专利名称：Znf545基因甲基化定量检测方法
技术领域：
本发明涉及DNA甲基化检测，主要涉及ー种定量检测DNA甲基化的方法。
背景技术：
癌症的早期诊断对癌症患者的有效治疗至关重要。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、直接触诊、图像信号检测和组织病理学检查等，但绝大多数癌症临床症状出现较晚，且活体取样困难，在首次诊断时已呈晚期，严重影响了患者的治疗和病人的愈后。因此寻找恶性肿瘤的生物标志物，应用于早期诊断和筛查，对肿瘤患者的治疗和预后具有重要的意义。DNA甲基化程度和模式的改变是肿瘤发生的ー个重要因素。这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。同样，对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其甲基化程度降低，这些基因将表达和重复序列将激活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性増加，以及内寄生序列(endoparasitic sequence)激活,最终也导致肿瘤发生。由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进ー步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。近年来，不断有研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。所以甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型 、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。ZNF545基因为含KRAB的锌指基因，其编码的蛋白能够与DNA结合，ZNF545基因为转录调控因子，研究证明ZNF545为一种抑癌基因(The KRAB-containing zinc fingerprotein ZNF545 is a functional tumor suppressor exerting proapoptotic andantiproliferation abilities with frequent epigenetic inactivation in multiplecarcinomas， ChengYingduan， LiangPei and GengHua，101st Annual Meeting of theAmericanAssociationforCancerResearch, 2010)，在胃癌细胞中抑制核糖体 RNA 转录(Zinc-finger protein 545 is a novel tumour suppressor that acts Dy mhioitmgribosomal RNA transcription in gastric cancer，Wang S，Cheng Y and Du W, Gut，2012)，ZNF545基因作为抑癌基因，其甲基化程度与肿瘤的发生密切相关。ZNF545基因序列中CpG含量丰富，如何对其进行甲基化定量检测成为ー个亟待解决的问题。针对特定基因的甲基化分析现有技术中主要有以下几种方法，第一种现有技术是甲基化敏感性限制性内切酶 _P C R/Southern(methyIation-sensitive restrictionEndonucIease-PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern),这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaI1-Msp I (CCGG)和 Sma-Xmal (CCCGGG)等。第二种现有技术是重亚硫酸盐测序法，该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每ー个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。第三种现有技术是，甲基化特异性的PCR(methylation-specificPCR,MS_PCR),该方法中DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即ー对结合处理后的甲基化DNA链，另ー对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MS-PCR扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。该方法适合判断特点位点的甲基化情况。第四种现有技术为甲基化荧光法，结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计ー个能与待测位点区互补的探针， 探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸吋，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及程度。该方法适合分析特定位点甲基化情況。第五种现有技术是焦磷酸测序，该方法由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每ー轮测序反 应中，只加入ー种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值,其高度与核苷酸数目成正比。当用于甲基化检测时，经重亚硫酸盐处理的序列可以看作是C-T型的SNP改变。第六种现有技术为结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法，这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。以上各项现有技术在特定基因区域DNA甲基化的准确、高效的定量方面仍缺乏好的解决方法。由于ZNF545基因GpC含量较高，而CpG位点发生甲基化具有随机性，尤其在肿瘤发生早期甲基化程度很低的情况下，针对具体甲基化位点设计特异性引物或探针的方法具有很大局限性，不能准确地反应整个ZNF基因中CpG位点聚集区的甲基化情況。此外，肿瘤发展阶段主要是与甲基化高发区的甲基化程度有关，而与具体哪个CpG位点无关。因此需要解决现有定量甲基化分析方法受随机甲基化影响的问题，提出ー种新的简便、可靠、快速的获取与肿瘤发展直接有关的定量甲基化程度分析方法
发明内容
本发明的目的是提供ー种定量检测DNA甲基化的方法，可简便、可靠、快速的获取与肿瘤发展直接有关的甲基化程度分析。本发明提供的ー种ZNF基因甲基化定量检测的方法，包括以下步骤步骤一、建立ZNF545基因荧光强度的标准化曲线对ZNF545基因分别建立甲基化程度为100%的阳性质控品与甲基化程度为0%的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为0 : 1、1 3、1 1、3 1、1 0混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对标准品进行PCR扩增，检测所述标准品PCR扩增的产物中的第一荧光标记物和第二荧光标记物的荧光强度；其中，第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N,以N/M为纵坐标，标准品的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程；步骤ニ 待测样品ZNF545基因甲基化定量检测抽提待测样本的血液基因组DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP，以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增后的产物中的第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号強度，第一荧光标记物的信号强度为Ml，第二荧光标记物的信号强度为NI ；步骤三、 将N1/M1代入步骤ー的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。