专利名称：含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒及其应用，以及一种含有多种转座因子的转Bt基因荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶体蛋白基因的简称。 1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt基因中分为Cry和Cyt 二大类。迄今为止，已经报道的Bt 达至Ij 476种，其中 Cry 分为 58群、449 种，Cyt 分为 2群、27种(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/toxins2. html)。经过密码子优化的Bt基因已被成功地导入水稻、棉花、烟草、玉米等多种植物，获得一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中玉米、棉花、 马铃薯、油菜、杨树、烟草等已商品化，我国农业部于2009年批准转基因抗虫水稻的生物安全证书。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与应用快速发展。截至2010年底，已有25个国家批准了 24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的170万公顷发展到2010年的14800万公顷，14年间增长了 87倍。ACP(Fiber-specific acyl carrier protein)基因是棉花内源基因，用于定量检测的棉花ACP基因片段长度为116b的DNA片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有棉花品种中含有ACP基因；还具备种间特异性，即在除棉花外其它物种里没有该基因DNA 片段。SPS(sucrose phosphate synthase)基因是水稻内源基因，用于定量检测的水稻 SPS基因长度为Slbp的DNA片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有水稻品种中含有SPS基因；还具备种间特异性，即在除水稻外其它物种里没有该基因DNA片段。CaMV35S启动子来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子，存在于转基因大豆、玉米、 油菜籽、番茄、马铃薯及其加工产品中；N0S终止子为胭脂碱合成酶基因终止子，也广泛存在于转基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、马铃薯及其加工产品中；Npt II为新霉素_3’ -磷酸转移酶基因，该基因的加入可促使转基因产品在新霉素培养基中成长。近年来，关于转基因植物的安全性事件报道不断，如1996年巴西豆过敏事件、 1998年Pusztai事件、1999年美国大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星联Bt玉米事件、2007年印度转基因抗虫棉事件、加拿大超级杂草事件和中国抗虫棉事件等，这些事件促使国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，有必要建立一套高效、快速、特异的检测技术。聚合酶链反应(PCR)无疑是最佳选择。在实际检测中，标准物质十分关键。标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有检测目的基因特异性片段的线性化重组质粒分子。经实验验证，不管是由单一特异性外源序列还是多段目标序列构建的质粒标准分子，都能很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。质粒标准分子由于生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济等优点愈来愈受全世界转基因检测专家和研究者们重视，在转基因生物鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物，应用于转基因品系以及其加工品的定量PCR检测。标准质粒分子在转基因作物和附属产品检测鉴定中的应用将会发挥越来越重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子，解决转Bt基因农作物尤其是转Bt基因棉花、水稻检测中标准物质缺乏的难题。本发明采用的技术方案是一种含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，由SEQ ID No. I (35S启动子)、 SEQ ID No. 2 (Bt)、SEQ ID No. 3 (SPS)、SEQ ID No. 4 (ACP)、SEQ ID No. 5 (N0S 终止子)和 SEQ ID No. 6 (Npt II新霉素)所示核苷酸片段添加常规酶切位点后，插入克隆载体制得。优选的，上述6个核苷酸，每个核苷酸片段两端添加同一种酶切位点，其添加顺序依次为 HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII。本发明的转Bt基因棉花、水稻标准质粒分子既含有Bt外源基因又包括棉花ACP 内源基因和水稻SPS内源基因。Bt外源基因既可用于定性、定量检测转Bt基因农作物的转基因含量，又可以定性检测样品是否来自转Bt基因农产品；相同原理，棉花ACP和SPS内源基因可定性检测上述转Bt基因农产品是否为棉花或水稻品系，亦可定量检测转Bt基因棉花、水稻的转基因含量。所述克隆载体为常规克隆载体(PMD18-T、PMD19-T、pEASY_T3等克隆载体)，本发明中优选为PEASY-T3。优选的，所述标准质粒由SEQ ID No. 7 (SEQ ID No. I两端添加HindIII位点)、SEQ ID No. 8 (SEQ IDNo. 2 两端添加 KpnI 位点)、SEQ ID No. 9 (SEQ ID No. 3 两端添加 XbaI 位点)、SEQ ID No. 10 (SEQ ID No. 4 两端添加 XhoI 位点)、SEQ ID No. 11(SEQID No. 5 两端添加BamHI位点)和SEQ ID No. 12 (SEQ ID No. 6两端添加BglII位点)所示核苷酸序列依次连接后，插入PEASY-T3载体制得。所述标准质粒的构建,包括如下步骤I.设计PCR特异性引物；2. PCR 扩增；3、35S启动子、Bt、SPS、ACP、N0S终止子以及Npt II新霉素核苷酸目标序列获取， 长度分别为74、174、81、116、180和183bp，通过测序进行验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；4.