专利名称：人血浆dna中apc基因甲基化定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物大分子检测方法，特别涉及一种对人血浆DNA中^PC基因 曱基化定量检测方法。
背景技术：
人血浆DNA是指游离于细胞外的DNA ( cell free DNA),又称循环DNA,正常情 况下由体细胞死亡并释放到外周血中，处于一个较为恒定的水平，保持着一种平衡。近 年来随着表观遗传学和肿瘤发生机制研究的深入,有证据显示肿瘤发生的早期一些抑癌 基因启动子区发生曱基化改变，并且这种改变始终伴随着肿瘤发展的整个过程中。肺瘤 形成过程中，大量的肿瘤细胞产生，同时也出现大量肿瘤细胞死亡，肺瘤来源的核酸释 放到外周血中导致血浆DNA总量升高，肺瘤细胞死亡的数量多少与血浆中肿瘤来源核 酸的多少相关。目前国内外的许多研究证明绝大多数肺癌及消化道等肺瘤细胞中抑癌基 因爿尸C发生曱基化，因此血浆中也可以检测到这种改变。
因此，对血浆中APC基因曱基化进行定量检测，可以应用于肺癌及消化道等肿瘤 患者的早期诊断；同时还可以应用于患者治疗过程中疗效观察、预后及复发等方面的监 测。
在本发明之前，目前多是采用血浆DNA提取后行亚疏酸氢盐化学修饰，再采用普 通MSP(Methylation Specific PCR， MSP)进行扩增检测。由于血浆中DNA含量少、非 标准化的提取过程中丢失率高、非标准化的亚硫酸氢盐化学修饰过程中大量的DNA降 解和普通MSP后用低敏感度并且带有致癌污染物溴化乙锭的电泳判断结果等原因，使 得从血浆DNA中检测肿瘤来源的微量曱基化DNA就变得非常困难。因此，直到目前 为止检测血浆中JPC基因曱基化还没有直接应用于相关肿瘤患者的早期诊断、患者治 疗过程中疗效观察、预后及复发等方面的监测。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，建立了 一种人血浆DNA中^尸C基因甲基化 定量检测方法。
本发明的技术方案是
人血浆DNA中J尸C基因曱基化的定量检测方法，其主要技术步骤在于
(1) 取人外周静脉血，EDTA-K2抗凝，离心后取血浆；
(2) 制备血浆DNA标准曲线样品；
(3) 采用磁珠法微量核酸提取技术提取待测血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和 健康人血浆DNA;
(4 )采用亚硫酸氬盐法对血浆DNA进行化学修饰，同时修饰标准曲线血浆样品DNA
和健康人血浆DNA，分别作为阳性和阴性对照； (5)针对人爿PC基因启动子区中1A序列的707号CpG位点设计特异性引物和
Taqman荧光探针
上游引物序列APCMS707 5'-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3'，大小为21bp,
分子量为6.99KD; 下游引物序列APCMA707 5'-CCGACCCGCACTCCG-3'，大小为15bp，
分子量为5.00KD;
焚光探针APCMP707 5'-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE-3'，大 小为20bp,分子量为6.66KD, 5'端标记为JOE, 3'端标记为ECLIPSE; 目的产物大小为97bp，分子量为64.60KD;
(6) 25 n 1的荧光定量MSP扩增体系的组成为H20 11.9 n 1 ，5 x Real Time PCR Buffer 5 n 1, lOmM的dNTPs 1.0 u 1,250mM的MgCl2 0.4 n 1， 5mM的上下游引物各1.0 in 1, 5mM荧光探针0.5 in 1，热启动酶0.2 n l,样本模板投入量为4 u 1;
(7) 荧光定量MSP扩增的反应条件如下①95'C 5 min;②94。C 30s ,55°C 30s ,72 °C 40s，共55个循环；
(8 )以标准品血浆DNA的扩增结果制定标准曲线，对待测样本进行曱基化定量结果 分析。
本发明的优点和效果在于利用设计针对J尸C启动子区1A序列一对引物和一个 Taqman焚光探针，使用荧光定量MSP对修饰后的血浆DNA模板进行扩增，有针对性 的检测^尸C基因启动子部位第707号位的曱基化高发CpG位点;同时可以对血浆中APC 曱基化进行定量分析，提高了血浆中^尸C基因曱基化的检测灵敏度，本法的最低检出 限为1.5x 1(^拷贝/ml;克服了以往普通MSP需要电泳、易污染、灵敏度低等缺点。本 定量检测技术对于早期恶性肿瘤(如肺癌等)诊断有着非常重要的意义，同时还可以 用于肿瘤患者的治疗疗效观察、预后和复发监测等方面。
