专利名称：选择甲基化标记的方法
选择甲基化标记的方法本发明要求2010年5月12日提交的英国专利申请号1007944.0的优先权。英国专利申请号1007944.0的内容通过引入全文纳入本文。本发明涉及汇编和使用位于生物基因组DNA中靶标DNA序列组的方法，用于诊断和鉴定生物样品经历的暴露和/或涉及组织或细胞的种类或来源。所有生物组织(从单个细胞到复杂的多细胞真核植物和动物生物)持续暴露于影响细胞过程的环境因子。这些环境因子能采用很多不同的暴露形式，包含物理、化学、生物(如害虫和疾病)、病毒和放射暴露。当这些暴露降低生物组织的有效功能时，称为惹激(stress)。在其最广泛意义，惹激能定义为从对生物组织或个体有效功能最优的生物和非生物条件的任何偏离。因此，当用于本发明的上下文时，一种或多种惹激包含非生物惹激、和生物和发育惹激(示例包括但不限于暴露于病原体介导的疾病和内源“系统分解”疾病例如癌症和衰老)O 例如，几个作者列举了大量影响植物的非生物惹激，并且也描述了暴露于这些惹激诱导的生理反应(如Orcutt和Nilsen2000) ;Padmanabh2005)。类似地，由Bijlsma和Loeschcke (1997)编写的工作描述了广泛范围的环境惹激和研究了其对进化过程的影响。Goh等(2007)列举了大量人疾病惹激，和报道了其对基因表达的影响。Hruz等(2008)在Genevestigator 网站(https://www.genevestigator.com)提供了数种动物和植物物种(包含人、小鼠和拟南芥(Arabidopsis))中惹激的广泛列表。非生物惹激的示例包括但不限于热、渗透、物理创伤、营养缺乏、化学诱导惹激和生理惹激如毒素、预防、化肥和治疗或娱乐性药物。生物和发育惹激的示例包括但不限于暴露于病原体介导的疾病，寄生虫侵扰，内源“系统分解”疾病，例如癌症和衰老。也有传统惹激赋予生物某些健康或其他益处的示例，如阳性惹激。很多阳性惹激的示例包含Callaway等(2002)的研究，所述研究显示了在阿尔卑斯山植物群落中，一个个体毗邻另一个赋予健康优势，而不是与植物-植物竞争惹激更常相关的成本。Dhabhar和McEWen(1998)显示了持续时间短的抑制物显著增强人皮肤中的迟发型超敏反应，并且假定所述惹激诱导的白细胞向皮肤运输可以介导研究中观察到的免疫增强。Poss和Tonegawa (1997)研究了小鼠血红素加氧酶I (Hmoxl)的调节和活性；Hmoxl是在惹激的哺乳动物细胞中经典上调的基因。提供了证据显示此基因上调给予细胞对氧化惹激的保护并因此赋予来自惹激暴露的正效益。鉴于影响任何生物系统最优表现的大量参数和几乎存在所有生物的环境的先天可变性质，每个生物个体在其生命中遇到一种或另一种形式的惹激是不可避免的。通过组合耐受(用于能生存的次最优惹激)和/或避免(用于不能耐受的所有惹激和也用于很多降低操作效率的惹激)，单个生物能适应惹激的影响。当生物遇到不能避免的惹激时，其克服所述惹激的机制涉及生物适应，通常视为代谢通路的改变(Madlung等，2004)，一般使用系统冗余性和引入/增强在新条件下表现更好的通路。这种改变能以多种方式实现，包含通过在调节区上游以及基因本身内部的差异胞B密唳甲基化来调节基因的转录控制(如Aceituno等,2008)。任何给定惹激引起的生理改变不限于影响一种或多种起始受体基因(检测所述惹激的那些)的调节改变，也包含作为受体改变结果而变化的其他基因(应激反应基因和应激反应基因通路)的级联反应。由不同的惹激诱导子引入的应激反应基因/通路中有相当大的冗余性。例如，茉莉酸通路参与拟南芥对生物和非生物惹激的反应(此作用的综述参见Devoto和Turner2005 和 Wasternack, 2007)。DNA甲基化似乎广泛跨越很多真核组，包含植物、哺乳动物、鸟和无脊椎动物如线虫(Finnegan 等，1998; Suzuki S 等，2007; Gupta S 等，2006; delGaudio R 等，1997)。植物中，DNA甲基化与基因沉默相连，例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中基因SUP、PAI和AG 的高甲基化等位基因(Jacobson 和 Meyerowitz, 1997;Melquist 等，1999; Jacobson 等，2000)和柳穿鱼属(Linaria)中的LCYC (Cubas等，1999)。然而，在拟南芥中等位基因AP3和FWA的高甲基化显示了异位表达(Kinoshita等，2004)。数个报道提示DNA甲基化在植物发育和细胞类型调节中的作用(Finnegan等,2000)。也已知DNA甲基化在包括人在内的哺乳动物的表观遗传控制基因表达中起作用，并且可以与某些组织类型相连。测定感兴趣特定基因组DNA靶标区域的甲基化程度在研究领域中有用。