甲基化dna检测方法

甲基化dna检测方法
【专利摘要】甲基化DNA检测方法。本申请公开了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法，所述方法包括用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段；将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段；环化所述单链DNA片段；将所述环化的单链DNA片段制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。本申请还公开了检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒，以及环化试剂在制备检测DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途。
【专利说明】
甲基化DN A检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及检测特定基因组位置的DNA甲基化的方法。
【背景技术】
[0002] 在真核生物的DNA中，部分胞嘧啶会发生甲基化，从而产生甲基化的DNA。研究表 明，DNA的甲基化可能对DNA的功能有重大影响，特别是DNA甲基化可能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。例如，基因启动 子序列的甲基化一般会抑制该基因的表达。在一些研究中发现，DNA甲基化对生物的正常发 育是必需的。在另一些研究中发现，DNA甲基化同基因印记，X染色体失活，以及重复元件的 抑制有关。特别的，一些研究中发现，DNA甲基化和肿瘤产生相关。
[0003] 基因的启动子区或末端通常会存在一些富含"CG"核苷酸对(其中G紧随C后，两个 核苷酸之间通过磷酸酯键相连，因此称为"CpG"）的区域。在哺乳动物的DNA中，60%~90% 的CpG序列被甲基化（Ehrlich等，1982，Amount and distribution of 5-methyl-cytosine in human DNA from different types of tissues or cells,Nucleic Acids Research 10(8) :2709-21)。当基因的表达调控区中某些区段富含CpG(CpG序列出现频率远高于平均） 时，将该区段称为CpG岛。研究表明，肿瘤细胞的DNA中发现部分基因的表达调控区发生了在 正常情况下非甲基化或低甲基化的CpG岛甲基化程度明显增高的情况，抑制了一些基因（例 如，抑癌基因）的表达。而另一方面，肿瘤细胞的DNA中还发现有部分基因的表达调控区发生 CpG岛的甲基化程度降低的情况，使这些基因（例如，致癌基因）表达异常。因此，通过研究 DNA片段特定基因组位置的甲基化情况可以获取关于肿瘤的重要信息。
[0004] 肿瘤细胞在人体内会因为细胞凋亡、免疫反应等原因释放其基因组DNA至血液中。 正常组织也会将正常的基因组DNA释放至血液中。这些血浆中存在的DNA统称为细胞外游离 DNA(Cell-free DNA，cfDNA)，而其中的来自肿瘤细胞的部分则被称为循环肿瘤DNA (Circulating Tumor DNA，ctDNA)。检测ctDNA中的甲基化DNA对肿瘤的早期诊断很有帮助。 但是，由于ctDNA在cfDNA中的丰度极低，这要求检测ctDNA中甲基化DNA的方法有极高的灵 敏度。因此，需要一种具有高灵敏度和准确性的检测DNA片段的特定基因组位置的甲基化的 方法。

【发明内容】

[0005] 本发明的一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置 的甲基化的方法。在一些实施方式中，该方法包括以下步骤:用亚硫酸氢钠处理包含特定基 因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿 嘧啶；将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段;环化所述单链DNA片段； 将所述环化的单链DNA片段制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测 序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。
[0006] 在一些实施方式中，在变性处理前在所述DNA片段一端或两端加上接头。在一些实 施方式中，在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或两端加上接头。在一些实施方式 中，所述接头可耐受亚硫酸氢盐。在一些实施方式中，所述接头包括DNA分子标签。在一些实 施方式中，其中所述接头包括第二类限制性内切酶位点。在一些实施方式中，所述第二类限 制性内切酶选自下组:HpaII/MspI、SmaI/XmaI、BamHI、HpaII。
[0007] 在一些实施方式中，使用高效环化试剂环化所述单链DNA片段。在一些实施方式 中，所述高效环化试剂为单链DNA连接酶。在一些实施方式中，所述单链DNA连接酶是 CircLigase。
[0008] 在一些实施方式中，在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行 磷酸化处理和对3 '末端进行去磷酸化处理。
[0009] 在一些实施方式中，在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割 得到的 DNA 片段大小为 0.1-5kb、0.1-lkb、l-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-lkb 或0.1-0.5kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置。
