专利名称：检测细胞nkd2基因启动子区dna甲基化状态的引物对及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测细胞NKD2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂
品.ο
背景技术：
胃癌是人类最常见的消化道原发恶性肿瘤之一，在人类恶性肿瘤导致死亡的排位中居第二位，每年新增病例数超过600，000例，以日本、中国、东欧、南美为高发地区， 其中中国占到全世界胃癌发病例数的42% (Washington K :7th edition of the AJCC cancer staging manual stomach. Ann Surg Oncol 2010,17 :3077-3079 ；Parkin DM,Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics,2002. CA J Clin.2005 ；5 :77-108 ； Juan Shang, AS Pena. Muhidisciplinary approach to underamnd the pathogenesis of gastric cancer. World J Gastroenterol, 2005,11 (27) :4131-4139.)。在我国男性、女性的胃癌死亡率均高于世界、发达及发展中国家的平均水平，男性居全世界排位中的第6位， 女性居第10位(段纪俊，陈万青，张思维.中国恶性肿瘤死亡率的国际比较.中国社会医学杂志 2009 年 12 月第洸卷第 6 期 Chinese Journal ofSocial Medicine,December2009, Vol. 26 (6) :377-378.)。胃癌起病隐袭，临床症状往往不典型，病程的不同阶段可出现不规律的腹痛、药物不缓解、早饱、乏力、消瘦、便潜血阳性等症状。胃镜检查虽然能够较直观的观测胃内粘膜病变，但最终诊断还是依赖于胃镜下胃组织的病理活检及手术标本的病理诊断。单纯外科手术切除并不能取得满意的临床效果，目前手术切除为主的综合治疗后， M分期I期患者的5年生存率仅为60-70%，而III、IV期患者的5年生存率甚至不超
20% (Hundahl SA, Phillips JL, Menck HR. The National Cancer Data Base Report on poor survival of U. S. gastric carcinoma patients treated withgastrectomy Fifth Edition American Joint Committee on Cancer staging, proximal disease, and the "different disease"hypothesis. Cancer 2000，88 :921-932.)，因此胃癌预后不良。 多项大规模多中心对照研究均提示早诊断、早治疗、寻求更为有效的化疗药物是提高胃癌生存率的有效措施。因此发现胃癌的早期诊断和治疗的有效方法具有十分重要的意义。胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，目前由于尚缺乏早期诊断和治疗的有效方法，病人预后常不良。因此针对胃癌的诊断和治疗手段，尤其是对肿瘤的早期诊断、残留病灶及复发的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。近年来，表观遗传学(Epigenetics)已逐渐成为生命科学研究领域的前沿和热点。表观遗传学是相对于遗传学而言的，其定义是指研究不依赖于DNA序列改变的可遗传的基因表达变化的科学。表观遗传学概念的提出可以解释部分经典遗传学所不能解释的问题如同卵双生的双胞胎具有完全相同的基因型，并在相同环境下成长，但仅其中一人罹患肿瘤，而另一人身体健康，因此表观遗传改变为这一现象提供了合理的解释。在肿瘤研究中，表观遗传学研究的范畴主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控。DNA甲
3基化是表观遗传学调控的主要方式，基因启动子区CpG岛的高甲基化或全基因组范围的低甲基化可以导致肿瘤。DNA甲基化是指在甲基化转移酶作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化改变可以是细胞癌变过程中的早期、频发事件，因此特定基因的异常甲基化往往可以作为肿瘤早期诊断的分子标志物、治疗靶点和预后判断的手段等。近年来甲基化检测手段不断丰富，目前主要包括两大类一是亚硫酸氢钠法(Sodium Bisulfite)，包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性 PCR(Methylation Specific PCR，MSP)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法(Ms-SNuE)等；另一类是甲基化敏感的限制性内切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性图谱(MSRF)、 限制性标记基因组扫描技术(RLGQ、差异性甲基化杂交分析(DMH)、甲基化CpG岛扩增子分析(MCA)等。特别是 1996 年 Herman 等(Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Nafl Acad Sci USA 1996 ；93 (18) :9821-9826.)发明了甲基化特异性 PCR(Methylation Specific PCR,MSP)技术后，优化了 DNA甲基化的检测方法，其突出优点在于高特异性、高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较少、不受限制性内切酶的限制。MSP的基本原理是DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上没有发生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，最后转化为胸腺嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶则保持不变，因此设计甲基化引物及非甲基化引物，分别进行PCR扩增，产物进行凝胶电泳分析结果，得出是否为甲基化的结论。果蠅裸角质层基因(Naked Cuticle, NKD)于 1992 年由 Monnie 等(Monnier D, Colas JF,Rosay P, Hen R, Borrelli E, Maroteaux L. NKD,a developmentally regulated tachykinin receptor in Drosophila. J Biol Cheml992 ；267 (2) : 1298—1302.)首次发现， 后逐渐被证实其是经典WNT/^-catenin信号通路的拮抗分子(Zeng，W.，Wharton, K. Α.