构建标准质粒；将4中所选取的355启动子』15 530 、勵5终止子以及恥七II新霉素特异片段经过拼接,每个核苷酸头尾均添加相同成分酶切位点,添加的酶切位点依次为HindIII、 KpnI, XbaI, XhoI, BamHI, Bglll，最终获得长度为880bp的基因片段，而后插入pEASY_T3 载体，完成标准质粒的组合，标准质粒分子如图1(因其插入片段长度为880bp，本发明简称 880号质粒)。5.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；6.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；7.对标准质粒特异性、稳定性及均匀性结果进行分析。本发明还涉及所述的标准质粒在定量检测转基因农作物中转基因含量中的应用。所述农作物可为下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。所述标准质粒可用于检测下列之一的Bt外源基因(I) CryIA ( α )，(2) CryIA (b)，
(3)CryIA (c), (4)Crylab/ac。本发明还涉及一种含多种转座因子的转Bt基因荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和所述含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，所述特异性引物和探针序列如下35S启动子的引物和探针(目标条带74bp)35S-F:5，-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’35S-R:5’ -AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’35S-P : 5，- (FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3，NOS终止子的引物和探针(目标条带180bp)NOS-F :5’ -GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’NOS-R :5’ -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’NOS-P : 5 ’ - (FAM)-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-(TAMRA)-3，Npt II新霉素的引物和探针(目标条带183bp)NPT II-F :5，-GCACGAGGAAGCGGTCA-3’NPT II-R :5，-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3， NPTII-P :5，_(FAM)-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-(TAMRA)-3，棉花ACP基因的引物和探针(目标条带116bp)ACP-F :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，ACP-R :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，ACP-P : 5，_(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-(TAMRA)-3，Bt基因的引物和探针(目标条带174bp)Bt-F :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-P :5’ -(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3’水稻SPS基因的引物和探针(目标条带8Ibp) SPS-F 5' -TTGCGCCTGAACGGATAT-3'SPS-R 5' -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3'SPS-p : 5，- (FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3’其中FAM为荧光报告基团，TAMRA、Eclipse为荧光淬灭基团；
所述含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子由SEQ ID No. 7、SEQ IDNo. 8,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 所示核苷酸序列依次连接后，插入PEASY-T3载体制得。使用以上试剂盒对转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测可按本领域常规方法进行，提取待测样品基因组DNA后，配制PCR缓冲液进行PCR扩增，取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现Bt基因的特异性条带(174bp)，判断待测农作物是否含有相应外源基因，若电泳结果同时出现ACP基因特异性条带(116bp)，则待测农作物为转 Bt基因棉花；若电泳结果同时出现SPS基因特异性条带(81bp)，则待测农作物为转基因水稻；还可用于转基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、马铃薯及其加工产品中CaMV35S启动子、NOS 终止子以及Npt II基因的定性定量检测。定量检测时同时以标准质粒梯度浓度溶液于相同条件下进行扩增，绘制标准曲线，对照标准曲线，即可获得待测样品中外源基因和内源基因的拷贝数，即可获知待测样品的外源基因含量。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种含多种转座因子的抗虫水稻、 棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、高效经济，解决了转基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便的含多种转座因子的抗虫水稻、棉花荧光定量PCR检测试剂盒，能够很好的进行转基因农作物的定性、定量分析检测。