[0010]在一些实施方式中，所述的方法中的将环化的单链DNA片段制备为DNA测序文库的 步骤包括:在所述环化步骤后扩增环化的所述单链DNA片段，并且获得由包含所述特定基因 组位置的DNA的扩增产物组成的所述DNA测序文库。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使 用反向PCR扩增。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用滚环扩增。在一些实施方式中，所 述接头包含与扩增步骤使用的引物部分或全部互补的序列。在一些实施方式中，所述测序 步骤使用高通量DNA测序技术测定所述DNA测序文库的序列。
[0011]在一些实施方式中，所述的方法中的将环化的单链DNA片段制备为DNA测序文库的 步骤进一步包括:在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集所述扩增产物。
[0012] 在一些实施方式中，包含在所述样品中的DNA为细胞外的游离DNA。在一些实施方 式中，在所述细胞外的游离DNA中包含循环肿瘤DNA。
[0013] 本发明的另一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位 置的甲基化的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包括:亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠以 使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶;环化试剂，所述环化试剂能够将单链DNA 片段环化;测序试剂。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括切割试剂，其可用于在亚硫 酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.1-5此、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0·2-0·4kb、0·5-1kb或0·1-0·5kb。
[0014] 在另一些实施方式中，该试剂盒进一步包括扩增试剂，其可用于扩增包含特定基 因组位置的单链环状DNA。在一些实施方式中，所述扩增试剂包括DNA聚合酶、反应溶液和 dNTPs〇
[0015] 在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括接头连接试剂，其可用于在变性处理前、 或者在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或两端加上接头序列。在一些实施方式中， 所述接头连接试剂包括接头序列DNA片段、连接酶、反应溶液。
[0016] 在一些实施方式中，所述环化试剂为高效环化试剂。在一些实施方式中，所述高效 环化试剂为单链DNA连接酶。在一些实施方式中，所述单链DNA连接酶是CircLigase。在一些 实施方式中，所述环化试剂进一步包括T4 PNK，其可用于对DNA片段进行5 '末端进行磷酸化 处理和3 '末端进行去磷酸化处理。
[0017]本发明的再一个方面提供了一种环化试剂在制备检测包含DNA的样品中DNA片段 的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途，其中所述检测包括以下步骤：用亚硫酸氢 钠处理包含特定基因组位置的所述DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲 基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段； 环化所述单链DNA片段;DNA测序。
[0018] 在一些实施方式中，所述检测进一步包括在所述环化步骤后扩增环化的所述单链 DNA片段，并且所述测序步骤为测定扩增产物的序列。
[0019] 在一些实施方式中，所述检测进一步包括在变性处理前在所述DNA片段一端或两 端加上的DNA接头序列。在一些实施方式中，所述检测进一步包括在经亚硫酸氢钠处理前在 所述DNA片段一端或两端加上的接头序列。
[0020] 在一些实施方式中，所述检测进一步包括在将所述单链DNA片段环化前，对所述 DNA片段的5 '末端进行磷酸化处理和对3 '末端进行去磷酸化处理。
[0021] 在一些实施方式中，所述检测进一步包括在测序步骤前使用寡核苷酸探针富集包 含DNA片段的特定基因组位置的扩增产物。
【附图说明】
[0022] 通过下面说明书和所附的权利要求书并与附图结合，将会更加充分地描述本申请 内容的上述和其他特征。可以理解，这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式，因此不 应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图，本申请内容将会得到更加明确和详细 的说明。
[0023]图1:亚硫酸氢钠处理原理示意图；
[0024] 图2:单链DNA环化处理示意图；
[0025] 图3:反向PCR扩增包含甲基化位点的序列的示意图；
[0026] 图4:滚环扩增包含甲基化位点的序列的示意图。
【具体实施方式】
[0027]本发明的一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置 的甲基化的方法。
[0028]本发明中使用的术语"DNA"即脱氧核糖核酸，是组成遗传指令的长链聚合物生物 大分子。DNA的组成单位是核苷酸，DNA中的每个核苷酸由含氮碱基、五碳糖(2-脱氧核糖)和 磷酸基团组成。相邻的核苷酸通过脱氧核糖和磷酸形成酯键相连从而组成长链骨架组成。 DNA的核苷酸中的含氮碱基一般有四种，分别为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)、胸腺嘧 啶（T)。两条DNA长链上的碱基通过氢键配对，其中腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶（T)配对，鸟嘌呤 (G)和胞嘧啶(C)配对。
