后结合 于固体基质制成非甲基化DNA特异的亲和层析柱，置于4°C备用。
2) 构建MBD2b (NM_015832， Homo sapiens methyl-CpG binding domain protein 2， isoform 2)蛋白的质粒表达载体，在原核表达系统内进行表 达，得到的蛋白纯化后结合于固体基质制成甲基化DNA特异的亲和层析 柱，置于4。C备用；构建MBD3L1 (AY038022, Homo sapiens methyl_CpG binding domain protein 3-like)蛋白的质粒表达载体，在原核表达系 统内进行表达，得到的蛋白纯化后，于实验时在加入待测DNA之前，与甲 基化DNA特异的亲和层析柱进行预孵育，加强甲基化DNA特异的亲和层析 柱上MBD2b与甲基化的DNA的结合力。构建kaiso (NM—006777， Homo sapiens zinc finger and BTB domain containing 33， ZBTB33)蛋白的 质粒表达载体，在原核表达系统内进行表达，得到的蛋白纯化后结合于固 体基质制成甲基化DNA特异的亲和层析柱，置于4。C备用。其中，所述固 体基质包括溴化氰活化的S印herose 4B、 Agarose和磁珠。
2. 抽提待测样品DNA
3. 利用亲和层析柱组对待测样品中甲基化和非甲基化的DNA成分进 行分离和富集
1) 将待测样品DNA与上述非甲基化DNA特异的亲和层析柱进行结合， 除去其中的非甲基化修饰的DNA成分;也可对通过对洗脱液中非甲基化的 DNA成分进行富集，以备非甲基化DNA的后续检测。
2) 将上述非甲基化DNA特异的亲和层析柱的滤过液与甲基化DNA特异
的亲和层析柱进行结合反应。
3)将结合在甲基化DNA特异的亲和层析柱上的DNA洗脱、纯化。以实 现对甲基化修饰的DNA的富集。如果该部分DNA量较少，可通过PCR等方 法进行放大。
为了保证本发明方法的特异性和灵敏度，每次实验，均严格设置阴性 对照和阳性对照。其中，阴性对照为全基因组DNA经全基因组PCR放大， 而后取其产物，稀释500倍后作为模板，再次进行全基因组放大，取第二 次全基因组放大的产物作为非甲基化状态的阴性对照(由于PCR体系中的 dNTP未经甲基修饰，无论原始模板的甲基化修饰状态怎样，经两次PCR 放大后，PCR产物中的剩余甲基可以忽略不计)；阳性对照为取全基因 组DNA作为模板(无论其甲基化状态如何)，经Sss-I甲基化酶进行处理， 在其全部CpG结构上加以甲基修饰，取其修饰产物作为甲基化DNA的阳性 对照。
实施例 1
应用本发明的富集甲基化DNA的方法，对临床肝癌样本进行DNA甲基 化异化谱的研究，具体步骤为 1.亲和层析柱组的制备
包括甲基化DNA特异的亲和层析柱和非甲基化DNA特异的亲和层析
柱，其中
1)构建CGBP蛋白(丽—014593 ， Homo sapiens CpG binding protein, 人CpG结合蛋白)的质粒表达载体，在原核表达系统内进行表达，得到的 蛋白经纯化后结合于固体基质制成非甲基化DNA特异的亲和层析柱，置于4"C备用。
2)构建MBD2b (丽—015832， Homo sapiens methy卜CpG binding domain protein 2， isoform 2，人甲基化CpG结合蛋白异构体2)蛋白的质粒表 达载体，在原核表达系统内进行表达，得到的蛋白纯化后结合于固体基质 制成甲基化DNA特异的亲和层析柱，置于4。C备用；构建MBD3L1(AY038022， Homo sapiens methyl-CpG binding domain protein 3-like)蛋白的质 粒表达载体，在原核表达系统内进行表达，得到的蛋白纯化后置于4'C备 用。
2. 抽提临床肝癌样本DNA