图I为pEASY-T3重组载体结构图;1 6分别为酶切位点HindIII、KpnI、XbaI、 Xhol、BamHI、BglII ；图2 为 Bt 和 ACP 基因验证电泳图；Marker DL2000 ； I (35S)、2 (NTC) ,3 (NOS)、 4(NTC)、5(SPS)、6(NTC),7(Npt II),8(NTC)、9(ACP)、10(NTC)、11(Bt)、12 (NTC)；图 3 为 EcoRI 单酶切；M (DL2000) ；1 (880 质粒)；2 (HindIIII 酶切)；3 (KpnI 酶切)；4 (XbaI 酶切)；5 (XhoI 酶切)；6 (BamHI 酶切)；7 (880 质粒)；8 (Bgl II 酶切)；M (DL2000)；图4为880号质粒的各基因荧光定量PCR结果(标准曲线)汸 ？分别为355、 Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II ；图5为880号质粒各基因片段短期稳定性荧光定量PCR结果(标准曲线)；1 为-70。。、_20°C、4°C的检测扩增曲线；2为20°C、40°C的检测扩增曲线;A F分别为35S、 Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II ；图6为880号质粒各基因均匀性qPCR分析，A F分别为35S、Bt、SPS、ACP、N0S、 Npt II ；图7为880号质粒荧光定量检测极限分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :880标准质粒分子的构建本发明含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒包含Bt、35S启动子、NOS终止子以及Npt II基因四个外源基因和棉花ACP、水稻SPS二种内源基因，其构建方法包括如下
步骤
I.设计PCR特异性引物；
2. PCR扩增；
3. Bt、35S启动子、NOS终止子、Npt 11, ACP, SPS等目标序列获取，并通过测序进行验证；
4.选择合适片段，并设计荧光定量PCR引物及探针；
荧光定量PCR引物及探针如下所示
35S-F :5，-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3，
35S-R :5，-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3，
35S-P :5，-FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA-3，
Bt-F :5，--GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3，
Bt-R :5，--CGCCTTGACCACAGCTATCC-3，
Bt-P :5’ --(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’
SPS-F 5/-TTGCGCCTGAACGGATAT-3'
SPS-R 5/-CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3'
SPS-p :5，-FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMRA-3’
ACP-F :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，
ACP-R :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，
ACP-P :5，-(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG(TAMRA)-3，
NOS-F :5，-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，
NOS-R :5，-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3，
NOS-P :5’-FAM-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-TAMRA-3，
NPT II-F:5，-GCACGAGGAAGCGGTCA-3，
NPT II-R:5，-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3，
NPT II-P5，-FAM-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA-3，
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
5.构建标准质粒；
35S启动子、Bt、SPS、ACP、NOS终止子以及Npt II新霉素核苷酸片段其长度分别
为74bp、174bp、81bp、116bp、180bp、183bp。上述6个核苷酸片段,每个核苷酸片段两端添加同一种酶切位点，其添加顺序依次为HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII。所得片段插入PEASY-T3克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，完成标准质粒的组合，标准质粒分子如附图I (因其插入片段长度为880bp，本发明简称880号质粒)。其重组流程如下a.基因序列的QC :对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。根据序列情况设计合成方案；b.根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；c.利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；d.将合成好的基因装入pEASY_T3Cloning载体并转化至感受态细胞DH5a ；
e.测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。6.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；(I) PCR 验证对所构建的880号质粒用355启动子、815 5、么0 、勵5终止子以及恥七II引物进行扩增电泳，在目标片段区域获得清晰的单一预期条带，如图2，说明这六个片段已经被正确地插入质粒中。(2)酶切验证根据插入片段和pEASY-T3载体TA克隆位点两端特异性较高的酶切位点选择 EcoRI单酶切，结果见图3。根据载体结构图以及载体和整合片段序列估算，880号质粒经 HindIIII、KpnI、XbaI、Xhol、BamHI、Bgl II六种限制性内切酶进行单酶切，酶切获得选取的355启动子、81\5 5、40 、勵5终止子、册1 II新霉素这六个基因的特异片段，大小分别为74、174、81、116、180、183bp，基本肯定质粒片段的正确性。(3)测序验证根据插入片段(含两端酶切位点)设计引物，进行PCR扩增，将扩增结果进行测序。并对测序结果与设计序列进行匹配对比，结果完全吻合，验证了质粒序列100%的可靠性。7.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；(I)标准质粒的浓度测定和检测重复性质粒突光定量PCR引物与上述4中相同，探针采用Primer Express2. O和Beacon designer 设计，然后由 TaKaRa公司负责合成。根据PicoGreen dsDNA Reagent and Kits所测定母液浓度计算质粒拷贝数，再用灭菌去离子水分别稀释成初始模板拷贝数为107、106、 ΙΟ5、104、IO3,100、10拷贝的标准质粒进行荧光定量PCR绘制标准曲线，从而建立标准质粒的qPCR定量分析体系并用于实际标准分子的定量分析，重复定量分析3次，分析检测灵敏性。表I为qPCR扩增程序，表2为荧光定量PCR 25 μ I扩增体系。表l:qPCR扩增程序