[0029]本发明中使用的术语"包含DNA的样品"是指任何包含DNA片段的样品，其中包括但 不限于细胞、组织、体液等。在一些实施方式中，所述包含DNA的样品为细胞，例如细菌(包含 病毒)或动植物细胞等。在另一些实施方式中，所述包含DNA的样品为体液，例如血液、血浆、 血清、唾液、羊水穿刺液、胸腔积液、腹腔积液等。在一些特定的实施方式中，所述包含DNA的 样品为血液、血清或血浆。在一些特定的实施方式中，包含在所述样品中的DNA为细胞外的 游离DNA(cfDNA)。在一些优选的实施方式中，包含在所述样品中的DNA为循环肿瘤DNA (ctDNA)〇
[0030] "细胞外的游离DNA"是指在循环系统(例如，血液）中发现的游离于细胞外的DNA。 其来源一般认为是由于细胞凋亡过程中释放的基因组DNA。研究发现，人体内绝大部分的细 胞外的游离DNA的大小在 160bp左右（参见Fan et al.，（2010)Analysis of the Size Distributions of Fetal and Maternal Cell-Free DNA by Paired-End Sequencing, Clin Chem 56:81279-86)。
[0031] "循环肿瘤DNA"是指来源于肿瘤细胞的细胞外游离DNA。肿瘤细胞在人体内会因为 细胞凋亡、免疫反应等原因释放其基因组DNA到血液中。由于正常细胞也同样会将其基因组 DNA释放到血液中，因此，一般情况下，循环肿瘤DNA只占细胞外游离DNA的很小一部分。 [0032]本发明中使用的术语"DNA甲基化"是指一种表观遗传的修饰方式。在真核生物中， DNA的甲基化仅发生于胞嘧啶，具体是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，将甲基基团转 移到胞嘧啶的上，使得胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种修饰。研究表明，DNA的甲基 化对DNA的功能有重大影响，特别是DNA甲基化可能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及 DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。例如，基因启动子序列的甲基化一 般会抑制该基因的表达。在一些研究中发现，DNA甲基化对生物的正常发育是必需的。在另 一些研究中发现，DNA甲基化同基因印记，X染色体失活，以及重复元件的抑制有关。特别的， 一些研究中发现，DNA甲基化和肿瘤产生相关。
[0033]本发明中所述的"DNA片段的特定基因组位置"泛指一切目标检测位置。在一些优 选的实施方式中，所述DNA片段的特定基因组位置是指CpG富集的区域，特别是CpG岛区域。 在另一些优选的实施方式中，所述DNA片段的特定基因组位置是指其甲基化程度与疾病(例 如肿瘤、炎症、出生缺陷等)有关的CpG岛区域。
[0034]在一些实施方式中，所述检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基 化的方法包括以下步骤:用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢 钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶;将经亚硫酸氢钠处理过的所 述DNA片段变性为单链DNA片段;环化所述单链DNA片段;将所述环化的单链DNA片段制备为 包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链 DNA片段的序列。
[0035]本发明中所述的"亚硫酸氢钠处理"是指利用亚硫酸氢钠处理目标DNA片段，使得 目标DNA片段中未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。具体 地，在一定的温度和pH条件下，利用亚硫酸氢钠将变性DNA(单链DNA)中的胞嘧啶转化为胞 嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物，对胞嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物进行水解脱氨基，得到尿嘧啶-亚硫 酸氢盐衍生物，最后，在一定条件下将尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物脱磺酸基得到尿嘧啶;在 此反应中只有未甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理下才会发生碱基变化，甲基化的胞嘧啶 仍然保持不变。
[0036]在一些实施方式中，若起始的DNA片段>5kb，则所述检测包含DNA的样品中DNA片段 的特定基因组位置的甲基化的方法进一步包括在亚硫酸氢盐处理前对所述DNA片段进行切 割处理(包括但不限于机械打断、使用特定的限制性内切酶进行酶切等），使得切割得到的 DNA片段大小适合后续处理，所述适合后续处理的DNA片段大小为0. l-5kb、0. l-lkb、l-2kb、 2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-lkb或0.1-0.5kb，并且使得所述切割得到的DNA 片段 包含所述特定基因组位置（目标检测位置）。在一些实施方式中，若起始的DNA片段>0.5kb， 则需要在亚硫酸氢盐处理前对所述DNA片段进行切割处理，切割得到的DNA片段大小为O.l-OJktKO.lUklKO.l-OjklKOJ-O.SklKOJ-OjklKOJ-O.SklKO.S-OjklKO.S-O.Skb、 0.4-0.5吐或0.1-0.51*。
[0037]本发明中所述的"将DNA片段变性为单链DNA的方法"是指本领域技术人员公知的 任何方法，包括但不限于热变性(例如高于90°C)、碱(例如NaOH)处理等。
[0038]在一些实施方式中，在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割 得到的 DNA 片段大小为 0.1-5kb、0.1-lkb、l-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-lkb 或0.1-0.5kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置。