本发明的其它优点和效果将在下面继续阐述。
图1一一标准品及待测样品的荧光定量MSP扩增曲线图。
注1.标准品2x 1()S拷贝/ml; 2.标准品2 x 1(^拷贝/ml; 3.标准品 2x 1()3拷贝/ml;
4.标准品2xi(p拷贝/ml; 5.肺癌患者血浆样本；6.健康人血
浆样本；7.H20。
图2—一标准曲线。
注-joe Std为阳性标准品；l€ unknown为待测样品；slope为 斜率；intercept为截距。
具体实施例方式
1. 血浆分离和保存
用含EDTA-K2的5 ml带盖无菌塑料抗凝管抽取人外周静脉血2 ml,室温状态 下放置48小时内以3 000 rpm离心10 min,收集血浆；再次以1 000 rpm离心10 min, 获得无血细胞成分的血浆，用1.5ml的离心管以每管200nl分装，-20。C以下温度保 存，并于一个月内检测。 注收集抗凝静脉血不可以使用玻璃离心试管。
2. 标准曲线血浆样品制备
(1) 人胎儿脐带血(cord blood, CB)细胞DNA提取健康人胎儿脐带血经Ficoll 淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，采用传统酚/氯仿法提取CB DNA;
(2) CBDNA转曱基10 x NEB buffer 2 ji 1,1.6mM SAM 2 |a 1， Sssl Methylase 4U， CB DNA 1 n g,总体积20 n 1，按标准操作程序制备得到阳性对照DNA;
(3) 制备阳性标准品对阳性对照DNA进行紫外分光光度法定量，向健康人血浆中 加入阳性标准品使其浓度分别为2 x 102拷贝/1111、 2 x 1(^拷贝/ml、 2 x 104拷贝/1111 和2xl(^拷贝/ml，共四个浓度，作为标准曲线血浆样品。
3. 血浆DNA模板的提取
采用磁珠法微量核酸提取技术同时对待测血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA
健康人血浆DNA进行提取
(1) 在200 nl血浆中加入200 nl裂解液，再加入4 pl RNA酶抑制剂混合液，充分混 勻后放55'C水浴15min;
(2) 将离心管取出后每管加入600 pl磁珠与结合液的混合液，振荡混勻，室温放置 10min，中间颠倒混匀一次；
(3) 将离心管侧靠在》兹体上，放置4min,吸弃液体，注意不要碰或吸走红色沉淀， 将离心管拿离磁体；
(4) 在离心管内加入200nl洗液，将红色沉淀振荡，充分混匀，然后将离心管侧靠在 磁体上，放置lmin，吸弃液体，将离心管拿离磁体；
(5) 在离心管内加入100 jal洗液，将红色沉淀振荡，充分混匀后，重复步骤上一步骤， 离心管放在55'C金属浴，干燥4min;
(6) 在干燥后的离心管内加入50pl洗脱液，充分溶解红色沉淀，在55。C金属浴保温 10 min，离心管侧靠在磁体上，放置1 min，将液体吸出至新离心管内，此即为 DNA提取液。
注提取的DNA置于-20。C保存，及时行化学修饰，如需要长期保存，应放置在-70 'C的冰箱中保存。
4. 血浆DNA的化学修饰
采用Chemicon公司的S7820化学修饰试剂盒，同时修饰标准曲线血浆样品DNA 和健康人血浆DNA ，分别作为阳性和阴性
(1) 在保存血浆DNA的EP管中，加入H20,配成100 pl体系，再加入7 ^ 3 M氢 氧化钠，混合后置50 'C水浴10min;
(2) 加入550 ^亚石危酸氢钠，然后漩涡振荡后50 'C水浴16小时；
(3) 加入5 pi悬浮好的糖原至EP管中，再加入750 pi对苯二酚，并短时混匀，室温 放置5-10 min;
(4) 6 000g，离心lmin,沉淀糖原，弃去上清；
(5) 加入lml70。/。乙醇，振荡，6 000g，离心lmin,弃去上清，重复此操作共三次； 第三次倒弃上清后，10000g,离心2min,吸弃上清；
(6) 加入50^120mM的氢氧化钠/90。/。乙醇到EP管中，短暂旋匀以重悬沉淀，室温 孵育5min;
(7) 6000g,离心lmin沉淀样品，加入1 ml 90%的乙醇涡旋洗涤沉淀，再次离心， 倒弃上清，重复一次这一步骤；第二次倒弃上清后，10 000 g，离心2min;吸弃 所有的残余上清，室温干燥15min;
