专利名称：一种大豆erf转录因子及其编码基因与耐盐应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆ERF转录因子及其编码基因在转基因植物耐盐方面的应用。
背景技术：
大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料，在医学上也有很大价值。然而生物和非生物胁迫对大豆的生长和发育产生极为不利的影响，其中，土壤盐渍化严重影响着大豆的产量、 品质和效益，造成严重的经济损失。因此，阐明大豆对逆境的响应机制，鉴定耐盐相关的重要基因并利用它们来提高大豆的耐盐性显得尤为重要。植物转录因子在胁迫的刺激下可以不断合成并将信号传递和放大，调控下游多个基因的表达，从而引起植物生理生化的改变来适应外界的不利环境，近年来逐渐成为人们的研究热点。ERF转录因子分属于植物中特有的AP2/ERF转录因子超家族中的ERF亚家族， 最初由Ohme-Takagi和^inshi在1995年从烟草中分离得到。它们表达的蛋白共同含有1 个保守的由58或59个氨基酸组成的AP2/ERF结合域，三维立体结构分析表明，此结构域由 3个反向平行的β折叠和1个几乎同β折叠平行的α螺旋组成。其中，β折叠对AP2/ERF 结构域识别各类顺式作用元件可能起关键作用，而α螺旋可能参与同其它转录因子及DNA 之间的相互作用。ERF可以与GCC-box和/或DRE/CRT元件特异结合，而这些元件通常分别位于植物的病程相关蛋白基因和高盐、干旱、冷诱导相关基因的启动子中。ERF正是通过调节这些基因的表达从而参与到植物的生物和非生物胁迫中去。植物的逆境响应被多条信号途径所调节，其中，乙烯、水杨酸、茉莉酸和脱落酸传递途径之间存在着一定的交叉作用，它们之间可能是相互促进，也可能是相互拮抗，从而实现对逆境防卫反应的精确调控。而一些 ERF转录因子通常是上述信号途径交叉处的重要成分。目前，已从拟南芥、烟草、番茄、辣椒、水稻、小麦、棉花等不同植物分离到大量编码ERF蛋白的基因。番茄的JERF3可以同时与GCC-box和DRE/CRT元件结合，能被乙烯、茉莉酸、低温、高盐和脱落酸诱导，同时能提高转基因烟草的耐盐性。木花生中的JcERF的表达可以被高盐、干旱、乙烯和机械伤害诱导，但不被ABA诱导，在拟南芥中超表达JcERF增强了植物对盐和寒冷的抗性。但在大豆中ERF转录因子的研究相对较少，仅报道过3个ERF 的功能，它们均参与到大豆的胁迫响应中去，在提高植物抗逆性方面发挥积极的调控作用。 单子叶植物和双子叶植物中均可能存在大量的ERF转录因子，鉴于ERF在植物应对逆境中发挥的重要作用，对大豆ERF家族中其他的成员作进一步的鉴定与应用有利于大豆胁迫抗 (耐)性的改良。
发明内容
本发明提供一种大豆ERF转录因子及其编码基因与耐盐应用。本发明所提供的大豆耐盐相关ERF转录因子来源于大豆品种吉林32(由吉林省农科院富健研究员馈赠)，命名为GmERF7。所述大豆ERF转录因子基因的碱基序列为kquence NO. 1。所述大豆ERF转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为kquence NO. 2。序列表Sequence NO. 1由1179个碱基组成；序列表Sequence NO. 2由392个氨基酸残基组成，包含一个AP2/ERF结合域自氨基端的第118至175位氨基酸残基；两个预测的核定位信号第一个自氨基端的第72至76位氨基酸残基，第二个自氨基端的第112至 116位氨基酸残基；一个预测的转录激活域自氨基端的第41至70位氨基酸残基。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的
的编码基因导入植物细胞，可获得对高盐耐性提高的转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。携带有本发明的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、 微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的有益效果是本发明克隆了一个大豆耐盐相关的转录因子基因， 研究该基因在大豆中的表达模式、与逆境元件的体外结合及转录调节活性，比较了野生型烟草和转基因烟草的耐盐性，为其有效应用提供依据，对改良植物的抗逆性，特别是培育耐盐大豆品种具有重要意义。
