专利名称：一种快速检测dna甲基化的方法
技术领域：
本发明涉及医学生物学检测技术领域，具体是一种快速检测DNA 甲基化的方法。
背景技术：
基因的异常甲基化与肿瘤的发生、发展关系密切，在脊椎动物 中，CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在，人们 将基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛(CpGisland) 。 CpG岛常位T 转录调控区附近，DNA甲基化的研究与CpG岛的研究密不可分。甲基化 异常在W期癌、癌前病变，甚至'些良性病变中即已出现，在许多恶 性肿瘤的癌前病变中都发现了多个抑癌基因的启动子区域CpG岛卨甲 基化。据报道，胰腺癌组织中检测出多个与胰腺癌相关的基因发生异 常甲基化，如pl6基因的^常甲基化(Virmani AK， et al. Clin Cancer Res 2001; 7: 584-9 ) 、 MUC2 ( Ho JJ， et al. Int J Oncol 2003; 22: 273-9 )、 NPTX2 (SatoN， etal.CancerRes, 2003， 63: 3735-3742)等，因此 有关DNA甲基化与肿瘤发生的关系口益受到人们的重视，成为肿瘤分 子生物学研究热点之。
基因甲基化的研究有很多方法，其中敁常月:I的检测方法是Hennari 节1996年建化的甲基化特计性P(:R(meUivLaUori—specific PCR， MSP)，其基木原理足通过朴:硫酸^钠对DNA样品的修饰，使未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应，最后在氢氧化钠作用下变为尿嘧啶，而甲 基化的胞嘧啶却不能发生脱氨基反应，碱基不发生转变，这样两者的
碱基序列就不一样，然后进行引物特异性的PCR。 MSP中需设计两对引 物，并要求1、引物末端均设讣至检测位点结束；2、两对引物分别 只能与经亚硫酸氢钠处理后的序列互补配对，其中一对结合处理后的 甲基化DNA链，另一对结合处理后的未甲基化DNA链。通过凝胶电 泳或DNA测序进一步分析PCR产物，如果使用针对处理后的甲基化 DNA链的引物能扩增出片段，说明该被检测的位点存在甲基化；如 果使用针对处理后的未甲基化DNA链的引物能扩增出片段，说明被 检测的位点不存在甲基化。
MSP法包括如下步骤.-
1、 制备待测DNA:
按常规方法取组织匀浆，用酚氯仿法(详见F.M.奥斯伯等，精编 分子生物学实验指南，北京科学出版社，2005: 46)或基因组DNA 抽提试剂盒提取DNA。
2、 DNA亚硫酸氢钠修饰
将DNA变性，成为单链DNA，使碱基充分暴露；加入终浓度为 lmol—6mo1的亚硫酸氢钠，使DNA单链上未甲基化的胞嘧啶与亚硫 酸氢钠进行修饰反应生成磺化胞嘧啶，磺化胞嘧啶在水的作用下脱氨 基生成磺化尿嘧啶;而5'-甲基化胞嘧啶不能被修饰;将修饰后的DNA 产物经过透析脱盐，用氢氧化钠脱磺化，使得磺化尿嘧啶变为尿嘧啶。DNA经修饰后，未甲基化的胞嘧啶碱基变为尿嘧啶，而甲基化的胞 嘧啶则不变。
3、 纯化
将经修饰后的DNA用乙醇沉淀、洗涤，再溶解后作PCR模板。
4、 PCR扩增和检测分析
由于待测基因的正常核苷酸序列、胞嘧啶的数量和所在位点是明 确的，因此可设计相应的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异 性引物，以修饰后的DNA为模板，进行PCR扩增，甲基化特异性的引 物只能扩增甲基化的序列，未甲基化特异性引物只能扩增未甲基化的 序列；最后将PCR产物通过凝胶电泳或DNA测序分析，就可确定所测组 织中该基因中CpG岛的胞嘧啶甲基化程度。
具体步骤主要为
1、 制备待测DNA:按常规方法如酚氯仿法从组织中抽提DNA。
2、 DNA亚硫酸氢钠修饰
1) 、取1吗DNA，溶于20nl水中，95。C水浴10分钟，立即放于 冰浴；加入2nllOM氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA;
2) 、加入亚硫酸氢钠修饰液230ul (3M亚硫酸氢钠，10mM氢 醌，PH5.0);置于55"C避光修饰16小时，DNA被修饰，未甲基化 的胞嘧啶被修饰为磺化尿嘧啶。
3、 DNA修饰产物的纯化
1)、将上述DNA修饰产物在4X:下用双蒸水透析过夜，去除多余的亚硫酸氢钠；