在人和其他哺乳动物中，发现甲基胞嘧啶在胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG) 二核苷酸中几乎占主导。基因组DNA甲基化在基因调节中起重要作用。在人恶性肿瘤如癌症中观察到的最早和最常见的基因改变中，所谓的CpG岛(特别是位于基因5’调节区内的CpG岛)的非典型性甲基化造成这种基因表达的改变。DNA甲基化和基因调节之间的联系引起相当大的研究兴趣，通过使用基因组中定义位点的DNA甲基化的出现和程度作为诊断工具以诊断发育进展的特异性状态，细胞、组织或器官的种类，疾病和其他惹激形式的开始或暴露。所述应激反应通路本身影响基因的甲基化，并且与维持或持家通路中运转的调节区有关。与任何这些基因表达有关的甲基化改变不太可能单独诊断引起其活化的精确惹激，因为很多不同惹激能激活相同的应激反应基因。如本文可见，这种位点在对反应(甲基化或去甲基化的诱导)直接分配原因(单个惹激)中几乎没有价值，因为数个不同的惹激能引起DNA甲基化中相同的改变。出于这个原因，使用DNA甲基化诊断疾病或其他惹激形式的努力集中到从头查询单独或共同诊断特定疾病或惹激的位点，有对每个疾病或惹激集合的新位点。有很多建立了基因或相关调节区内单个或多个位点DNA甲基化和特定人疾病间联系的研究示例。这些包含白血病；头颈癌；霍奇金病；胃癌；前列腺癌；肾癌；膀胱癌；乳腺癌；伯基特淋巴瘤；维尔姆斯瘤；帕-魏二氏(Prader-Willi) /安格尔曼(Angelman)综合征；ICF综合征；皮肤纤维瘤；高血压；儿科神经生物学；孤独症；溃疡性结肠炎；脆性X综合征和亨廷顿病。参见例如: HliILfiAoki E 等，(2000); Nosaka IL 等，(2000);
Asimakopoiilos F A 等》(1999) ; Fajkusova L 等，
(2000); LitzCE 等,(1992)
头頸癌S細ehez-Cespedes M 等(2000)
祐命金病GardaJF U;, (1999)
lNlJsv Yanagisawl Y 等.(2000)
It列腺瘍RenniePS 等,(1998-99)
Iff*CliffordSC.等.《I998)
1 JttiSSardi I (1998)
乳腺癌Mancini DN 等.(1998); Zrlhan-Llcht S.等.{1995);
Kass DH (1993)
们Jl特淋巴痛:TaoQ等.(1998)
维尔姆斯痛KJeymenovaEV等.(〗998>
帕-魏:......:氏Zeschnigh 等.(1997); Faang P (1999)
安格尔综合征
ICF 综合征Tuck-Muller 等.(2000)
皮肤纤维瘤ChenTC等.(2000)
高血!..KLeeSD 等.(1998)
Λ科神经牛物学Campos-Castd〗o J等.《1999)
孤独疝Klauck SM *$.(1997)
溃疡tt结肠炎GioriaL等.《1996)
脆性X综合怔Homstra IK等.(1993)· 廷顿病Ferluga J 等.(1989)还在其他(非人)高等生物基因组中鉴定了与特定惹激和疾病相关的特异位点的甲基化。示例包含:
烟草植物(烟草(Nicotiana tabacum))中，I型甲基转移酶NtMETl的沉默造成基 因组中甲基化的降低。Wada等(2004)显示约30个基因上调，超过一半直接参与对生物或 非生物惹激的响应。另外，Choi等(2007)也显示烟草植物中，病原体响应基因NtGPDL的 甲基化模式在人工接种烟草花叶病毒(TMV) 24小时内改变，并且这个改变与植物的超敏反应(HR)有关。玉米(玉米(Zeamays))中，低温惹激似乎减少甲基转移酶的转录，并且也隐含地降低DNA甲基化(Stewart等,(2000))。在后者研究中，(Stewart等,(2002)相同组使用HPLC分析以确证低温度惹激造成总甲基化下降超过10%，但是似乎局限在Ac/Ds转座子。甲基化也参与高浓度重金属惹激的耐受。比如，Lee等(1998)显示表现出甲基转移酶活性增加(和因此更多甲基化)的仓鼠细胞系显示了对重金属抗性提高。在生物范围内与惹激有关的甲基化基因座的综述参见Peng和Zhang(2009)和Hruz 等,(2008)，以及 Genevestigator 网站(https://www.genevestigator.com)。现有技术中就诊断目的而言使用DNA甲基化模式的方法是当前高度靶向鉴定和使用基因座以诊断个体环境暴露，即特异性疾病、发育进展或具体惹激的特定状态。W02007/132166描述了以下发现:在怀孕妇女中，源自胎儿的某些基因(例如RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB21P、PTPN6、THY1、TMEFF2 和 PYCARD)高度甲基化，而母体来源的相同基因未甲基化。所述研究描述了如何在来自怀孕妇女的生物样品中检测一种或多种这些甲基化的胎儿基因，作为所述样品中出现胎儿DNA的通用指示物。这些胎儿甲基化标记描述为就非侵入性分析过程而言特别有用的阳性对照，所述过程中监控胎儿DNA的质量和数量。