[0039]在一些实施方式中，包含在所述样品中的DNA为细胞外的游离DNA。在一些实施方 式中，包含在所述细胞外的游离DNA优选地为循环肿瘤DNA。
[0040] 在一些实施方式中，在变性处理前在所述DNA片段一端或两端加上DNA接头。在另 一些实施方式中，在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或两端加上接头。在一些实施 方式中，所述接头可耐受亚硫酸氢盐处理。
[0041] 本发明中所述的"接头"是指根据需要在DNA片段(单链或双链)的一端或两端附加 的特异性DNA序列，其通常在5-50bp长度范围内。在一些实施方式中，在DNA片段为双链的情 况下，可以通过设计在单链接头中包含与DNA片段的末端连接的序列或部分(例如杂交互补 区、或者随机杂交短序列，例如P〇ly-T)，之后通过将所述接头与目标DNA片段的互补链进行 分子杂交，并且在杂交后通过加入聚合酶(如逆转录酶)来延伸接头将所述接头连接至目标 DNA片段的末端。在另一些实施方式中，在DNA片段为双链并且DNA片段末端为粘性末端的情 况下，可以设计接头序列并利用与接头互补的序列与其退火互补形成具有粘性末端的结 构，之后通过连接酶将该互补短序列连接至目标DNA双链上，在后续过程中使DNA变性形成 单链，从而达到在DNA片段末端加上接头的目的。在又一些实施方式中，在DNA片段为单链的 情况下，可以对DNA片段及接头序列进行磷酸化、去磷酸化处理，后利用单链连接酶将接头 序列连接至DNA片段的末端。
[0042]本发明中所述的"可耐受亚硫酸氢盐"是指所述接头中不含胞嘧啶或者不含未甲 基化的胞嘧啶，从而在DNA片段经亚硫酸氢钠处理时，所述接头的序列不发生改变。
[0043]在一些实施方式中，所述在DNA片段一端或两端加上的接头包含第二类限制性内 切酶位点。本发明中所述"第二类限制性内切酶"是指能识别和切割特定的4~8个碱基对序 列的内切酶，其中大多数被识别的序列具有回文结构；第二类限制性内切酶的切割方式有 三种：1)切割产生5 '突出的粘性末端（sticky ends)，2)切割产生3 '突出的粘性末端，3)切 割产生平头末端(blunt ends)。本发明中所述"第二类限制性内切酶位点"包括本领域技术 人员公知的任何第二类限制性内切酶位点，包括但不限于：ApaI、BamHI、BglII、Ec 〇RI、 HindiII、HpaII、KpnI、MspI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、SacI、SalI、SmaI、SphI、XbaI、XhoI、 Xmal。在一些实施方式中，所述第二类限制性内切酶选自下组:HpaII、MspI、SmaI、XmaI、 BamHI。在一些实施方式中，在所述DNA片段两端均加上接头，并且两端加上的限制性内切酶 位点接头是相同的。例如，在一些实施方式中在所述DNA片段两端均加上选自下组中的任意 一种限制性内切酶位点接头:HpaII、MspI、Smal、XmaI、BamHI。在另一些实施方式中，在所述 DNA片段两端均加上接头，并且两端加上的限制性内切酶位点接头是不同的。例如，在一些 实施方式中在所述DNA片段两端加上选自Hpall、MspI、SmaI、XmaI、BamHI中的任意两种限制 性内切酶位点接头的组合，例如:Hpa II /Msp I、Sma I /Xma I的组合等。
[0044]在一些实施方式中，所述在DNA片段一端或两端加上的接头包含DNA分子标签。本 发明中使用的术语"分子标签"是指一段用于作为标签的序列，其可被连接至所述DNA片段 的5'端或者3'端。在DNA测序中，特别是在高通量测序技术中，分子标签被用以标记特定的 序列，在经过扩增、测序后可以根据标签序列的计数来确定被标记基因的表达量。
[0045] 本发明中所述的"环化单链DNA片段的方法"是指本领域技术人员公知的任何方 法，包括但不限于使用高效环化试剂环化单链DNA。在一些实施方式中，所述高效环化试剂 环化是DNA连接酶。在一些实施方式中，所述DNA连接酶是单链DNA连接酶（例如但不限于 CircLigase?ssDNA Ligase，Epicentre科技公司），其是一种热稳定的、APT依赖的连接酶， 其能够催化单链DNA的5 ' -磷酸和3 ' -羟基基团的连接，从而使单链DNA环化。 CircLigase?ssDNA Ligase与T4 DNA Ligase和 Ampligasc?DNA Ligase不同，T4 DNA Ligase和AmpligaseK DNA Ligase仅能够连接彼此相邻的互补的DNA序列的末端，而 CircLigase?ssDNA Ligase可以在没有互补序列存在的情况下连接单链DNA末端，大于15个 碱基的线性单链DNA，包括cDNA，均可被CircLigase环化。因此，该酶在将线性单链DNA连接 成环状单链DNA中具有重要作用。环状的单链DNA分子可被用作滚环复制或滚环转录研究的 底物。
[0046] 在一些实施方式中，在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行 磷酸化处理和对3 '末端进行去磷酸化处理。所述5 '末端的磷酸化和3 '末端的去磷酸化可以 通过本领域技术人员公知的任何方法进行，包括但不限于利用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK) 催化。T4 PNK是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链 DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他ΝΤΡ也可产生相同的 反应:5 '-OH+NTP-5 '-P+NDP。T4 PNK同时具有3 '磷酸酯酶活性，可催化3 '磷酸化的多聚核 苷酸的去磷酸化:3 ' -P-3 ' -ΟΗ+Pi (最适pH为5.9左右）J4 PNK的激酶活性在C-末端附近， 而磷酸酯酶活性在N-末端附近，因此可用于使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化和/或去除 3 '端磷酸基团，以确保后续连接反应顺利进行。
[0047]本发明中所述的"DNA测序文库"是指丰度达到可测序的程度的DNA片段集合，其中 所述DNA片段集合中每条片段的一端或两端包含与测序用引物部分或全部互补的特定序 列，从而可以直接用于后续的测序上机。