图1 GmERF7基因的PCR扩增结果。图2基因逆境诱导表达模式。图3 GmERF7基因组织表达模式。图4 GmERF7蛋白与GCC-box的体外结合。其中，1孔道为GCC+mGCC，2孔道为 GmERF7蛋白，3孔道为GmERF7蛋白+GCC，4孔道为GmERF7蛋白+mGCC。图5转录激活活性分析。其中，图A为报告质粒、效应质粒载体结构示意图；图B为瞬时表达GUS荧光定量测值，1代表空白对照，2代表仅转化报告质粒载体，3代表报告质粒载体和效应质粒载体共转化。图6基因在部分Tl代转基因烟草中的PCR鉴定结果。图7野生型烟草和Tl代转基因烟草盐胁迫处理结果。其中，A代表野生烟草盐胁迫处理前，B代表转基因烟草盐胁迫处理前，C代表野生烟草盐胁迫处理后，D代表转基因烟草盐胁迫处理后。图8野生型烟草和Tl代转基因烟草盐胁迫处理后叶绿素测定结果。
具体实施例方式实施例1 -.GmERF7基因的克隆及序列分析
大豆RNA的提取及cDNA的合成用RNAplant plus Reagent(购自TIANGEN)提取大豆吉林 32 叶片总 RNA，用 M-MLV reverse transcriptase (RNase H-)(购自 TaKaRa)进行反转录，合成cDNA。引物的设计与合成将大豆品种吉林32的3个时期O0、30和50天)未成熟胚表达谱测序所得序列(华大基因完成)输入NCBI中进行Blast比对，获得一个与植物中 ERF转录因子蛋白序列同源性较高的未知cDNA序列。根据已获得的未知cDNA序列，其核苷酸序列如 kquence NO. 1 所述，设计合成引物，F :5，-GAGACACAGCCATTGTTTGTTTAC-3，，R 5‘ -GGTTTTCTTGCTGTGGATTC-3‘。以上述cDNA为模板，按照以下反应体系及条件进行PCR扩增25 μ L体系，内含 10XPCR Buffer 2. 5 μ L,2. 5 mmol/L dNTP mix 2 μ L, 10 μ mol/ L的引物F和引物R各1 yL，cDNAl μ L, EX Taq (购自TaKafci) 0. 3 yL，补去离子水至 25 μ L。反应条件预变性 94°C 8min ；94°C 40s, 56°C 40s, 72°C lmin, 30 个循环；72°C 延伸8min。将上述扩增片段回收后与克隆载体pMDIS-T (购自TaKaRa)进行连接，鉴定后送华大基因测序，验证序列正确。经PCR扩增得到包含有基因全长OFR的序列，全长13%bp，内含1179bp 的基因全序列，编码一个由392个氨基酸残基组成的蛋白质，其氨基酸序列为 Sequence NO. 2，包含一个保守的AP2/ERF结合域，二个预测的核定位信号和一个转录激活域。实施例2基因在逆境诱导下的表达模式
大豆吉林32 的逆境处理用 Hoagland培养液(Ca(NO3)2 ·4Η20 0. 62 g/L、KN03 0 . 34 g/ L、KH2PO4 0. 06 g/L、NH4NO3 0.053 g/L、MgSO4 0. 24 g/L、MgCl2 0. 67 mg/L、H3BO3 0. 38 mg/ L、MnSO4 0. 2 mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 29 mg/L、CuSO4 0. 01 mg/L、FeSO4 · 7H20 0. 02785 g/L、 EDTA-Na2 0.0373 g/L,PH 5. 7-5. 8),28°C,16 h光照/8 h黑暗条件培养大豆水培苗，取四叶期的水培苗进行以下处理
高盐(NaCl)处理将大豆幼苗置于含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培养液中，处理 Oh、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
干旱(Drought)处理将大豆幼苗置于含有20% PEG8000的Hoagland培养液中，处理 Oh、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
低温(Cold)处理将大豆幼苗置于4°C培养箱中，处理Oh、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
机械伤害(Wound)处理用灭菌的解剖刀对大豆幼苗叶片造成数处伤口，处理Oh、lh、 2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
脱落酸(ABA)处理用含有200 μ mol/L ABA的Hoagland培养液喷洒大豆幼苗，处理 Oh、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
乙烯(ETH)处理将大豆幼苗置于带盖的塑料桶中，桶中放有500 mL烧杯，内装有200 mL蒸馏水、2 mL 40%乙烯利、1 g NaHCO3，用胶带密封，处理Oh、lh、2h、5h、IOh和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