US2006-0183128(也公开为W02005/019477)描述了鉴定分化组织表观遗传标记的全基因组表观遗传图；所述方案包含甲基化可变的CpG位点(MVP)和基因组DNA样品类型之间的相关性。表观遗传图在例如鉴定样品类型或区分两种或多种样品类型中有广泛用途。在表观遗传图背景中分析一个或一组核酸序列的表观遗传特性仅能测定所述核酸的来源，而不是环境暴露/惹激的概况。US2007-0292866涉及检测人基因组DNA甲基化总体改变以及人基因组中特定区域甲基化改变的方法。所述方法能诊断、预后和监控疾病的治疗处理，以及检测饮食和/或食品补充剂引起的甲基化改变。所述惹激仅能分开鉴定。US2004-0029117描述了能鉴定差异甲基化DNA基因座的通用发明，可用作测定生物效果和/或药物活性、化学物质和/或药物组合物的标记。所述药物、化学物质和/或药物组合物仅能分别使用各自表观遗传标记单独研究。因此，迄今为止使用DNA甲基化鉴定特定惹激局限于在一次一个的单独惹激研究中使用的标记，或其他所述的源材料(例如，组织/器官/细胞类型)或建立生理状态。因此需要研究惹激范围的更有效系统，并且特别是单个分析中多个惹激的研究。理想地，所述相同分析也应该能区分源材料和生理状态。本发明提供能鉴定基因组DNA内标记组的系统，能用于共同和重复地鉴定个体、组织、器官或细胞处于一定范围的惹激，和/或诊断样品所接触惹激的广泛或特定性质，和/或诊断生物样品的生理状态或来源(例如细胞类型或器官)。本发明的标记DNA序列在下文称为(可互换)‘DNA基因座’、‘前哨(Sentinel)’和‘惹激前哨(Sentinel)’，并且能鉴定生物样品经历的一种或多种惹激(包含单个生物、器官、组织或细胞)。惹激前哨各包含序列基序，所述基序改变其DNA甲基化状态(通常但不必定限于胞嘧啶残基)，例如在生物经历某些惹激后但不是经历其他惹激；和/或细胞分化成某些细胞类型但不是其他；和/或根据获取样品的器官或组织，和/或细胞类型、组织、器官或个体的发育的生理年龄或状态。这个方式中，当考虑全组惹激前哨时，DNA甲基化的共同模式能鉴定是否在一种或多种惹激下操作生物样品，或生物样品处于一种或多种惹激，和/或能用于诊断样品的来源或源材料的生理状态。样品接触的惹激可以是已知的(如前面由惹激前哨鉴定的)或者未知的(惹激前哨没有鉴定的)惹激。通过与标准参照样品的比较正常推断出样品(组织、器官或细胞类型)来源的生理状态或来源(例如，与来自肝细胞DNA相关的DNA甲基化概况匹配暗示样品来自肝样品)。惹激前哨的关键属性是没有一个前哨单独诊断任何一个惹激、源材料或生理状态，并且前哨能使用一种惹激(或源材料或生理状态)来鉴定，但是当应用于处于不同惹激的样品(或源材料或生理状态)时，仍然保留了诊断属性。此属性提供了与寻求鉴定甲基化标记的现有系统相比显著的提高，所述标记根据针对一定范围对照比较器状态判断的靶标状态的调查，单独诊断惹激/组织/发育状态。现有方案的缺点是所述方案在更广泛取样时容易受损，导致发现不同的状态/组织/细胞类型共有前面认为诊断靶标状态的相同甲基化状态。相反，前哨标记包含这个可能性并且因此很不太可能受到更广泛取样的影响，并且(不像现有系统)能诊断前面未鉴定的反应为不同。前哨本身可以来自或不来自与编码区、调节区或内含子有关的DNA，和可以与基因表达中的已知改变有关或无关。而且，前哨位点可以位于与基因表达无关的非编码区，前提是所述位点的惹激之间甲基化状态的改变是一致和可靠的。本发明通过参照拟南芥、小鼠和人中的前哨DNA甲基化标记组(或可以发生的证据)示例这个属性，所述标 记基于响应一组惹激的差异甲基化来选择(或根据已知对甲基化改变敏感的差异基因表达而推测的差异甲基化)，并且显示能鉴定暴露于惹激而不用于标记选择过程的样品(或组织类型)。根据由这些标记生成的二元概况测定相关性或聚类的已确立方法能用于提供对新惹激(如未训练的惹激)所属广泛分类的一些指南。这些包括但不限于多变量分析，例如主坐标分析或诊断决策树或决策树(见例如AnalysingEcologicalData (分析生态数据)(2007)，纽约州施普林格公司(Springer)，第15章，第259-264页，ISBN978-0-387-45967-7)。还描述了衍生自拟南芥的甲基化控制应激反应基因调节区的前哨标记组，其表达模式(和因此甲基化状态)能区分至少78种不同的惹激类型。通过数个非常温和的惹激(诱导所调查78个基因中〈5个的改变)提供关于所述方案潜在灵敏度的一些指示。还通过训练拟南芥基因座来示例前哨原理，使用来自78个起始组的40个基因标记亚组系列和使用这些标记以定量频率，其中鉴定新的惹激为独特(即与训练组不同)，与对照不同但是与现有惹激相同(即在训练组中发现)或与对照相同(假阴性)。也显示了前哨使用一组已知在不同组织中差异甲基化的人基因座来鉴定组织类型的能力。显示了针对有限组织组选择和使用前哨，仍然能诊断组织，而不用于鉴定所述前哨。在上下文中，诊断指鉴定细胞、组织、器官或生物内生理和表型状态或其改变。在此说明书中，以能编写清晰和准确说明书的方式描述了实施方式，但是旨在并且应理解，实施方式可采用多种组合或分开而不偏离本发明。在此说明书中，术语“约”指加或减20%,更优选加或减10%，甚至更优选加或减5%，最优选加或减2%。