， Jr. , Mack, J. Α., Wang, K. , Gadbaw, Μ. , et al. Naked cuticle encodes an inducible antagonist of Wnt signalling. Nature 2000 ；403, 789-795) 哺乳动物 NKD 基因直接与 Dishevelled作用、并在细胞内对Dishevelled介导的多种WNT信号通路发挥自主作用(Yan D,Wallingford JB,Sun TQ,Nelson AM,Sakanaka C,Reinhard C,et al. Cell autonomous regulation of multiple Dishevelled-dependent pathways by mammalian Nkd. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ；98(7) :3802-3807)。裸角质层同系物 2 (naked cuticle homolog 2，NKD2)，也被称为Naked2，是NKD家族的一个451氨基酸的细胞膜蛋白。NKD2通过与 DVl-l、Dvl-2、Dvl-3和PP2A-B72/B130的相互作用，对经典WNT信号通路有拮抗作用；另一方面，由于影响平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)对非经典WNT信号通路也有作用。離02结合在16 (1胞浆尾端的底外侧分选基序上。TGF α的加工需要NKD2参与，并且離02护送了6 0到极化的上皮细胞的底外侧细胞膜上(Li C，Franklin几，Graves-Deal R, Jerome WG, Cao Ζ, Coffey RJ. Myristoylated Naked2 escorts transforming growth factor α to the basolateral plasma membrane of polarized epithelial cells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004 ；101 :5571-5576.)。人源 NKDl 和 NKD2 基因具有与果蝇 NKD 基因保守的EFX结构域，其包括假定的EF手性序列和侧翼序列。EFX是果蝇或脊椎动物NKD分别作用于果蝇Dsh的基础结构域或脊椎动物Dvl的PDZ结构域(Wharton ΚΑ, Jr. ,ZimmermannG, Rousset R, Scott MP. Vertebrate proteins related to Drosophila Naked Cuticle bind Dishevelled and antagonize Wnt signaling. Dev Biol2001 ；234(1) :93_106·)。巨前NKD2基因在人类肿瘤包括胃癌中的表观遗传学改变及功能的研究尚未见报道。本发明人应用甲基化特异性PCR(MSP)方法率先对胃癌细胞系及肿瘤组织进行检测，首次发现细胞NKD2基因呈高甲基化状态，预实验结果提示细胞NKD2基因可能是胃癌中新的抑癌基因，此外细胞NKD2基因的启动子区高甲基化状态可能是一个崭新的肿瘤分子标记物。在此基础上，本发明人应用MSP方法对大量胃癌肿瘤组织标本以及正常的胃组织标本进行检测，以明确细胞NKD2基因启动子区甲基化状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细胞NKD2基因启动子区甲基化状态的引物对，即用于检测细胞NKD2基因启动子区甲基化和非甲基化状态的一对特异性引物对，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同时本发明还提供一种含有上述甲基化引物或非甲基化引物的试剂盒。本发明提供一种用于检测细胞NKD2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’ -GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3’，下游引物核苷酸序列为 5’ -AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3’ ；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’ -TGG ATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，，下游引物核苷酸序列为5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCC A-3，。本发明还提供一种用于检测胃癌细胞的试剂盒，其中，该试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。本发明具有如下优点利用本发明所述引物对及试剂盒检测胃组织细胞，在胃癌细胞中NKD2基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化率为46%，而在正常胃组织中，NKD2基因启动子区呈非甲基化状态，表明该基因启动子区的甲基化状态对于胃癌细胞具有特异性；同时应用本发明所述引物对及试剂盒可使检测胃癌细胞的灵敏度达到0.5%，S卩1000 个细胞中有5个甲基化的细胞就能够被检测出，这说明NKD2基因启动子区甲基化状态可作为胃癌中新的分子标志。本试剂盒首次选用细胞NKD2基因作为目标基因，该基因是本发明人应用MSP技术率先在胃癌中筛选出的启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。因此，应用本发明引物及试剂盒来检测细胞NKD2基因启动子区高甲基化状态可作为胃癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。
图1以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 BGC823细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所
7J\ ο图2以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 BGC823细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对正常胃组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所示。图3将胃癌BGC823细胞系DNA(NKD2基因启动子区100%甲基化)与正常胃组织细胞DNA(NKD2基因启动子区100%非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰，此后用甲基化引物进行扩增，扩增产物电泳结果如图所示。