2) 、脱磺化加入10MNaOH使其终浓度为0.3M，室温20分钟; 再加入等当量的1M盐酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脱磺化后成尿嘧啶；
3) 、沉淀加入四分之一体积的10M醋酸铵和2倍体积乙醇，将 DNA修饰产物置于-2(TC沉淀过夜；
4) 、洗涤13000rpm离心10分钟，弃上清，用70%酒精洗涤2 次；干燥IO分钟，加入20plTE使其溶解，得纯化的DNA修饰产物， 亦即PCR模板。
4、 PCR扩增和检测分析用设计的待测基因的正、反向甲基化特异
性引物和未甲基化特异性引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下
10x PCR buffer (without MgCb)2.5pl
MgCl2 (25mM)2nl
dNTP(2-5mM)2pl
正向引物(20jiM)0.5^1
反向引物(20pM)0.5^1
H20
模板IW
Taq酶(5u4d)0.5nl
总体积25jd反应条件如下
94匸3分钟 9420秒*
58"C 20秒35循环 72°C 15秒 72°C 5分钟
检测分析将PCR扩增产物与标准品进行凝胶电泳检测或DNA测 序分析，就可确定该基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多数基因发 生异常甲基化，则就提示该患者可能得相应的癌症。
这种传统的检测方法存在如下缺点1、操作繁琐，特别是在亚 硫酸氢钠修饰过程中，修饰反应慢，时间长，通常需要16—18小时； 2、 DNA变性成为单链后，单链上的碱基还会互相配对，有可能使 碱基暴露不充分，从而导致亚硫酸氢钠修饰不完全，实验重复性不高， 影响结果的可靠性；3、亚硫酸氢钠修饰后，透析脱盐时间也很长， 工作量大，因此制约了 MS-PCR的研究。但若采用Zymo公司生产的 DNA甲基化检测试剂盒(EZDNAMethylation-Gold Kit)，虽然操 作方便，检测时间短，但价格昂贵，且每次得到的PCR模板只能用 于2个基因的甲基化检测，限制了多基因检测的进行，不能满足多数 实验的需要。
发明内容
本发明提供一种成本低廉、检测时间短、重复性好的DNA甲基 化的检测方法。本发明的操作步骤也主要包括制备待测DNA、 DNA亚硫酸氢 钠修饰、纯化以及PCR扩增和检测分析等四步，但本发明针对传统 方法的不足做了以下三方面的改进
1、 针对亚硫酸氢钠DNA修饰时间长的不足，采用添加催化剂 TAC和盐酸胍加速修饰反应，使DNA在催化剂的作用下加快与亚硫 酸氢钠反应；
2、 修饰反应中采用多次短时间高温解链，以充分暴露DNA的 碱基，使未甲基化的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶，从而提高实验的重复 性；
，3、针对修饰后DNA纯化时繁琐的透析脱盐步骤，采用纯化柱 进行纯化，先将修饰后的DNA产物吸附于玻璃纤维膜或硅藻土或硅 胶膜制成的纯化柱il，再依次进行洗涤脱盐、去磺化处理、洗涤和 DNA洗脱，从而得到纯化的检测DNA基因甲基化的PCR模板，可 以直接用于PCR扩增，大大节省了脱盐时间。
具体步骤主要为
1、 制备待测DNA:按常规方法。
2、 DNA亚硫酸氢钠修饰
1) 、取ljigDNA，溶于20nl水中，95"C水浴10分钟；立即放于 冰浴；加入2nllOM氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA;
2) 、加入亚硫酸氢钠修饰液(5M亚硫酸氢钠，10mM氢 醌，lmMTAC ，0.3M盐酸胍，PH5.0) 230u l，混匀后分装到三个PCR管，95*€ 10秒 58"C 20分钟
每管约80—90nl;
3)、三个PCR管放入PCR仪，运行下列程序进行亚硫酸氢钠修饰
反应(约2，5小时) 95 。C 20秒
t] 7循环 Holdat4"C
由于修饰反应中的多次短时间高温解链，使碱基暴露充分，因此 DNA修饰更完全，未甲基化的胞嘧啶被修饰为磺化尿嘧啶。
3、 DNA修饰产物的纯化
(1) 、采用UNIQ-10柱进行纯化合并上述各管DNA修饰溶液， 加入lml6M盐酸胍溶液作为结合剂以利于吸附，混匀后将溶液转移 到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。8，000rpm 室温离心30秒，弃收集管中的废液，DNA被结合到柱子上；
(2) 、洗涤用洗漆缓冲液(lOmMTris， PH=6.8， 80%乙醇)洗 涤2次，每次500ji1 ， 8，000rpm室温离心30秒，弃洗涤液；