在此说明书中，使用术语“生长”指发现或放置或培养细胞或组织或生物的生活环境。例如，所述术语可涉及生长、生活、环境和/或发育状态。术语“生长的”和“生长”指感兴趣阶段或研究中细胞或组织或生物的存活和/或增殖。在本发明的第一方面，提供了就鉴定非典型生长条件(惹激)而言鉴定一组DNA基因座(惹激前哨)的方法，包含步骤:1.在对照生长条件下培养感兴趣的细胞样品；ii在存在至少一种非典型生长条件的环境中，培养与步骤(i)所述相同的感兴趣细胞样品；ii1.从⑴和(ii)的各细胞样品中分离DNA ；iv.鉴定步骤(iii)中分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态；V.比较来自步骤⑴和(ii)中分离的DNA的甲基化状态。v1.选择具有以下特征的基因座亚组，其中所述亚组的特征在于:步骤(ii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态不同于步骤(i)中分离的DNA。vi1.鉴定步骤(vi)中选择的基因座亚组。vii1.将选定亚组基因座的甲基化状态与非典型生长条件和/或感兴趣细胞样品相关联。可选地，所述方法包含步骤:ix.将选定基因座亚组的甲基化状态与圭用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合相关联。在本发明的第二方面，提供了就鉴定特定非典型生长条件(惹激)而言鉴定多组DNA基因座(惹激前哨)的方法，包含步骤:1.在对照生长条件下培养多种感兴趣的细胞样品，其中感兴趣的多种细胞有不同的基因型；ii在存在至少一种非典型生长条件的环境中，培养步骤(i)中所述多种感兴趣细胞样品；ii1.从⑴和(ii)的各细胞样品中分离DNA ；iv.鉴定步骤(iii)中分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态；V.比较步骤⑴与(ii)、或⑴和(iii)、或(ii)和(iii)中分离的DNA的甲基化状态。v1.选择具有以下特征的基因座亚组，其中所述亚组的特征在于:步骤(ii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态不同于步骤⑴和/或(iii)中分离的DNA;和/或其中步骤(iii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态与(i)相比不同。vii鉴定步骤(vi)中选择的基因座亚组。vii1.将基因座亚组和其甲基化状态与用于选择基因座的非典型生长条件和/或感兴趣细胞样品相关联。可选地，还有步骤:
ix.将选定基因座亚组的甲基化状态与圭用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合相关联。在本发明的第三方面，提供了就鉴定多种非典型生长条件而言鉴定一组DNA基因座的方法，包含步骤:1.在对照生长条件下培养感兴趣的细胞样品；ii在存在至少一种非典型生长条件的环境中培养与步骤(i)相同的多种感兴趣细胞样品，其中各个样品分别在不同的非典型生长条件下生长；ii1.从⑴和(ii)的各细胞/样品中分离DNA ;iv.鉴定步骤(iii)中分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态；V.比较来自步骤⑴和(ii)中分离的DNA的甲基化状态；v1.选择具有以下特征的基因座亚组，其中所述亚组的特征在于:各样品步骤
(ii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态不同于步骤(i)中分离的DNA;vii鉴定步骤(vi)中 选择的基因座亚组；vii1.将基因座亚组和其甲基化状态与(ii)的不同非典型生长条件相关联。可选地，有其他步骤:ix.将选定基因座亚组的甲基化状态与圭用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合相关联。优选地，所述基因座亚组中的各基因座不诊断单一病症。优选地，选定基因座亚组的甲基化状态诊断未用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合。