(8) 加入30nlTE,短暂涡旋重悬沉淀，50 。C水浴15min，溶解DNA;
(9) 12 000 g，离心3min，吸取上清至新离心管。
注经化学修饰的血浆DNA置于-2(TC保存，及时检测。如需要长期保存，应放置 在-70'C的冰箱中保存。
5. 荧光定量MSP检测
(1) 25)al的荧光定量MSP扩增体系的组成为H20 11.9 m 1,5 x Real Time PCR Buffer 5|al， lOmM的dNTPs 1.0pi, 250mM的MgCl2 0.4jul, 5mM的上下游引物各1.0m 1, 5mM的探针0.5 u 1，热启动酶0.2 u l，样本模板投入量为4 ja 1。
(2) 荧光定量MSP扩增的反应条件如下 95°C 5 min;②94。C 30s,55。C 30s,72。C 40s，共55个循环。
(3) 采用具有JOE检测通道的定量PCR仪(如ABI7500、 Mx 3005P、 Light Cycler 2.0
等)，进行实时荧光定量MSP检测。6.待测血浆样本、标准品血浆及健康人血浆应同时进行血浆DNA提取、化学修饰及
实时荧光定量MSP扩增，按常规方法，制定出标准曲线，按照标准曲线公式定量
(ct-截距)
计算待测样本中曱基化^户C基因的浓度，定量的计算公式为(^^=10斜* ,其
中斜率=——^_,截距-i^zM， Ct为待测样本扩增荧光信号强度达到阈值 lg(l + ￡) lg(l + ￡)
时所需要的循环数，E为扩增效率，T为阈值，R为常lt/即一个扩增子产生的荧光 信号强度。 7.实际检测举例
(1) 检测样本包括四个标准品血浆，浓度分别为2 x 102拷贝/1111、 2 x 103拷贝/1111、 2 x 1(^拷贝/ml和2x 1()S拷贝/ml;健康人血浆；H20; —名早期肺癌患者待测血浆；
(2) 荧光定量MSP扩增后，得到扩增曲线，图1为标准品及待测样品的荧光定量MSP 扩增曲线；
注1.标准品2x 1()5拷贝/ml; 2.标准品2 x 1()4拷贝/ml; 3.标准品2乂103拷 贝/ml; 4.标准品2x 1(^拷贝/ml; 5.肺癌患者血浆样本；6.健康人血浆样本； 7.H20
(3) 设定基线和阈值后，得到标准曲线，同时得到标准曲线方程为Ct=-4.321gCo+50.28， 斜率为-4.32，截距为50.28，图2为以4个阳性标准品绘制的标准曲线；
注 joeStd为阳性标准品；unknown为待测样品；slope为斜率；intercept 为截距
Ct-截距
(4) 肺癌患者样本扩增Ct值为36.6，根据定量计算公式C^c-l(/^^)，算出该样本 中曱基化爿PC基因的浓度为1.45 x 1(^拷贝/ml。
权利要求
1.人血浆DNA中APC基因甲基化定量检测方法，其步骤在于(1)取人外周静脉血，EDTA-K2抗凝，离心后取血浆；(2)制备血浆DNA标准曲线样品；(3)采用磁珠法微量核酸提取技术提取血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA；(4)采用亚硫酸氢盐法对血浆DNA进行化学修饰，同时修饰标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA，分别作为阳性和阴性对照；(5)针对人APC基因启动子区中707CpG位点设计特异性引物和Taqman荧光探针上游引物序列APCMS707 5′-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3′，大小为21bp，分子量为6.99KD下游引物序列APCMA7075′-CCGACCCGCACTCCG-3′，大小为15bp，分子量为5.00KD荧光探针序列APCMP7075′-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE-3′，大小为20bp，分子量为6.66KD，5′端标记为JOE，3′端标记为ECLIPSE目的产物大小为97bp，分子量为64.60KD；(6)25μl的荧光定量MSP扩增体系的组成为H2O 11.9μl，5×Real Time PCR Buffer5μl，10mM的dNTPs 1.0μl，250mM的MgCl2 0.4μl，5mM的上下游引物各1.0μl，5mM荧光探针的0.5μl，热启动酶0.2μl，样本模板投入量为4μl；(7)荧光定量MSP扩增的反应条件如下①95℃ 5min；②94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，共55个循环；(8)以标准品血浆DNA的扩增结果制定标准曲线，对待测样本进行定量结果分析。