使用传统的酚-氯仿方法从临床肝癌样本(-8(TC保存)中抽提DNA， 将抽提溶解好的DNA移入高压灭菌过的1. 5ml离心管中，取lul进行电 泳(1%琼脂糖凝胶，0.5XTBE, EB， 80MV, 1. 5小时电泳)，在FR-200紫 外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker ( Lambda DNA/EcoRI+Hindlll)进行定量。
3. 目的DNA的富集
1) 将待测DNA进行超声断裂，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)进行纯化后测定浓度。而后，将DNA与上述非甲基化DNA特异的亲和层析柱进行结合，除去其中的非甲基化修饰的 DNA成分，收集滤过液；同时收集洗脱液，对非甲基化的DNA成分进行富 集，以备非甲基化DNA的后续检测。
2) 在上述甲基化DNA特异的亲和层析柱中，加入MBD3L1蛋白进行预 孵育，以加强甲基化DNA特异的亲和层析柱中MBD2b蛋白与甲基化DNA
的亲和能力。
3)将上述非甲基化DNA特异的亲和层析柱的滤过液加入甲基化DNA 特异的亲和层析柱进行结合反应。收集洗脱液，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)进行纯化。 4.甲基化DNA的进一步检测 将上述富集的甲基化DNA与人类全基因组CpG岛检测芯片进行杂交， 依据杂交结果确定甲基化DNA所在的CpG岛位置，与正常肝组织的DNA 甲基化谱进行比较，得到肝癌的DNA甲基化异化谱。
权利要求
1. 一种从全基因组中富集甲基化DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)制备层析柱组，该层析柱组包括甲基化DNA特异的亲和层析柱和非甲基化DNA特异的亲和层析柱；(2)抽提待测样品DNA；(3)将待测样品DNA与步骤(1)制备的非甲基化DNA特异的亲和层析柱进行结合反应，以去除待测样品DNA中的非甲基化DNA；(4)把经步骤(3)所得的滤过液与甲基化DNA特异的亲和层析柱进行结合反应，以富集甲基化DNA。
2. —种适用于权利要求1所述方法的层析柱组，其特征在于，包括甲 基化DNA特异的亲和层析柱和非甲基化DNA特异的亲和层析柱。
3. 如权利要求2所述的层析柱组，其特征在于，所述甲基化DNA特异 的亲和层析柱通过将特异性结合甲基化DNA的蛋白固定于层析柱的基质 而制得。
4. 如权利要求3所述的层析柱组，其特征在于，所述特异性结合甲基 化DNA的蛋白包括MBD2b蛋白和kaiso蛋白。
5. 如权利要求2所述的层析柱组，其特征在于，所述非甲基化DNA 特异的亲和层析柱通过将特异性结合非甲基化DNA的蛋白固定于层析柱 的基质而制得。
6. 如权利要求5所述的层析柱组，其特征在于，所述特异性结合非甲 基化DNA的蛋白包括CGBP蛋白。7.如权利要求3或5所述的层析柱组，其特征在于，所述层析柱的基 质包括溴化氰活化的S印herose 4B、 Agarose禾口磁珠。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种从全基因组中富集甲基化DNA的方法，包括制备层析柱组，该层析柱组包括甲基化DNA特异的亲和层析柱和非甲基化DNA特异的亲和层析柱；抽提待测样品DNA；将待测样品DNA与非甲基化DNA特异的亲和层析柱进行结合反应，以去除待测样品核酸中的非甲基化DNA；把所得的滤过液再与甲基化DNA特异的亲和层析柱进行结合反应，以实现富集甲基化DNA的目的。本发明还公开了适用于该方法的层析柱组。本发明从全基因组中富集甲基化DNA的方法，能显著提高从全基因组范围内富集甲基化DNA的效率，且明显增加甲基化DNA富集的特异性和敏感性。
文档编号C12N15/10GK101205536SQ200610147409
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月18日 优先权日2006年12月18日
发明者颖 秦, 肖华胜 申请人:上海生物芯片有限公司