优选地，选定基因座亚组的甲基化状态诊断用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合。优选地，选定基因座亚组的甲基化状态诊断(i)l用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合；和(ii)选择基因座所用的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合。本发明所有方面的方法的中心是用于鉴定和选择甲基化位点(前哨)的标准，所述位点能用于诊断超出选择过程所用的惹激、源材料和/或生理状态。为此，优选选择通常在条件和/或来源样品之间不同，但是理想地不是仅对单一条件诊断的标记。在这个方式中，跨前哨的差异甲基化模式产生诊断而不是某些条件特异性基因座的状态。下表显示这个原理。因此，应理解本发明的方法中，优选所选基因座亚组由在条件和/或来源样品之间不同的基因座组成，但不是仅对单个条件和/或来源样品的诊断。在假设情况中，有6种惹激(A-F)和8个基因座(1_8)，其中响应不同惹激的甲基化状态评分为甲基化(+)或未甲基化(_)。下表1(a)显示一种可能的结果。表Ι-a惹激类型(A-F)
ABCDEF
(1-X)
1+*φ.+.2- + + - J + 爾 ■響礫兩
4兩爾巻■専*4*. _μ楊.._
8 - + + -+*
在所含的8个基因座中，基因座6和7作为潜在前哨而消除，因为其在惹激的训练组中没有变化(即基因座6全部甲基化而基因座7全部未甲基化)。基因座3和4没有变化，并且各是一种惹激的诊断(分别为A和F)。这些可以考虑为前哨候选物，但不是理想的，因为其似乎指示一种惹激/基因座，并且不太可能在很多其他惹激(若有)的概况中起重要作用。剩余的基因座不是任何一种特定惹激的诊断,但是能共同分开(separation)训练组中的所有惹激(见下表I (b))。表Ι-b惹激类型(A-F)
权利要求
1.一种汇编位于生物基因组DNA内的靶标DNA序列组以诊断和鉴定生物样品曾经历的事件和/或与组织和/或细胞种类或来源相关联的方法，所述方法包含选择具有甲基化状态的DNA序列，所述甲基化状态在某些样品中根据样品不同而变化但是不仅仅确诊生物样品曾经历的单个事件或组织和/或细胞种类或来源。
2.一种汇编位于生物基因组DNA内的靶标DNA序列组以诊断和鉴定组织和/或细胞种类或来源的方法，所述方法包含 (i)从两种或多种已知不同种类或来源的细胞样品中分离DNA； (ii)鉴定从各样品分尚的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态； (iii)比较来自各样品分离的DNA的甲基化状态；和 (iv)选择具有以下特征的基因座亚组，所述亚组的特征在于:具有在某些样品中随样品不同但不仅仅确诊单个种类或来源的基因座甲基化状态。
3.一种鉴定DNA基因座组(惹激前哨)以鉴别非典型生长条件(惹激)的方法，所述方法包含步骤: (i)在对照生长条件下培养感兴趣的细胞 样品； ( )存在至少一种非典型生长条件的环境中，培养至少一种与步骤(i)所述相同的感兴趣细胞样品； (iii)从步骤⑴和(ii)的各细胞样品中分离DNA; (iv)鉴定步骤(iii)中分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态； (v)比较来自步骤⑴和(ii)中分离的DNA的甲基化状态； (vi)选择具有以下特征的基因座亚组，所述亚组的特征在于:步骤(ii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态不同于步骤(i)中分离的DNA，并且所述亚组中每个基因座响应某些非典型生长条件而不响应其他条件而改变甲基化状态。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所选基因座亚组的甲基化状态共同诊断(i)未用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合；和(ii)选择基因座所用的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或其组合。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含使用至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约15、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、或更多种不同的惹激、组织类型或细胞类型来选择基因座亚组。