具体实施例方式经过反复的试验与推敲，本发明人选出一对特异性很好的甲基化及非甲基化的引物对，应用琼脂糖凝胶电泳技术作为结果的检出手段，得到了可靠的实验结果。实验结果表明NKD2基因启动子区的高甲基化状态在人类胃癌中具有较高的检测特异性及灵敏性。利用所述引物对及试剂盒检测细胞NKD2基因甲基化状态的灵敏度高，解决了上述现有技术中其他方法的检出率低、结果不易分析、临床难以推广等一系列技术问题，因此本发明所述的引物对及试剂盒可用于胃癌的早期诊断、疗效判定、残留病灶及复发的检测等。本发明提供的用于检测细胞NKD2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如I^rimer-MF 所述，艮P :5’ -GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3，，下游引物核苷酸序列如 Primer-MR 所述， 即5 ’ -AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3 ’；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如 I^rimer-UF 所述，即5，-TGGATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，，下游引物核苷酸序列如 Primer-UR 所述，即5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCCA-3，。利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果NKD2基因启动子区存在甲基化，则会得到162bp大小的片段；如果NKD2基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本申请将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的 1^63.68，6(含量54. 17% ；下游引物的 Tm 63. 62，GC 含量 52. 0%。利用上述非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果NKD2基因未发生甲基化，则会得到166bp大小的片段。基于此，本申请将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm 60.42，GC含量42.31 % ；下游引物的Tm 62.0， GC 含量 44. 44%。本发明提供的用于检测胃癌细胞的试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。进一步地，本发明的试剂盒还含有甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞NKD2基因启动子区为100%甲基化的癌细胞DNA。在此，对该癌细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞NKD2基因启动子区100%甲基化”即可，例如可以为胃癌 BGC823细胞等。进一步地，本发明的试剂盒还含有非甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞NKD2基因启动子区为100%非甲基化的正常细胞DNA。在此，对该正常细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞NKD2基因启动子区100%非甲基化”即可，例如可以为正常胃组织细胞等。进一步地，本发明的试剂盒还含有作为双阴性系统对照的ddH20。进一步，本发明的试剂盒还含有MSP反应所需的下列成分50mMMgCl2，10XMSP buffer,IOmM dNTP mixture, Hot start Taq 酶。
为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例一1、模板的制备(基因组DNA的提取及硫化修饰过程)DNA的制备获取胃癌组织标本以及正常胃组织标本。在本实施例中各取6个胃癌组织标本(GCl GC6)，5个正常胃组织标本(NmGl NmG5)。应用酚-氯仿抽提的方法分别对上述样本进行基因组DNA提取，紫外分光光度仪测定吸光度(A)值确定其含量及纯度。亚硫酸盐修饰参考herman(J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myohanen, B. D. Nelkin and S.B.Baylin, Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996)，9821-9拟6.)等报道的方法。取上述制备的基因组DNA，经稀释后精确取2ugDNA，加去离子水至终体积50ul，加入新鲜配制的3M的NaOH 5ul，37°C孵育25min。之后加入新鲜配制的IOmM的氢醌30ul及3M 亚硫酸氢钠520ul混合均勻(其内已加入新鲜配制的3M的NaOH，计算方法10ml 3M亚硫酸氢钠中加入3M的NaOH 740ul)，50°C孵育16h，此后应用DNA纯化试剂盒(Promega公司产品)纯化并回收DNA，应用50ul去离子水洗脱DNA，向其内加入5ul 3M的NaOH以终止硫化修饰，用3倍体积的无水乙醇沉淀DNA，最终硫化修饰后的DNA重新溶解在20ul去离子水中，得到DNA模板，立即使用或-20°C保存备用。2、MSP 扩增以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系，以总体积25ul计，包括模板(硫化修饰后的DNA) :2ul ；甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3，)0. 5ul,下游引物(5，-AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3，)0.5ul ；50mM MgCl2(Invitrogen 公司):0. 75ul ；10XMSP buffer (缓冲液，Invitrogen 公司):2. 5ul ；IOmM dNTP mixture (Invitrogen ^W] ) :1. 25ul ；Hot start Taq 酶(Invitrogen 公司，浓度为 5U/μ L) :0. Iul ；ddH20 :17. 4ul以非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系与以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系的不同之处仅在于引物不同。具体地，以非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系，以总体积25ul计，包括非甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-TGGATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，)0. 5ul,下游引物(5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCCA-3，)0. 5ul ；其余组分及其用量均与以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系中的相同。以上仅分别列举了以甲基化引物和非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系中各组分的用量的一个例子，使用不同公司生产的MgCl2、MSP buffer缓冲液、dNTP mixture,Hot start Taq酶时，反应体系中各组分的用量会有所不同，可以根据实际需要进行调整。本发明对MSP反应体系中各组分的用量没有特别的限制，使用常规的用量即可。