steplstep235S95°C，30s ；95°C，5s ;63°C，30s ；40cyclesBt95°C，30s ；95°C，5s ;60°C，30s ；40cyclesSPS95°C，30s ；95°C，5s ;55°C，30s ；40cyclesACP95°C，30s ；95°C，5s ;59°C，30s ；40cyclesNOS95°C，30s ；95°C，5s ;57°C，30s ；40cyclesnptll95°C，30s ；95°C, 5s ;65°C，30s ；40cycles 表2 :荧光定量PCR 25 μ I扩增体系
权利要求
1.含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，由SEQID No. I、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示核苷酸片段添加酶切位点后，插入克隆载体制得。
2.如权利要求I所述的标准质粒，其特征在于所述克隆载体为PEASY-T3。
3.如权利要求I所述的标准质粒，其特征在于所述标准质粒由SEQID No. 7、SEQ IDNo. 8,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 所示核苷酸片段依次连接后，插入PEASY-T3载体制得。
4.如权利要求I 3之一所述的标准质粒在定量检测转基因农作物中转基因含量中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述农作物为下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述标准质粒用于检测下列之一的Bt外源基因(I)CryIA (a), (2)CryIA(b), (3)CryIA (c), (4)Crylab/ac。
7.一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒含有荧光定量PCR检测试剂盒， 主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，其特征在于所述特异性引物和探针序列如下35S-F :5，-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’35S-R :5’ -AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’35S-P : 5，- (FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3，NOS-F :5’ -GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’NOS-R :5’ -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’NOS-P : 5 ’ - (FAM)-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-(TAMRA)-3，NPT II-F :5，-GCACGAGGAAGCGGTCA-3，NPT II-R :5’ -AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3，NPT II-P :5，-(FAM)-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-(TAMRA)-3，ACP-F :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，ACP-R :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，ACP-P :5’ _(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-(TAMRA)-3，Bt-F :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-P :5’ -(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3，SPS-F 5' -TTGCGCCTGAACGGATAT-3'SPS-R 5' -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3'SPS-p :5’ - (FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA, Eclipse为荧光淬灭基团；所述含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒由SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示核苷酸片段依次连接后，插入 PEASY-T3载体制得。
全文摘要
本发明涉及一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，由SEQ IDNo.1(35S启动子)、SEQ ID No.2(Bt)、SEQ ID No.3(SPS)、SEQ ID No.4(ACP)、SEQ ID No.5(NOS终止子)和SEQ ID No.6(Npt II新霉素)所示核苷酸片段添加常规酶切位点后，插入克隆载体制得。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、高效经济，解决了转Bt基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便的含有多种转座因子的转Bt基因荧光定量PCR检测试剂盒，能够很好的进行转Bt基因农作物的定性、定量分析检测。
文档编号C12N15/63GK102586304SQ20121000839
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者付贤树, 俞晓平, 叶子弘, 崔海峰, 赵煦泓, 金荣愉 申请人:中国计量学院