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述基因座亚组中的每个基因座或每个选定DNA序列有一个或多个，例如两个或多个，三个或多个，四个或多个，五个或多个，六个或多个，七个或八个下列特性， (i)对相同惹激再现性地以相同方式或以与相同来源生物相同组织类型相关联的方式改变甲基化状态； (ii)在相同时间取自相同个体相同组织的重复样品之间，甲基化的状态没有变化或优选小于约20%的变化； (iii)产生易检测的与不同的惹激状态或细胞和/或组织种类或来源相关联的定性甲基化改变； (iv)产生易检测的与不同的惹激状态或细胞和/或组织种类或来源相关联的显著定量甲基化改变； (V)响应某些惹激而不响应其他惹激而改变甲基化状态(优选对15-85%惹激改变，更优选25-75%惹激和最优选40-60%惹激)； (vi)包括优选代表大部分或最好全部(a)生物应激反应通路或(b)细胞和/或组织类型的基于甲基化的基因座； (vii)根据生物的各个组织/器官类型分别组合； (viii)在不同组织/发育阶段之间不变或优选小于约10%变化，除非仅仅意在用于特定的组织、器官或发育阶段。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述基因座亚组中的每个基因座或每个选定DNA序列互补地区别性存在于大致一半的用于选择基因座的惹激或样品来源中。
8.一种鉴定DNA基因座组以鉴别一种或多种非典型生长条件的方法，所述方法包含步骤: (i)在对照生长条件下培养感兴趣的细胞样品； (ii)在存在至少一种非典型生长条件的环境中，培养与步骤(i)所述相同的感兴趣细胞样品； (iii)从步骤⑴和(ii)的各细胞样品中分离DNA; (iv)鉴定步骤(iii)中分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态； (v)比较来自步骤⑴和(ii)中分离的DNA的甲基化状态； (vi)选择具有以下特征的基因座亚组，所述亚组的特征在于:步骤(ii)中分离的DNA中的这些基因座的甲基化状态不同于步骤(i)中分离的DNA，优选所述亚组中每个基因座响应某些非典型生长条件而不响应其他条件而改变甲基化状态； (vii)鉴定步骤(vi)中选择的基因座亚组； (viii)将选定亚组基因座的甲基化状态与非典型生长条件和/或感兴趣细胞样品相关联。
9.一种鉴定多组DNA基因座以鉴别非典型生长条件的方法，所述方法包含步骤: (i)在对照生长条件下培养多种细胞样品，其中感兴趣的多种细胞有不同的基因型； (ii)在存在至少一种非典型生长条件的环境中，培养步骤(i)中所述多种感兴趣细胞样品； (iii)从步骤⑴和(ii)的各细胞样品中分离DNA; (iv)鉴定步骤(iii)分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态； (v)比较步骤⑴与(ii)、或⑴和(iii)、或(ii)和(iii)中分离DNA的甲基化状态； (vi)选择具有以下特征的基因座亚组，所述亚组的特征在于:步骤(ii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态不同于步骤(i)和/或(iii)中分离的DNA;和/或步骤(iii)中分离的DNA中基因座甲基化状态与从⑴相比不同，优选所述亚组中每个基因座响应某些非典型生长条件而不响应其他条件而改变甲基化状态； (vii)鉴定步骤(vii)中选择的基因座亚组； (viii)将基因座亚组和其甲基化状态与用于选择基因座的非典型生长条件和/或感兴趣细胞样品相关联。
10.一种鉴定DNA基因座组以鉴别多种非典型生长条件的方法，所述方法包含步骤: (i)在对照生长条件下培养感兴趣的细胞样品； (ii)在存在至少一种非典型生长条件的环境中培养与步骤(i)相同的多种感兴趣细胞样品，其中各个样品分别在不同的非典型生长条件下生长； (iii)从步骤⑴和(ii)的各细胞样品中分离DNA; (iv)鉴定步骤(iii)中分离的DNA内能甲基化的基因座的甲基化状态； (v)比较来自步骤⑴和(ii)中分离的DNA的甲基化状态； (vi)选择具有以下特征的基因座亚组，所述亚组的特征在于:步骤(ii)中分离的DNA中这些基因座的甲基化状态不同于步骤(i)中分离的DNA，优选所述亚组中每个基因座响应某些非典型生长条件而不响应其他条件而改变甲基化状态； (vii)鉴定步骤(vi)中选择的基因座亚组； (viii)将基因座亚组和其甲基化状态与(ii)中不同非典型生长条件相关联。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以下可选步骤: (ix)将选定基因座亚组的甲基化状态与未用于选择基因座的非典型生长条件和/或组织/细胞类型和/或 其组合相关联。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以下可选步骤: (ix)将基因座亚组和其甲基化状态与细胞样品或组织、器官或获得所述细胞样品的生物中的表型和/或生理反应相关联。