(3) 、脱磺化
1) 、脱磺化反应加入250^1脱磺化液(含30%乙醇，5%甘 油，200mMNaOH， 100mM NaCl)，进行脱磺化反应，室温放置10 分钟。8，000rpm室温离心30秒，弃收集管中的废液；
2) 、洗涤用洗涤缓冲液(同上)洗涤2次，每次500nl ， 8，000rpm 室温离心30秒，弃洗涤液；
4、 洗脱把UNIQ-IO柱放入一个新的1.5mlEP管中，加入30。C-80匸预 热的TE (lOmMTris ， PH-8.0; lmM EDTA) 35^1室温离心，收 集洗脱液，此为修饰后的DNA溶液，即PCR模板，可直接用于PCR， 也可暂时保存于-20匸备用。 5、 PCR扩增和检测分析
将纯化好的DNA修饰产物用待测基因的正、反向甲基化特异性 引物和未甲基化特异性引物进行PCR扩增。然后进行凝胶电泳分析 PCR扩增产物。
本发明与传统的方法相比检测时间短、重复性好；与剂盒相比， 成本低廉，亚硫酸氢钠修饰也更加完全，结果更加可靠，而且得到的 修饰后的DNA产量远多于试剂盒的方法，本发明可以检测不少于15 个基因，而试剂盒的DNA产量仅够检测2个基因。
图1为木发明检测肝癌标本pl6基因甲基化的凝胶电泳图谱； 图2为用本发明方法和传统方法、Zymo公司甲基化试剂盒方法 检测肝癌GSTP1基因甲基化的凝胶电泳对比图谱。
具体实施例方式
下面以检测肝癌标本中pl6基因和GSTPl基因为例对本发明作详 细说明，但本实施例仅用于i;围。
主要仪器及试剂来源
Eppendorf Model 5415R， CentrifUges低温微高速离心机，英国 TECHNE公司产品；TC-512梯度PCR仪，英国Techne公司产品； FR-200A全自动紫外与可见分析装置，上海复日科技有限公司公司产 品；亚硫酸氢钠购自国药集团，盐酸胍购自国药集团，氢醌购自上海 生工生物工程技术服务有限公司。
实施例l用本发明方法检测肝癌标本中pl6基因的甲基化情况
待测样品取自上海东方肝胆医院3位肝癌患者的个体样本。p16 基因在肝癌中已被证明发生高甲基化(Naoyuki Umetani， Michiel F.G. de Maat， Eiji Sunami， Suzanne Hiramatsu， Steve Martinez, and Dave S. B. Hoon Methylation of pl6 and Ras Association Domain
但并非由一个基因的高甲基化就能确诊为肝癌，也不是所有的肝癌患 者pl6基因都会出现高甲基化，pl6基因的甲基化仅为参考指标之一。 操作步骤如下(3个样品方法相同)
1、 制备待测DNA:
取新鲜肝组织50mg，用基因组DNA抽提试剂盒(上海二医新生 基因科技有限公司)提取DNA，按说明书操作。
2、 DNA亚硫酸氢钠修饰
1)、取1吗DNA，溶于20nl水中，95"C水浴10分钟；立即放于冰浴；加入2nllOM氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA;
2) 、加入亚硫酸氢钠修饰液(5M亚硫酸氢钠，10mM氢 醌，lmMTAC ，0.3M盐酸胍,PH5.0) 230^1，混匀后分装到3个PCR管，
每管约80—卯^;
3) 、将3个PCR管放入PCR仪，运行下列程序进行亚硫酸氢钠修 饰反应
95 。C 20秒
95°C 10秒 ，
58。C20分钟」7循环
Holdat4"C
3、 DNA修饰产物的纯化
1 )、纯化:合并上述三管DNA修饰溶液，加入lml PH为5.0的6M 盐酸胍溶液作为结合剂以利于吸附，混匀后将溶液转移到套放在2ml 收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8，000rpm室温离心30 秒，弃收集管中的废液；
2) 、洗涤加入500nl洗涤缓冲液OOmMTris， PH=6.8， 80%乙 醇)，8，000rpm室温离心30秒，弃洗涤液，再次加入500pl洗涤缓冲 液清洗一次；
3) 、脱磺化在上述UNIQ-10柱中加入250Ml脱磺化液(含30% 乙醇，5%甘油，200mMNaOH， lOOmMNaCl),室温放置10分钟， 8,000rpm室温离心30秒，弃收集管中的废液；
4) 、洗涤加入500nl洗涤缓冲液(10mMTris， PH=6.8， 80%乙 醇)，8，000rpm室温离心30秒，弃洗涤液，再次加入50(^1洗涤缓冲液清洗一次。