[0048]在一些实施方式中，将环化的单链DNA片段制备为DNA测序文库的步骤包括:在所 述环化步骤后扩增环化的所述单链DNA片段，并且获得由包含所述特定基因组位置的DNA的 扩增产物组成的所述DNA测序文库。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用反向PCR扩增。 在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用滚环扩增。在一些实施方式中，将环化的单链DNA 片段制备为DNA测序文库的步骤包括在扩增产物的一端或两端加上可用于测序的接头序 列。在一些实施方式中，在变性处理前、或者在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或 两端加上接头。在一些实施方式中，所述在DNA片段一端或两端加上的接头包含与扩增步骤 使用的引物部分或全部互补的序列。
[0049]本发明所述的"反向PCR"是指在已知一段序列的情况下，通过基于该已知序列设 计引物，并且在引物外侧合成DNA从而达到扩增已知序列旁侧的DNA的目的。在本发明的一 些实施方式中，反向PCR中的已知序列为所述DNA片段的特定基因组位置中的一段已知序 列。在本发明的另一些实施方式中，反向PCR中的已知序列可以为前述的在DNA片段两端加 上的接头的部分或全部。
[0050] 本发明所述的"滚环扩增"是指一条引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下 被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状DNA单链。同样的，在本发明 的一些实施方式中，滚环扩增中的引物可以是针对所述DNA片段的特定基因组位置中的一 段已知序列的。或者，在本发明的另一些实施方式中，滚环扩增中的引物可以包括与前述的 在DNA片段两端加上的接头的部分或全部互补的序列。
[0051] 在一些实施方式中，所述测序步骤使用高通量DNA测序技术测定所述扩增产物的 序列。
[0052] 经亚硫酸氢钠处理后的DNA在测序时，或者上述经亚硫酸氢钠处理后的DNA在经扩 增后(例如经反向PCR扩增或者滚环扩增后），由未甲基化的胞嘧啶(C)转化的尿嘧啶(U)将 转变为胸腺嘧啶(T)。通过对经亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序并将测序结构与未被亚 硫酸氢盐处理的DNA片段的序列（已知序列或者通过对未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行 测序得到的测序结果)进行比较，可以确定DNA片段中的特定基因组位置的甲基化情况，具 体地可以通过在序列比对结果发现具有由C到T的转变的位置即为未被甲基化的位置。 [0053]在一些实施方式中，所述的方法中的将环化的单链DNA片段制备为DNA测序文库的 步骤进一步包括:在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集所述扩增产物。本发明中所述的"使 用寡核苷酸探针富集包含所述特定基因组位置的DNA的扩增产物"的步骤可以通过本领域 技术人员公知的任何方法完成，例如但不限于磁珠富集、标签pu 11 -down等。
[0054] 本发明的另一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位 置的甲基化的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包括:亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠以 使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶;环化试剂，所述环化试剂可以将单链DNA 片段环化;测序试剂。
[0055] 在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括切割试剂，其可用于在亚硫酸氢钠处理 前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小适合后续处理，所述适合后 续处理的 DNA 片段大小为 0·l-5kb、0·l-lkb、l-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0·l-0·5kb、0·5-lkb或0.2-0.4kb，并且使得所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置（目标检测位 置）。在一些实施方式中，所述切割试剂为盐溶液。在一些实施方式中，所述切割试剂为TE溶 液(需要配合使用不包含在试剂盒内的DNA机械打断仪器）。在另一些实施方式中，所述切割 试剂为内切酶(或内切酶及其反应溶液）。
[0056] 在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括扩增试剂，其可用于扩增包含特定基因 组位置的单链环状DNA。在一些实施方式中，所述扩增试剂包括DNA聚合酶、反应溶液和 dNTPs。在一些实施方式中，所述扩增试剂为反向PCR扩增试剂。在另一些实施方式中，所述 扩增试剂为滚环扩增试剂。
[0057]在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括接头连接试剂，其可用于在变性处理前、 或者在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或两端加上接头序列。在一些实施方式中， 所述接头连接试剂包括接头序列DNA片段、连接酶、反应溶液。在一些实施方式中，所述接头 序列DNA片段包括选自下组的一种或几种：限制性内切酶位点序列、分子标签序列、与扩增 步骤使用的引物部分或全部互补的序列。
[0058] 在一些实施方式中，所述环化试剂为高效环化试剂。在一些实施方式中，所述高效 环化试剂为CircLigase。在一些实施方式中，所述环化试剂进一步包括T4 PNK，其可用于对 DNA片段进行5 '末端进行磷酸化处理和3 '末端进行去磷酸化处理。