应用上述MSP反应体系对已制备的DNA模板(6个胃癌组织标本GCl GC6，5个正常胃组织标本NmGl NmG5)分别进行扩增，并以胃癌BGC823细胞系DNA为甲基化对照，以正常胃组织标本(NG)为非甲基化对照，以ddH20作为双阴性的系统对照，扩增程序为95°C 预变性5min，接着进入循环，在95°C下变性30s，在62°C下退火30s，在72°C下延伸40s，共 35个循环，之后，继续在72°C下延伸5min。3. MSP反应产物的检测MSP产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。4.结果图1以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 BGC823细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所不。图中，GC1、GC2、GC3、GC4、GC5和GC6分别代表胃癌组织标本；BGC823为M阳性的胃癌细胞系，此处作为甲基化对照；ddH20为双阴性的系统对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH20检测的结果为双阴性(M和U均为阴性)，则体系结果可信；NG为U阳性的正常胃组织标本，此处作为非甲基化对照。U代表非甲基化结果；M代表甲基化结果；Marker为DL2000 marker (分子量标准)，上下两条带分别代表200bp和IOObp ；本体系扩增产物大小，U带为166bp，M带为162bp。图2以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 BGC823细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对正常胃组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所示。图中，NmGl、NmG2、NmG3、NmG4和NmG5为正常胃组织标本5例；BGC823为M阳性的胃癌细胞系，此处作为甲基化对照；ddH20为双阴性的系统对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH20检测的结果为双阴性(M和U均为阴性)，则体系结果可信；NG为U阳性的正常胃组织标本，此处作为非甲基化对照。U代表非甲基化结果；M代表甲基化结果； Marker为DL2000 marker (分子量标准)，上下两条带分别代表200bp和IOObp ；本体系扩增产物大小，U带为166bp，M带为162bp。结果判读方法如下应用甲基化引物(图中以M表示)进行扩增，有扩增产物，并且应用非甲基化引物 (图中以U表示)进行扩增，无扩增产物的标本则判读为完全甲基化结果；应用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本判读为部分甲基化结果；应用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，并且用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本则判读为非甲基化结果。
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部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化结果。如图1所示，胃癌组织中，GCl、GC3和GC4为非甲基化结果，GC2、GC5和GC6为甲基化结果。如图2所示，正常胃组织(NmGl、NmG2、NmG3、NmG4和NmG5)均为非甲基化结果。 对照体系反应正常，结果可信。实施例二临床标本检测取112例胃癌组织标本和5例正常胃组织标本，进行MSP扩增，模板制备、MSP扩增体系及条件、扩增产物的检测均与实施例一中的相同，检测结果请见下表1 表权利要求
1.一种用于检测细胞NKD2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5，-GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3，，下游引物核苷酸序列为 5’ -AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3’ ；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’ -TGG ATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，，下游引物核苷酸序列为5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCC A-3，。
2.一种检测胃癌细胞的试剂盒，其特征在于含有权利要求1中所述的甲基化引物或非甲基化引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞NKD2基因启动子区100%甲基化的癌细胞DNA。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有非甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞NKD2基因启动子区100%非甲基化的正常细胞DNA。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有作为双阴性系统对照的ddH20。
6.根据权利要求2至5任一项所述的试剂盒，其特征在于还含有MSP反应所需的下列成分50mM MgCl2,10XMSP buffer, IOmMdNTP mixture, Hot start Taq 酶。
全文摘要
本发明提供用于检测细胞NKD2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。本试剂盒首次选用细胞NKD2基因作为目标基因，该基因是本发明人应用MSP技术率先在胃癌细胞系及肿瘤组织中筛选出的启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。利用本发明所述试剂盒及特异性引物对检测胃癌肿瘤组织甲基化状态的特异性好，可达到46％；灵敏度高，达到5‰，即1000个细胞中有5个甲基化的细胞就能够被检测出。应用本发明试剂盒来检测细胞NKD2基因启动子区高甲基化状态可作为胃癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。
文档编号C12Q1/68GK102517400SQ20121000877
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者杨云生, 贾岩, 郭亚军, 郭明洲, 韩为东 申请人:中国人民解放军总医院