5)、洗脱把UNIQ-10柱放入一个新的1.5mlEP管中，加入70t: 预热的TE (lOmMTris ， PH=8.0; lmM EDTA) 35jil， 12，000rpm 室温离心2分钟，收集洗脱液，此为修饰后的DNA溶液，即PCR模 板。
4、 PCR扩增和检测分析 1)、 PCR扩增
根据P16基因设计并合成甲基化特异性引物和未甲基化特异性引 物，包括正向引物和反向引物(由上海博彩生物科技有限公司合成) 甲基化正向引物(MF): TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 甲基化反向引物(MR): GACCCCGAACCGCGACCGTAA 扩增片段长度150bp
未甲基化正向引物(UF): TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 未甲基化反向引物(UR): CAACCCCAAACCACAACCATAA 扩增片段长度151bp PCR分为2管进行扩增， 一管用甲基化特异性引物，另一管用未
甲基化特异性引物扩增，PCR反应体系如下(其中正向引物用P1表
示，反向引物用P2表示)
10xPCR buffer (without MgCb) 2.5^1
MgCl2 (25mM) 2^1
dNTP(2,5mM) 2fi1
Pl(pl6， 20mM) 0.5^1P2(pl6， 20nM)
H20
模板
Taq酶(5u/nl) 总体积
反应条件如下
94t: 3分钟
0,5jtl
l(il
25jil
9化20秒 58*C 20秒 72"C 15秒
35循环
72匸5分钟
甲基化修饰和未修饰的DNA分别被甲基化引物和未甲基化引物 扩增。
2)、检测分析
分别取扩增产物8^1按常规进行凝胶电泳，电泳结果见图l。其 中Marker大小为100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、卯0、 1000、 1200、 1500bp; M为甲基化引物扩增产物；U为未甲基化引物 扩增产物；1、 2、 3号样品分别为未甲基化引物扩增条带。由图1 可见，1、 2号样品用甲基化引物未扩增出条带，只有3号样品能用 甲基化引物扩增出条带，说明只有3号样品的pl6基因被部分甲基化。
实施例2:本发明方法和传统方法、试剂盒方法检測GSTP1基因甲 基化的对比实验根据GSTP1基因设计并合成甲基化特异性引物和未甲基化特异 性引物，包括正向引物和反向引物(由上海博彩生物科技有限公司合 成)
甲基化正向引物(MF): TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 甲基化反向引物(MR): GCCCCAATACTAAATCACGACG 扩增片段长度101 bp
未甲基化正向引物(UF) : GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT 未甲基化反向引物(UR): CCACCCCAATACTAAATCACAACA 扩增片段长度101 bp
PCR分为2管进行扩增，--管用甲基化特异性引物，另一管用未 甲基化特异性引物扩增，PCR反应体系和条件同实施例1 (其中正向 引物用P1表示，反向引物用P2表示)。
一、 本发明的实验方法同实施例1。
二、 传统的方法 主要步骤如下
1、 DNA亚硫酸氢钠修饰
1) 、取1吗dna，溶于20m1水中，dna变性，成为单链dna， 方法同实施例1;
2) 、 DNA亚硫酸氢钠修饰加入DNA亚硫酸氢钠修饰液(3M亚 硫酸氢钠，10mM氢醌，PH5.0) 230ul;置于55"C避光修饰16小时；
3) 、 DNA修饰产物的纯化(1) 、 DNA修饰产物在4X:下对双蒸水透析过夜；
(2) 、脱磺化加入10M NaOH使其浓度为0.3M;室温20分钟， 加1M盐酸中和NaOH;加占总体积四分之一的醋酸铵(10M)和2 倍体积的乙醇，置-20t;沉淀DNA过夜；13000rpm离心10分钟，弃 废液，再用70%酒精洗涤2次，干燥10分钟，加20pJTE，使修饰 好的DNA溶解。
4)、 PCR扩增 方法同实施例1。 三、试剂盒方法
用Zymo公司生产的甲基化试剂盒，操作步骤按说明书。 (--)、DNA的修饰
1、 取500ng DNA样品(20 到PCR管中，添加130 pl的CT (Conversion Reagent),将样品管放到PCR仪并按以下步骤操作
(1) 、 98。C放置IO分钟;
(2) 、 64"C放置2.5小时。
