从血浆无创测定胎儿或肿瘤的甲基化组的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请案的夺叉引用
[0002] 本申请案为要求以下各申请案的优先权的PCT申请案：2013年6月3日提交的标 题为"在血衆中使用甲基化状态和拷贝数检测肿瘤（TumorDetectionInPlasmaUsing MethylationStatusAndCopyNumber)" 的美国临时专利申请案第 61/830, 571 号；以及 2013年3月15日提交的标题为"从血浆无创测定胎儿或肿瘤的甲基化组（Non-Invasive DeterminationOfMethylomeOfFetusOrTumorFromPlasma)" 的美国申请案第 13/842, 209号，其为2012年9月20日提交的标题为"通过母体血浆的大规模平行测序测定 胎盘的全基因组DNA甲基化状态的方法（MethodOfDeterminingTheWholeGenomeDNA MethylationStatusOfThePlacentaByMassivelyParallelSequencingOfMaternal Plasma) "的美国临时专利申请案第61/703, 512号的非临时申请案并且要求美国临时专利 申请案第61/703, 512号的权益，所述申请案以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明一般涉及DNA的甲基化模式（甲基化组）的测定，并且更具体地说，涉及分 析包括来自不同基因组（例如来自胎儿和母亲，或来自肿瘤和正常细胞）的DNA的混合物 的生物样品（例如血浆）以确定少数基因组的甲基化模式（甲基化组）。还描述了所测定 的甲基化组的用途。
【背景技术】
[0004] 胚胎和胎儿的发育是一个复杂的过程，并且包括一系列高度协调的遗传和表观遗 传事件。癌症的发展也是一个复杂的过程，它通常涉及多个遗传和表观遗传步骤。发育过 程的表观遗传控制的异常与不孕症、自然流产、子宫内生长异常和产后结果相关。DNA甲基 化是最常研宄的表观遗传机制之一。DNA的甲基化大多发生在甲基添加到CpG双核苷酸当 中胞嘧啶残基的5'碳的情况下。胞嘧啶甲基化增添了一层对基因转录和DNA功能的控制。 举例来说，称为CpG岛的富含CpG双核苷酸的基因启动子的高甲基化通常与基因功能的抑 制相关。
[0005] 尽管表观遗传机制在调节发育过程中有着重要的作用，但人类胚胎和胎组织不易 获得进行分析（肿瘤可能类似地不可获得）。在人类中产前期期间研宄健康和疾病的此类 表观遗传过程的动态改变实际上是不可能的。胚胎外组织，特别是胎盘，可以作为产前诊断 程序的一部分或出生后获得，其为此类研宄提供了主要途径之一。但是，此类组织需要侵入 性程序。
[0006] 人类胎盘的DNA甲基化型态已经吸引研宄人员数十年。人类胎盘显示了大量与 DNA甲基化有关的罕见生理特征。在整体水平上，胎盘组织与大部分体细胞组织比较时是低 甲基化的。在基因水平上，所选基因座的甲基化状态是胎盘组织特定的标记。整体与基因 座特定的甲基化型态都展示了孕龄依赖性改变。印记基因，即表达依赖于等位基因的亲代 来源的基因，在胎盘中起关键作用。胎盘已经被描述为假恶性的，并且已经观测到若干肿瘤 抑制基因的尚甲基化。
[0007] 胎盘组织的DNA甲基化型态的研宄使得可以了解妊娠相关或发育相关疾病（例 如先兆子痫和子宫内生长受限）的病理生理学。基因组印记上的病症与例如普拉德-威 利综合症（Prader-Willisyndrome)和安格尔曼综合症（Angelmansyndrome)等发育 病症相关。已经在由辅助的生殖技术产生的妊娠中观测到胎盘和胎组织的基因组印记 和整体DNA甲基化的改变型态（日浦等人2012人类繁殖；27:2541-2548(HHiuraet al.2012HumR印rod;27:2541-2548))。例如母亲吸烟（霍沃思等人2013表观基因组 学；5:37_49(KEHaworthetal.2013Epigenomics;5:37_49))、母亲饮食因素（江等人 2012FASEBJ;26:3563-3574(XJiangetal.2012FASEBJ;26:3563-3574))和母亲代谢状 态（例如糖尿病）（哈吉等人，糖尿病.(1〇;[:10.2337/(11312-02890^1^」」6丨31.，013&6七68. doi: 10. 2337/dbl2-0289))等大量环境因素与后代的表观遗传异常相关。
[0008] 尽管努力了数十年，但是还没有任何切实可行的方法可用来研宄胎儿或肿瘤甲基 化组并监测妊娠期间或例如恶性病等疾病过程期间的动态改变。因此，提供无创地分析全 部或部分胎儿甲基化组和肿瘤甲基化组的方法是非常有价值的。
【发明内容】