本发明还提供了另ー种ZNF545基因甲基化定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一、建立ZNF545基因荧光强度的标准化曲线对ZNF545基因分别建立甲基化程度为100%的阳性质控品与甲基化程度为0%的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为0 : 1、1 3、1 1、3 1、1 0混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对标准品进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物JfPCR扩增产物加入到固定有亲和素的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素的作用固定到酶标板上，用酶标仪測量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号強度；
其中,第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N, 以N/M为纵坐标，标准品中的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程；步骤ニ 待测样品ZNF545基因甲基化定量检测抽提待测样本的血液基因组DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物；将PCR扩增产物加入到固定有亲和素的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素的作用固定到酶标板上，用酶标仪测量第一突光标记物和第二突光标记物的信号强度，第一突光标记物的信号强度为Ml,第ニ突光标记物的信号强度为NI ；步骤三、将N1/M1代入步骤(I)的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。优选地，所述的建立ZNF基因阳性质控品的过程为培养乳腺癌细胞系MB231细胞，提取MB231细胞基因组DNA，对提取的基因组DNA进行亚硫酸 氢盐转化处理，以ZNF545基因作为目的片段对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后与载体连接，转化到E. coli DH5a感受态细胞中，对重组阳性克隆进行测序，挑选CG位点没有改变的序列作为阳性质控品。优选地，所述的建立ZNF基因阴性质控品的过程为培养正常永生代细胞系HEK293细胞，提取HEK293细胞基因组DNA，对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理，以ZNF545基因作为目的片段对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后与载体连接，转化到E. coli DH5a感受态细胞中，对重组阳性克隆进行测序，挑选CG位点全部变为TG的序列作为阳性质控品。优选地，所述的ZNF基因的PCR扩增引物序列为上游引物5-TTATAGGGTTTTTTAGTTGGTAT-3’(SEQ ID No 4)；下游引物5’-CCTCTCTCTTTACCCCCTAA-3’ (SEQ ID No :5)。优选地，所述的第一荧光标记物为FITC。优选地，所述的第二荧光标记物为Cy5。优选地，所述的PCR扩增的反应条件为起始95°C 5min ;然后95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，进行40个循环；最后72°C IOmin0优选地，所述的第三标记物为生物素。本发明的有益效果在于，第一，本发明的甲基化定量检测的方法不受甲基化位点的影响，快速，准确的对基因甲基化进行定量；第二，本发明的灵敏度较高，只需要微量的DNA样品就可进行检測；第三，本发明无需设计特异性探针或特异性引物，方法简便易行，所采用的技术简单易于实现，成本低。
图1是实施例1中ZNF545基因荧光强度的标准化曲线。
具体实施例方式ZNF545基因的序列如SEQ ID No :1所示，ZNF545基因CpG位点较多，针对每个CpG设计探针的难度较大。本发明的ZNF基因甲基化定量检测方法，步骤如下步骤一、建立ZNF545基因荧光强度的标准化曲线对ZNF545基因分别建立甲基化程度为100%的阳性质控品与甲基化程度为0%的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为0 : 1、1 3、1 1、3 1、1 0混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对标准品进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物JfPCR扩增产物加入到固定有亲和素的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素的作用固定到酶标板上，用酶标仪測量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度；其中,第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N,以N/M为纵坐标，标准品中的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程；步骤ニ 待测样品ZNF545基因甲基化定量检测(1)抽提待测样本的血液基因组DNA ；(2)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物；将PCR扩增产物加入到固定有亲和素的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素的作用固定到酶标板上，用酶标仪测量第一突光标记物和第二突光标记物的信号强度，第一突光标记物的信号强度为Ml,第ニ突光标记物的信号强度为NI ；步骤三、将N1/M1代入步骤(I)的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。待测样本基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后甲基化的CpG位点上的C保留，其它位点的C都被转化为U，在DNA复制的过程中变为T，也就是说，亚硫酸氢盐处理后ZNF基因中核苷酸C的数量与CpG甲基化的数量相同，第二荧光标记物标记的dCTP会在PCR过程中进入甲基化的CpG位点，还会与DNA序列中的G配对，由于整个DNA序列中的G含量是确定的，因此导致第二荧光标记物强度差异的主要为甲基化CpG位点的数量差异，因此，用第二突光标记物的信号强度(N)直接表征甲基化CpG的含量,第一突光标记物的信号强度(M)表征DNA的含量，N/M表征甲基化程度。进ー步，在未带荧光标记的另ー引物上标记可用于亲和吸附的标记如biotin，PCR扩增产物中的亲和素与含有亲和素受体的酶标板结合，固定到酶标板上，不仅可以进行PCR扩增后纯化，还可用荧光酶标仪直接測定第一荧光标记物和第二荧光标记物的荧光强度。下面结合附图和实施例对本发明做进ー步阐述。实施例1(一)、ZNF545基因阳性和阴性质控品的制备1、甲基化程度为100%的ZNF545基因阳性质控品的制备1、培养乳腺癌细胞系MB231细胞，按照下述实验方法(I)所述的方法提取MB231细胞(简称为MB231)基因组DNA ；i1、按照下述实验方法(2)所述的方法对MB231基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理；ii1、对步骤ii中所得DNA进行PCR扩增，引物为针对ZNF545基因设计的特异性引物，具体信息如下上游引物5-TTATAGGGTTTTTTAGTTGGTAT-3’(SEQ ID No 4)； 下游引物5，-CCTCTCTCTTTACCCCCTAA-3’(SEQ ID No :5)按照表I的ZNF545基因扩增PCR反应体系和表2的反应条件进行PCR扩增，得到ZNF545基因，用Invitrogen公司的pCR_T0P04连接试剂盒将PCR产物连接后转化E. coliDH5 a感受态细胞，接种到含有抗生素的LB固体培养基上，于37°C培养箱中培养12h ；表1ZNF545基因扩增PCR反应体系