2、 DNA修饰产物的纯化添加600 nl的M-Binding Buffer到柱子 中，并将柱放入试剂盒所提供的Collection Tube中，装填DNA样品 到含有M-Binding Buffer的柱子中，盖紧盖子将柱颠倒数次来混合样 品，全速(>10，000 x g)离心30秒。去除废液，添加100 nl的 M-Wash Buffer到柱中。全速离心30秒，去除废液。
3、 脱磺化加200 nlM-DesulphonationBuffer到柱中并且在室温(20 匸一30X:)下放置15-20分钟后全速离心30秒，弃废液；加200jUM-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒，弃废液，再加200 pi M-Wash Buffer,离心30秒，弃废液；
4、 洗脱直接加10 nl M-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1.5 ml的收集管中，全速离心，收集DNA洗脱液。
5、 PCR扩增取2jU DNA洗脱液做模板进行PCR扩增，方法同实 施例1。
(二)、电泳检测对比分析各取8pl PCR扩增产物分别按常规进行 凝胶电泳，电泳结果见图2。其中Marker大小为100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、卯O、 1000、 1200、 1500bp。 M为甲基化引物 扩增产物;U为未甲基化引物扩增产物。A为本发明方法的电泳图谱， B为传统方法的电泳图谱，C为Zymo公司甲基化试剂盒方法的电泳 图谱。从图2可见，样品1、 2、 3既能用未甲基化特异性引物扩增出 DNA片段(101bp)，又能用甲基化特异性引物扩增出DNA片段，表 明1、 2、 3号样品均有一部分GSTP1基因被甲基化。3种方法电泳 图谱一致，说明本发明方法是切实可行的。
权利要求
1. 一种快速检测DNA甲基化的方法，包括如下步骤制备待测DNA、DNA的亚硫酸氢钠修饰、DNA修饰产物的纯化以及PCR扩增和检测，其特征在于亚硫酸氢钠修饰液中添加了催化剂TAC和盐酸胍，以加速DNA的亚硫酸氢钠修饰反应。
2、 按权利要求1所述的快速检测DNA甲基化的方法，其特征 在于亚硫酸氢钠修饰反应过程中采用多次短时间高温解链，以充分暴 露DNA链上的碱基，使DNA修饰更完全。
3、 按权利要求1所述的快速检测DNA甲基化的方法，包括如 下步骤1)、制备待测DNA;2) 、 DNA亚硫酸氢钠修饰(1) 、使DNA变性，成为单链DNA;(2) 、加入亚硫酸氢钠修饰液，进行DNA亚硫酸氢钠修饰反应3) 、 DNA修饰产物的纯化；4) 、 PCR扩增和检测分析； 其特征在于(1) 、所述DNA亚硫酸氢钠修饰液中含有终浓度为1mM催化 剂TAC，和终浓度为0.3M盐酸胍；(2) 、 DNA亚硫酸氢钠修饰时，在PCR上按下列程序进行多次短时间高温解链反应95 。C 20秒 95°C 10秒 " 58°C 20分钟」7循环Holdat4。C(3)、修饰产物的纯化时，采用UNIQ-10柱进行纯化，DNA修 饰溶液中加入lmlPH为5.0的6M盐酸胍溶液作为结合剂以利于吸 附，DNA吸附于UNIQ-10柱后，依次用洗涤缓冲液清洗，洗涤缓冲 液为10mMTris， PH-6.8, 80%乙醇；用脱磺化液脱磺化，脱磺化 液为30%乙醇，5°/。甘油，200mMNaOH， 100mM NaCl;再用上 述洗涤缓冲液洗涤;最后用TE洗脱液洗脱，从而得到检测基因甲基 化的PCR模板。
全文摘要
本发明涉及医学生物学检测技术领域，是一种快速检测DNA甲基化的方法。针对传统方法的不足做了以下三方面的改进1.采用添加催化剂TAC、盐酸胍加速修饰反应；2.修饰反应过程中多次短时间高温解链，以充分暴露碱基，将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶；3.针对修饰后繁琐的透析脱盐步骤，DNA修饰产物纯化时，将修饰后的DNA产物结合到玻璃纤维膜或硅藻土或硅胶膜或者其他柱子上进行洗涤脱盐，再用去磺化试剂处理后洗脱，从而得到检测基因的甲基化PCR模板，可以直接用于PCR扩增，大大节省了脱盐时间。本发明方法成本低廉、检测时间短、重复性好。
文档编号C12Q1/68GK101285096SQ20081003845
公开日2008年10月15日 申请日期2008年6月3日 优先权日2008年6月3日
发明者卫立辛, 吴孟超, 黎 张, 张春东, 赟 徐, 蒋国成 申请人:中国人民解放军第二军医大学