[0059] 本发明的再一个方面提供了一种环化试剂在制备检测包含DNA的样品中DNA片段 的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途，其中所述检测包括以下步骤：用亚硫酸氢 钠处理包含特定基因组位置的所述DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理可以使得DNA片段中未甲 基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段； 环化所述单链DNA片段;DNA测序。
[0060] 在一些实施方式中，所述检测进一步包括在所述环化步骤后扩增环化的所述单链 DNA片段，并且所述测序步骤为测定扩增产物的序列。
[0061 ]在一些实施方式中，所述检测进一步包括在变性处理前、或者在经亚硫酸氢钠处 理前在所述DNA片段一端或两端加上的接头序列。
[0062]在一些实施方式中，所述检测进一步包括在将所述单链DNA片段环化前，对所述 DNA片段的5 '末端进行磷酸化处理和对3 '末端进行去磷酸化处理。
[0063] 在一些实施方式中，所述检测进一步包括在测序步骤前使用寡核苷酸探针富集包 含特定基因组位置DNA片段的的扩增产物。
[0064] 实施例
[0065] 以下将通过一些非限制性实施例进一步描述本发明。需要说明的是这些实施例仅 用于进一步说明本发明的技术特征，并非旨在也不能够被解释为对本发明的限制。所述实 验例不包含本领域一般技术人员所公知的传统方法(不同种类样本中DNA的提取、纯化等） 的详细描述。
[0066] 亚硫酸氢钠处理
[0067] 首先，通过DNA提取试剂盒或者通过DNA富集工具(DNA吸附柱、磁珠等)等提取或富 集样品中包含的DNA，利用Nanodrop测量DNA浓度，并进行记录。
[0068] 取2yg DNA，用双蒸水稀释至200μ1，根据实际需求选择使用DNasd酶或者限制性 内切酶进行消化、超声打断、反复冻融等方法使上述DNA断裂为约200-800bp的片段(可选步 骤）。通常采用超声打断，使用参数为振幅40、功率50w、时间15sec、间隔5sec、次数15,0-4°C 低温下进行（超声参数可以根据实际情况进行摸索调整）。利用凝胶电泳确认经处理后的 DNA片段大小在所需范围内。
[0069] 取0.5yg的上述DNA于1.5ml EP管中，并加入5.5μ1新鲜配置的3M的NaOH溶液，将EP 管置于42 °C水浴中孵育30min(在此过程中发生DNA变性得到单链DNA)。水浴期间，配制10mM 氢醌和3.6mM亚硫酸氢钠溶液。其中3.6M的亚硫酸氢钠溶液配置步骤如下:使用双蒸水溶解 1.88g亚硫酸氢钠，并以3M的NaOH滴定溶液至pH为5.0，定容为5ml。在42°C水浴孵育30min结 束后，取30μ1上述10mM氢醌至EP管中（溶液变成淡黄色），之后再取520μ1上述3.6M的亚硫酸 氢钠溶液加入ΕΡ管中。在ΕΡ管外包上铝箱纸，轻柔颠倒混匀溶液，之后在ΕΡ管中加入200μ1 石蜡油封液，以防止水分蒸发。将上述ΕΡ管进一步置于50°C水浴中避光孵育16hr(完成胞嘧 啶-亚硫酸氢盐衍生物至尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物的转化）。之后利用市售的DNA纯化柱等 方式将包含尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物的DNA吸附于纯化柱上，经纯化洗脱后得到50μ1的 DNA洗脱液。加入5.5μ1新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min;之后加入33μ1 10M的乙酸铵以 中和NaOH，使溶液pH于7.0左右，并加入4μ1 10mg/ml的糖原作为沉淀指示剂（因为其与乙醇 混合后可产生沉淀，便于在用乙醇沉淀离心后识别回收物）；最后在溶液中加入270μ1的冰 (0-4°C )无水乙醇，将ΕΡ管置于-20°C环境中2-6hr (或过夜）以沉淀DNA(对应脱磺酸基步 骤）。经沉淀的DNA可经多次70%的乙醇洗涤后干燥，再用双蒸水复溶获得经亚硫酸氢钠处 理修饰后的DNA溶液。
[0070] 在此反应中只有未甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理下才会发生碱基变化，甲基 化的胞嘧啶仍然保持不变(参见图1)。
[0071] 应当理解，上述亚硫酸氢钠处理的实验操作仅为示例性的，本领域技术人员可以 采用任何市售的亚硫酸氢钠处理试剂盒完成该步骤，其中在该步骤中使用的试剂、反应条 件、反应时间等各不相同但基本原理基本一致。
[0072] DNA 环化
[0073] 可选地，可以对上述经亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行5 '末端的磷酸化和3 '末端 的去磷酸化处理(参见附图2中虚线框中内容）。具体地，可以使用T4 PNK并依照相应的说明 书配置反应液并进行DNA片段的处理。例如，在50μ1反应体系中加入5-50pmol单链DNA模板、 5μ1的10x T4 PNK反应溶液、ΙμL的ImM ATP和10U的T4 PNK酶，定容至50μ1后将反应体系置 于37°C孵育30分钟，最后经80°C孵育10min以使得Τ4 ΡΝΚ失活。
[0074] 将经亚硫酸氢盐处理的DNA片段(经5 '末端的磷酸化和3 '末端的去磷酸化处理或 未经该处理)置于95°C孵育2min使得上述DNA片段变性为单链DNA片段。接着根据如下配方 配置反应液：l〇pmol单链DNA模板、2μ1 CircLigaselOx的反应溶液、ΙμL ImM的ΑΤΡ、1μ1 50mM的MnCl2、ΙμL CircLigase?ssDNA Ligase( 100U)，定容至20μ1。并将上述配置的反应液 置于60°C孵育1个小时。最后将反应溶液置于80°C孵育10min以使得CircLigase?ssDNA Ligase失活。（参见附图2中实线框中内容）
[0075] 环化DNA的扩增
[0076] 上述环化的DNA可以直接用于后续测序，或者当该环化的DNA丰度较低时，可以先 对其进行扩增再将扩增产物应用于后续的测序步骤中去。