2. 根据权利要求1所述的人血浆DNA中APC基因甲基化定量检测方法，其特征在于DNA作为阳性标准品，向健康人血浆中加入阳性标准品使其浓度分别为2xl02 拷贝/ml、 2xl()3拷贝/ml、 2x 1()4拷贝/ml和2x 1()5拷贝/ml,共四个浓度，作为标准 曲线血浆样品。
3. 根据权利要求1所述的人血浆DNA中」户C基因曱基化定量才企测方法，其特征在于 步骤O)中的磁珠法微量核酸提取技术是指按常规J兹珠法操作步骤，200]Jl血浆 经裂解液处理后，加入结合液和磁珠，以磁体吸附磁珠，吸弃液体后，经洗液多次清 洗，最后以洗脱液溶解，吸出的上清液即为血浆DNA提取液，对待测血浆DNA、 标准品血浆DNA和健康人血浆DNA进行同时提取。
4. 根据权利要求1所述的人血浆DNA中爿PC基因甲基化定量检测方法，其特征在于 步骤(4)中，对血浆DNA行亚硫酸氢盐化学修饰是指按常规DNA化学修饰方 法操作步骤，血浆DNA模板经碱变性、化学修饰、初步去盐、二次去盐完成修饰， 最终溶解于TE緩冲液中，同时修饰标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA,分 别作为阳性和阴性对照。
5. 根据权利要求1所迷的人血浆DNA中^PC基因曱基化定量检测方法，其特征在于 步骤(5)中，上游引物序列APCMS707 5'-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3',大小 为21bp，分子量为6.99KD;下游引物序列APCMA707 5'-CCGACCCGCACTCCG-3' 大小为 15bp , 分子量为 5.00KD ; 焚光探针序列APCMP707 5'-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE陽3'，大小为20bp，分子量为6.66KD, 5'端标记为JOE, 3'端标记为ECLIPSE,适用于爿尸C基因启动子1A序列中第707号 CpG位点。
6. 根据权利要求1所述的人血浆DNA中乂户C基因曱基化定量检测方法，其特征在于 步骤(6 )中25 m 1的PCR体系组成如下H20 11.9 p 1, 5 x Real Time PCR Buffer 5 p 1, 10mM的dNTPs 1.0 ja 1, 250mM的MgCl2 0.4 y 1， 5mM的上下游引物各1.0 p 1, 5mM的荧光探针0.5 m 1,热启动酶0.2 u l，样本模板投入量为4 m 1。
7. 根据权利要求1所述的人血浆DNA中^PC基因曱基化定量检测方法，其特征在于 步骤(7)中扩增的条件为①95。C 5 min;②94。C 30s ,55。C 30s ,72°C 40s ,共55 个循环。通过具有JOE通道荧光检测的荧光定量PCR仪进行检测，以标准品血浆 DNA的扩增结果制定标准曲线，对待测样本进行曱基化定量结果分析。
全文摘要
本发明涉及一种对人血浆DNA中APC基因甲基化定量检测方法。本发明取静脉血后得血浆，制备血浆DNA标准曲线样品，提取待测血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA，对血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA化学修饰，对人APC基因启动子区中1A序列的707号CpG位点设计特异性引物和Taqman荧光探针，扩增后以标准品血浆DNA的扩增结果制定标准曲线，对待测样本进行甲基化定量结果分析。本发明解决了血浆中DNA含量少、丢失率高、DNA降解、带有致癌污染物等缺陷。本发明利用针对APC启动子区1A序列一对引物和一个Taqman荧光探针，针对性检测APC基因启动子部位第707号位的甲基化高发CpG位点，进行定量分析，可用于肿瘤患者的治疗疗效观察、预后和复发监测等方面。
文档编号G01N21/00GK101354347SQ200710191938
公开日2009年1月28日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者潘世扬, 谢而付, 丽 高 申请人:潘世扬