13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中多个样品是1-10，000种惹激，包括10-500种惹激和/或30-100种惹激。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以下可选步骤: (xi)从细胞样品中分离DNA，其中所述细胞的生长条件未知； (xii)鉴定步骤(xi)中分离的DNA中步骤(vii)所鉴定的基因座亚组的甲基化状态； (xiii)将(xii)中鉴定的基因座的甲基化状态和步骤(viii)的结果相比较，从而确定(xi)的细胞样品是否曾经历非典型生长条件。
15.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以下可选步骤: (xi)从细胞样品中分离DNA，其中，当处于一种或多种非典型生长条件时所述细胞(或其来源组织/生物)的表型和/或生理反应未知； (xii)鉴定步骤(xi)中分离的DNA中步骤(vii)所鉴定基因座亚组的甲基化状态； (xiii)将(vi)中鉴定的基因座甲基化状态与步骤(X)的结果相比较，从而确定所述细胞(或其来源组织/生物)是否应已知或未知非典型生长条件而发生表型和/或生理反应。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述步骤(xiii)还鉴定细胞曾经历的非典型生长条件的类型。
17.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述步骤(xiii)鉴定了细胞曾经历步骤(ii)未曾测试过的非典型生长条件。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA基因座亚组包含1- 5000个基因座，包括10-1000个基因座和/或20-100个基因座。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述对照生长条件与感兴趣细胞的生物学正常体内生长条件相同。
20.如权利要求8-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中的不同非典型生长条件为非收敛性差异。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述非典型生长条件选自:温度、物理惹激(包含增加或降低的大气压、对对象的方向惹激、搅拌、重力、物理张力)、物理损伤、营养物可用性、暴露于化学毒素、激素或信号分子、暴露于其他化学试剂、可见光惹激(光谱质量或强度)、暴露于背景水平之上的不可见光辐射(例如X射线、Y射线、红外光或紫外光、微波等)、暴露于病原体或寄生虫、暴露于其他生物或相同种的其他成员、暴露于其他生物、个体的渗出物，食草性(herbivory)或另一生物以靶标生物为食、水惹激惹激(太多或太少)、暴露于刺激所述对象进入休止阶段的信号或条件、氧惹激或暴露于过量或次优量的自由基。
22.如权利要求8-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(vii)中将选择的基因座亚组与细胞应激反应通路成分的基因或其调节区域相关联。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述基因座存在于感兴趣细胞内每个应激反应通路中至少一种成分的基因。
24.如权利要求8-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(vi)中基因座亚组的选择通过计算机程序自动进行。
25.一种鉴定一组或多组DNA基因座以鉴定一种或多种非典型生长条件的方法，所述方法包含步骤: (a)同时按照前述权利要求中任一项所述的方法将一组或多组DNA基因座与一种或多种非典型生长条件相关联；或 (b)合并前述权利要求中任一项中步骤(viii)和(ix)的结果以鉴定与一种或多种非典型生长条件相关的一组或多组DNA基因座。
26.一组用于鉴定一种或多种非典型生长条件的DNA基因座，其中所述DNA基因座组如前述权利要求中任一项所述来确定。
27.一种鉴定感兴趣细胞曾经历的一种或多种非典型生长条件的方法，所述方法包含步骤: (i)从感兴趣细胞中分离DNA，其中所述细胞的生长条件未知； (ii)鉴定步骤(i)中分离DNA中能甲基化的基因座组的甲基化状态； (iii)将步骤(ii)鉴定的基因座甲基化状态与相同基因座组的已知甲基化状态组相比较，其中，所述已知甲基化状态组表征一种或多种惹激； (iv)确定感兴趣细胞是否曾经历非典型生长条件。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)还鉴定细胞曾经历的非典型生长条件的类型。