[0077] 对环化DNA的扩增可以采取本领域技术人员公知的任何方法，较为常见的包括反 向扩增和滚环扩增。
[0078] 反向PCR扩增
[0079]反向PCR扩增可用于研究与已知DNA区段相连接的未知区段的序列，也可用于扩增 环状的DNA片段，其中使用的引物对虽然与已知DNA区段内的两段相邻序列互补，但两引物 3'端是相互反向的(参见附图3中的引物对：引物1和引物2、引物3和引物4;即每对引物对中 两个引物的5'端相邻）。通过反向PCR扩增引物向上下游进行延伸，从而环状DNA的线性扩增 产物(具体参见附图3)。
[0080]在反向PCR扩增中使用的反应条件与经典的聚合酶链反应所用条件的相似，例如 使用Taq聚合酶，先对DNA进行94 °C的30秒变性，之后重复58 °C引物退火30秒合70 °C延伸3分 钟的步骤30个循环。
[0081 ] 滚环扩增
[0082]可使用针对环化DNA已知的部分序列设计的引物或以针对环化DNA在环化前一端 或两端接入的接头部分序列的引物来扩增环化的DNA，以产生多拷贝的线性连接的环化DNA 的互补序列（参见附图4)。在滚环扩增中使用的反应条件也与经典的聚合酶链反应所用条 件的相似，在此不做赘述。
[0083] DNA片段的接头
[0084]在环化前，或者在亚硫酸氢盐处理前，可以根据需要将特异性序列结合到DNA片段 (单链或双链)的一端或两端，被加到DNA片段两端的特异性序列分别称为第一接头和/或第 二接头。
[0085] 在一个实施方案中，第一接头含有能使其与DNA片段的末端连接的序列或部分(例 如杂交互补区、或者随机杂交短序列，例如poly-T)，则可通过与目标DNA片段的互补链进行 分子杂交，并且在杂交后通过加入聚合酶(如逆转录酶)来延伸该第一接头将所述第一接头 连接至目标DNA片段的末端(在此情况下，目标DNA片段处于双链状态下）。
[0086] 在另一个实施方案中，第一接头可选择地可以包含能用于后续环化、扩增的其它 特定的序列。不限于上述概念，这种特定的序列可能包含有限制性内切核酸酶位点、聚合酶 结合位点、聚合酶终止位点、发夹环结构等。例如，该接头可含有限制性内切酶位点，借此可 在DNA的一端或两端产生粘性末端。如果DNA片段两端均连接了能够产生粘性末端的接头， 并且这两个粘性末端是互补的，则所得到的具有接头的DNA片段可以被环化。将第一接头连 接于DNA片段。又例如，该接头可能含有与后续扩增使用的引物的部分或全部区域互补的序 列。
[0087] 在又一个实施方案中，第一接头可选择的可在其3 '端或其5'端包含分子标签或包 含特定序列。在后续的扩增中可以利用上述分子标签或特定序列对目标DNA进行特异性的 扩增。或者在后续的测序中可以利用上述分子标签或特定序列对于包含该特定序列的分子 进行特异性的富集。
[0088] 在一些特殊的实施方案中，接头可选择的可包含上述的一种或多种。
[0089] DNA 测序
[0090]使用高通量DNA测序的方法对DNA文库进行测序。测序前可以通过利用寡核苷酸探 针对目标测序DNA进行富集。
[0091] 对于DNA甲基化的测序可以基本通过对经亚硫酸氢盐处理的DNA片段、或者经扩增 的经亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序并将测序结构与未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段 的序列（已知序列或者通过对未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序得到的测序结果)进 行比较，之后通过在序列比对结果发现具有由C到T的转变的位置即可能为被甲基化的位 置。根据每个可能被甲基化的位置在多个拷贝中出现的频率评估该位置是否确实存在甲基 化。
[0092] 应当理解，尽管在上文的实施例中详细地描述了本发明公开的方法的一些具体步 骤的操作方法，但是这种描述仅仅是示例性的而并非是对本发明的限制。实际上，根据本发 明的实施例，本技术领域的一般技术人员可以通过研究说明书、公开的内容及附图和所附 的权利要求书，理解和实施对披露的实施方式的其他改变。在权利要求中，措词"包括"不排 除其他的元素和步骤，并且措辞"一"、"一个"不排除复数。
【主权项】
1. 一种用于检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法，其包括 以下步骤： 用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA 片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶； 将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段； 环化所述单链DNA片段； 将所述环化的单链DNA片段制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库； 对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在变性处理前在所述DNA片段一端或两端加上接 头。3. 根据权利要求1所述的方法，其中在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或两端 加上接头。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中所述接头可耐受亚硫酸氢盐处理。5. 根据权利要求2或3所述的方法，其中所述接头包括DNA分子标签。6. 根据权利要求2或3所述的方法，其中所述接头包括第二类限制性内切酶位点。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述第二类限制性内切酶选自下组:HpaII/MspI、 Smal/Xmal、BamHI、HpaII〇8. 根据权利要求1所述的方法，其中使用高效环化试剂环化所述单链DNA片段。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述高效环化试剂为单链DNA连接酶。10. 