权利要求
1.一种ZNF545基因甲基化定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、建立ZNF545基因甲基化的标准化曲线 对ZNF545基因分别建立甲基化程度为IOO %的阳性质控品与甲基化程度为O %的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为O : 1、1 3、1 1、3 1、1 O混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对标准品进行PCR扩增，检测所述标准品PCR扩增的产物中的第一荧光标记物和第二突光标记物的突光强度； 其中，第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N ； 以N/M为纵坐标，标准品的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程； 步骤二 待测样品ZNF545基因甲基化定量检测 抽提待测样本的血液基因组DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP，以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增后的产物中的第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M1，第二荧光标记物的信号强度为NI ； 步骤三、将N1/M1代入步骤一的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。
2.—种ZNF545基因甲基化定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、建立ZNF545基因甲基化的标准化曲线 对ZNF545基因分别建立甲基化程度为100%的阳性质控品与甲基化程度为0%的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为O : 1、1 3、1 1、3 1、1 O混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对标准品进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物；将PCR扩增产物加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度； 其中，第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N, 以N/M为纵坐标，标准品中的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程；步骤二 待测样品ZNF545基因甲基化定量检测 抽提待测样本的血液基因组DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物；将PCR扩增产物加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上，用酶标仪测量第一突光标记物和第二突光标记物的信号强度，第一突光标记物的信号强度为M1，第二荧光标记物的信号强度为NI ； 步骤三、将N1/M1代入步骤(I)的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。
3.根据权利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的建立ZNF基因阳性质控品的过程为 培养乳腺癌细胞系MB231细胞，提取MB231细胞基因组DNA，对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理，以ZNF545基因作为目的片段对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后与载体连接，转化到E. coli DH5a感受态细胞中，对重组阳性克隆进行测序，挑选CG位点没有改变的序列作为阳性质控品。
4.根据权利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的建立ZNF基因阴性质控品的过程为 培养正常永生代细胞系HEK293细胞，提取HEK293细胞基因组DNA，对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理，以ZNF545基因作为目的片段对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后与载体连接，转化到E. coli DH5a感受态细胞中，对重组阳性克隆进行测序，挑选CG位点全部变为TG的序列作为阳性质控品。
5.根据权利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的ZNF基因的PCR扩增引物序列为 上游引物5-TTATAGGGTTTTTTAGTTGGTAT-3’ ； 下游引物5’ -CCTCTCTCTTTACCCCCTAA-3’。
6.根据权利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的第一荧光标记物为FITC。
7.根据权利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的第二突光标记物为Cy5。
8.根据权利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件为起始95°C 5min ;然后95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，进行40个循环；最后 72 °C IOmin。
9.根据权利要求2所述的ZNF基因甲基化定量检测方法，其特征在于，所述的第三标记物为生物素。
全文摘要
本发明公开了一种ZNF545基因甲基化的定量检测方法，将第一荧光标记物引入到上游引物或下游引物中，将第二荧光标记物引入到dCTP底物中，在PCR扩增过程中同时将两种荧光标记物标记到待测样品中ZNF545基因序列中，在建立荧光强度标准化曲线后，可根据两种荧光标记物的信号强度比值来定量检测待测样品中ZNF545基因的甲基化程度。本发明的甲基化定量检测的方法不受甲基化位点的影响，快速，准确的对基因甲基化进行定量；灵敏度较高，只需要微量的DNA样品就可进行检测；无需设计特异性探针或特异性引物，方法简便易行，所采用的技术简单易于实现，成本低。
文档编号G01N21/64GK103031372SQ201210284720
公开日2013年4月10日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者蔡林涛, 王朝晖, 龚萍, 苏献伟, 石碧华 申请人:深圳先进技术研究院