29.如权利要求25所述的或如权利要求27或28所鉴定DNA基因座组在鉴定细胞曾经历的非典型生长条件中的应用。
30.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述细胞仍处于所述非典型生长条件。
31.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述非典型生长条件是过去经历的。
32.如权利要求29-31中任一项所述的应用，其特征在于，所述非典型生长条件是症状或无症状疾病、获得性感染易感性、过敏、衰老、暴露于医疗药物或毒药、暴露于性能增强药物、暴露于农用化学品、市售细胞系的状态检查、测试用于生物医学目的的细胞系生理状态(包含评估合成或分离干细胞的活力、效能和/或全能性；评价用于移植的皮肤细胞系的活力和能力；确保标准细胞系培养物相对于参照标准的均一生理状态)和临床前药物试验。
33.如权利要求29-31中任一项所述的应用，是用在疾病诊断中，其特征在于，所述疾病包含癌症、代谢疾病、病毒或细菌感染、惹激相关的疾病/紊乱、寄生虫感染或侵袭、帕-魏二氏安格尔曼综合征、ICF综合征、皮肤纤维瘤、高血压、儿科神经生物学。
34.一种用于选择不同甲基化状态的基因座亚组以鉴定和区分非典型生长条件的计算机程序。
35.一组用于鉴定拟南芥细胞样品曾经历的一种或多种非典型生长条件的DNA基因座，其中不同甲基化状态和/或不同表达的基因座位于下面一个或多个(如全部)拟南芥基因内部或其上游/下游多至5kb处:AT2G15800AT2G38240AT5G54720 AT1G76650AT3G31540AT3G28820AT5G02580AT1G07120AT1G61800AT1G48110AT5G28235AT5G28430AT5G28760AT3G53300AT5G46200AT3G57260AT4G02330AT3G05400AT5G25110AT3G28770AT5G62750
36.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述基因座组如权利要求35所定义，所述基因座用于鉴定来自拟南芥的感兴趣细胞中非典型生长条件或生理/表型反应。
37.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述基因座组如权利要求35所定义，所述基因座用于鉴定来自非拟南芥植物的感兴趣细胞中非典型生长条件或生理/表型反应。
38.一组用于鉴定人细胞样品曾经历的一种或多种非典型生长条件的DNA基因座，其中不同甲基化状态和/或不同表达的基因座位于下面一个或多个(如全部)人基因或染色体位置的内部或其上游/下游多至5kb处:ZNRF3SLC7A4 肌球蛋白_18B(MY018B) 糖蛋白Ib(血小板)，β多肽 RP1-47A17.8 制瘤素M (OSM)CTA-299D3.6CTA-941F9.6 细胞附着蛋白(Cytohesin) 4ΡΙΒ5ΡΑSUSD2chr22:35，256，7 96-35，277，053，NCB136RP3-43804.2RP4-756G23.1 促生长素抑制素受体3型(SSTR3) Bcl-2相互作用杀伤蛋白(BIK)GAS2L1RP3-355C18.2Y -小细胞蛋白(parvin)CARMA3TMPRSS6 血小板衍生生长因子B链前体(PDGFB) CELSRl钙粘蛋白 T-盒转录因子(TBXl)Q6ZRW2_HUMANNKG2DL4(RAETlE)DAAM2RP1-47M23.1RP11-397G17.1Nesprin-1(Syne-1) 肌原性抑制子Inf (MDFI)RP11-174C7.4CMAHPKHDl谷胱甘肽过氧化物酶5GRIK2SLC22A1RP11-235G24.1TBX18TGM3RIN2SLC24A3Q9ULE8_HUMANC20orfll7乳腺癌扩增序列4(BCAS4)活化T细胞核因子(NFATC2)SCUBElJAGl
39.一种基本上如本文中结合实施例和附图
所述的方法。
40.一种基本上如本文中结合实施例和附图所述的应用。
41.一组基本上如本文中结合实施例和附图所述的DNA基因座。
全文摘要
本发明涉及鉴定DNA基因座组的方法以用于鉴定非典型生长条件和鉴定感兴趣细胞种类或来源。所述方法能包含鉴定多组DNA基因座，所述基因座可以鉴定不同来源和/或基因型的细胞中的多个非典型生长条件。也提供了DNA基因座组及其应用。
文档编号C12Q1/68GK103080335SQ201180034459
公开日2013年5月1日 申请日期2011年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者A·P·米德, M·J·威尔金森, C·M·R·罗佩茨 申请人:阿伯里斯特维斯大学