[0009] 实施例提供了用于测定和使用各种组织和样品的甲基化型态的系统、方法和设 备。提供了实例说明。可以基于血浆甲基化（或具有游离DNA的其它样品，例如尿液、唾液、 生殖器洗涤液）与母亲/患者的甲基化型态比较来推断胎儿/肿瘤组织的甲基化型态。当 样品具有DNA的混合物时，可以使用组织特定的等位基因鉴别来自胎儿/肿瘤的DNA，来确 定胎儿/肿瘤组织的甲基化型态。甲基化型态可以用于确定胎儿/肿瘤的基因组中的拷贝 数变异。通过各种技术鉴别出胎儿的甲基化标记物。可以通过测定DNA片段的尺寸分布的 尺寸参数来确定甲基化型态，其中尺寸参数的参考值可以用于确定甲基化水平。
[0010] 另外，甲基化水平可以用于确定癌症等级。在癌症情况下，血浆中甲基化组改变的 测量可以允许检测癌症（例如用于筛选目的）、监测（例如检测抗癌治疗后的反应；以及检 测癌症复发）和预后（例如用于测量体内癌细胞的负荷或用于癌症分期或用于评估由疾病 或疾病进展或转移性过程引起的死亡机率）。
[0011] 可以参考以下【具体实施方式】和附图来更好地了解本发明的实施例的性质和优点。
【附图说明】
[0012] 图1A展示表100,为根据本发明的实施例，母体血液、胎盘和母体血浆的测序结 果。
[0013] 图1B展示根据本发明的实施例，测序样品的1Mb窗口中的甲基化密度。
[0014] 图2A-2C展示fM直针对甲基化指数的曲线图：㈧母体血细胞、⑶绒膜绒毛样 品、（c)足月胎盘组织。
[0015] 图3A和3B展示从成年男性和非怀孕成年女性收集的血浆和血细胞中甲基化CpG 位点百分比的柱状图：(A)常染色体、（B)染色体X。
[0016] 图4A和4B展示血细胞DNA和血浆DNA中对应基因座的甲基化密度的曲线图：⑷ 非怀孕成年女性、（B)成年男性。
[0017] 图5A和5B展示从孕妇收集的样品当中甲基化CpG位点百分比的柱状图：(A)常 染色体、（B)染色体X。
[0018] 图6展示母体血液、胎盘和母体血浆的人类基因组的不同重复序列类别的甲基化 水平的柱状图。
[0019] 图7A展示早期妊娠样品的Circos图700。图7B展示晚期妊娠样品的Circos图 750〇
[0020] 图8A-8D展示针对提供有用信息的单核苷酸多态性周围的CpG位点，基因组组织 DNA针对母体血浆DNA的甲基化密度的比较曲线图。
[0021] 图9是一个流程图，说明根据本发明的实施例，用于从生物体的生物样品确定第 一甲基化型态的方法900。
[0022] 图10是一个流程图，说明根据本发明的实施例，从生物体的生物样品中确定第一 甲基化型态的方法1000。
[0023] 图11A和11B展示根据本发明的实施例，使用母体血浆数据和胎儿DNA百分比浓 度的预测算法的性能图。
[0024] 图12A是表1200,展示根据本发明的实施例预测甲基化的15个所选基因座的细 节。图12B是图表1250,展示胎盘中15个所选基因座的推测的类别和其在胎盘中对应甲基 化水平。
[0025] 图13是方法1300的流程图，所述方法1300用于从怀有至少一个胎儿的女性个体 的生物样品检测胎儿染色体异常。
[0026] 图14是方法1400的流程图，所述方法1400用于根据本发明的实施例，通过比较 胎盘甲基化型态与母体甲基化型态来鉴别甲基化分子标记。
[0027] 图15A是表1500,使用关于33个先前报导的早期妊娠甲基化分子标记展示早期妊 娠数据的DMR鉴别算法的性能。图15B是表1550,使用晚期妊娠数据并与分娩时获得的胎 盘样品比较展示DMR鉴别算法的性能。
[0028] 图16是表1600,展示基于母体血浆亚硫酸氢盐测序数据的直接分析预测为高甲 基化或低甲基化的基因座的数目。
[0029] 图17A是曲线1700,展示母体血浆、非怀孕女性对照血浆、胎盘和外周血液DNA的 尺寸分布。图17B是母体血浆、成年女性对照血浆、胎盘组织和成年女性对照血液的尺寸分 布和甲基化型态的曲线1750。
[0030] 图18A和18B是根据本发明的实施例，血浆DNA分子的甲基化密度和尺寸的曲线 图。
[0031] 图19A展示成年非怀孕女性的测序读数的甲基化密度和尺寸的曲线1900。图19B 是图1950,展示母体血浆中胎儿特定和母体特定的DNA分子的尺寸分布和甲基化型态。
[0032] 图20是方法2000的流程图，所述方法2000用于根据本发明的实施例，评估生物 体的生物样品中DNA的甲基化水平。
[0033] 图21A是表2100,展示肝细胞癌（HCC)患者的手术前血浆和组织样品的甲基化密 度。图21B是表2150,展示每一样品所实现的序列读数的数目和测序深度。
[0034] 图22是表220,展示健康对照的血浆样品中常染色体中的甲基化密度，在71. 2% 到72. 5%范围内。
[0035] 图23A和23B展示HCC患者的白细胞层、肿瘤组织、非肿瘤肝组织、手术前血浆和 手术后血浆的甲基化密度。
[0036] 图24A是图2400,展示来自HCC患者的手术前血浆的甲基化密度。图24B是曲线 2450,展示来自HCC患者的手术后血浆的甲基化密度。
[0037] 图25A和25B展示针对染色体1，使用四个健康对照个体的血浆甲基化组数据作为 参考，HCC患者的手术前（图2500)和手术后（图2550)血浆样品的血浆DNA甲基化密度 的z分数。
[0038] 图26A是表2600,展示手术前和手术后血浆的z分数的数据。图