根据权利要求9所述的方法，其中在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的 5 '末端进行磷酸化处理和对3 '末端进行去磷酸化处理。11. 根据权利要求1所述的方法，其中在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处 理，使得切割得到的DNA片段大小为0.1-5处、0.1-1此、1-2此、2-3处、3-4此、4-5此、0.2- 0.41*、0.5-11*或0.1-0.51*，并且所述切割得到的0嫩片段包含所述特定基因组位置。12. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其中所述将环化的单链DNA片段制备为DNA测 序文库的步骤包括:在所述环化步骤后扩增环化的所述单链DNA片段，并且获得由包含所述 特定基因组位置的DNA扩增产物组成的所述DNA测序文库。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增的步骤使用反向PCR扩增。14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增的步骤使用滚环扩增。15. 根据权利要求12所述的方法，其中所述接头包含与扩增步骤使用的引物部分或全 部互补的序列。16. 根据权利要求12所述的方法，其中所述测序步骤使用高通量DNA测序技术测定所述 DNA测序文库的DNA序列。17. 根据权利要求12所述的方法，其中所述将环化的单链DNA片段制备为DNA测序文库 的步骤进一步包括:在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集所述扩增产物。18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的DNA包含细胞外的游离DNA，优选地， 所述细胞外游离DNA也包括循环肿瘤DNA。19. 一种用于检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒，包 括： 亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶； 环化试剂，所述环化试剂能够将单链DNA片段环化； 测序试剂。20. 根据权利要求19所述的试剂盒，其中进一步包括切割试剂，其可用于在亚硫酸氢钠 处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.1-51^、0.1-11^、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0·2-0·4kb、0·5-1kb或0·1-0·5kb。21. 根据权利要求19所述的试剂盒，其中进一步包括扩增试剂，其可用于扩增包含所述 特定基因组位置的单链环状DNA。22. 根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述扩增试剂包括DNA聚合酶、反应溶液和 dNTPs〇23. 根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述扩增试剂包括用于反向PCR扩增的试剂。24. 根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述扩增试剂包括用于滚环扩增的试剂。25. 根据权利要求19所述的试剂盒，其中进一步包括接头连接试剂，其可用于在变性处 理前、或者在经亚硫酸氢钠处理前在所述DNA片段一端或两端加上接头序列。26. 根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述接头连接试剂包括接头序列DNA片段、连 接酶、反应溶液。27. 根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述环化试剂为高效环化试剂。28. 根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述高效环化试剂为单链DNA连接酶。29. 根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述环化试剂进一步包括T4PNK，其可用于对 DNA片段进行5 '末端进行磷酸化处理和3 '末端进行去磷酸化处理。30. -种环化试剂在制备检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的 试剂盒中的用途，其中所述检测包括以下步骤： 用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的所述DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使 得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶； 将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段； 环化所述单链DNA片段； DNA测序。31. 根据权利要求30所述的用途，其中所述检测进一步包括在所述环化步骤后扩增环 化的所述单链DNA片段，并且所述测序步骤为测定扩增产物的序列。32. 根据权利要求30所述的用途，其中所述检测进一步包括在变性处理前在所述DNA片 段一端或两端加上的接头序列。33. 根据权利要求30所述的用途，其中所述检测进一步包括在经亚硫酸氢钠处理前在 所述DNA片段一端或两端加上的接头序列。34. 根据权利要求30或31所述的用途，其中所述检测进一步包括在将所述单链DNA片段 环化前，对所述DNA片段的5 '末端进行磷酸化处理和对3 '末端进行去磷酸化处理。35. 根据权利要求30所述的用途，其中所述检测进一步包括在测序步骤前使用寡核苷 酸探针富集包含特定基因组位置的DNA片段的扩增产物。
【文档编号】C12Q1/68GK105986030SQ201610077986
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年2月3日
【发明人】范建兵, 蔡绪雨
【申请人】广州市基准医疗有限责任公司