总RNA的提取和cDNA的合成方法同实施例1。根据GmERF7的cDNA序列设计实时荧光定量 PCR 引物(F 5 ‘ -GCGATTATCTCCGACTTCATTC-3 ‘ ；R 5' -GATTTCACAGTTGTTGCTCCAC-3‘)。以大豆组成型表达基因A-Tl/Zwi/ 为内部参照(F 5' -GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3‘ ；R 5' -AGTGGCATCCTGGTACTGC-3‘)。利用 ABI 7500 实时定量PCR仪，以大豆各逆境处理取样点的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。反应体系含 2XSYBR Premix Ex Taq (购自 TaKaRa) 10 μ L、ROX Reference Dye II 0. 14 μ L、 cDNA 80 ng、Primer F 0. 4 μ L、Primer R 0. 4 μ L,补水至总体积 20 μ L。反应程序为
595°C 30s ；95°C 5s, 58°C 34s, 72°C 30s, 40个循环。采用2 ΔΔσ法分析数据，确定基因的相对表达量。每个取样点设3次技术重复，试验共设3次生物学重复。
逆境处理下基因的相对表达量(平均值)；
处理 __ 处11^"式 __
吋同—高盐干旱低Ii |机械伤害I脱落酸 Z稀
Oh__1__1__1__1__1__1
Ih — 1. 26360 " 22. 35759 . 0. 891793 ~3. 936466 1. 688551 4. 285293 2h — 1.067083~ 3.427497 ‘ 0.01316 ~0. 3447 1. 536823 6.145306 5h — 2. 223648- 4. 573287 ‘ 0. 282433 414619 0. 888538 2. 321448 IOh 1. 206455 6. 018554 . 0.363806 0.160833 0. 016337 7.138632 24h 0. 425118 6.106424 1.08246 0. 000663 0. 000838 2.889506
结果表明^ / ^/基因在各种逆境处理下均存在不同程度的上调表达。实施例3基因在大豆组织中的表达模式
分别提取大豆吉林32的根、茎、叶、花和20天胚的总RNA并反转录成cDNA，方法同实施例1。以上述根、茎、叶、花和20天胚的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，方法同实施例 2。基因在大豆不同组织中的相对表达量(平均值)_
组织I叶|20天胚 I根1 I花
目对表达量 |l |o. 71475 |3. 80061 |θ. 667293 |θ. 131047
结果表明版湖厂/基因在大豆的根中表达量最高，表达量依次为根 > 叶> 20天胚 > 茎 >花。实施例4 :GmERF7蛋白的体外结合实验
根据基因序列设计合成引物，并在其上、下游引物中分别引入fee I和ZZiz7i/ III酶切位点，F :5' -CGAGCTCATGTGTGGTGGTGCGATT-3‘ ；R 5' -GGGTTCGAATCAGAAGACTCCTG CCAT-3 ‘。以pMD18-T-GmERF7质粒为模板，进行PCR扩增。将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA 纯化回收试剂盒(购自TIANGEN)纯化后，用fee I和历ii/ III (各种限制性内切酶均购自 TaKaRa)双酶切，回收纯化后，与同样用Sac I私Hind III双酶切的pET28a (购自Novagen) 载体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌(五cWi)DH5 α (购自Biovector)，经验证后，转入宿主菌Rosetta (DE3)(购自Novagen)中进行表达。重组蛋白的原核表达分别取阳性和空载体单菌落接于5 mL附加50 mg/L卡那霉素和15 mg/L氯霉素的LB培养基(蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L ,NaCl 10 g/L)中，37°C 振荡培养过夜；按1 100的比例转接到10 mL附加50 mg/L卡那霉素和15 mg/L氯霉素的LB培养基中，37°C振荡培养至菌液0D_为0. 4-0. 6时，加入终浓度为0. 1 mmol/L的 IPTG, 30°C振荡培养3. 5h后，取1 mL菌液，12000 rpm离心Imin,收集菌体。表达产物的SDS-PAGE分析按照SDS-PAGE电泳常规方法进行。重组蛋白的纯化按上述条件，将诱导后的1 L菌液4°C，5000 rpm离心IOmin ； 收集诱导后的菌体，每100 mg菌体加入1-5 mL细菌裂解液(购自天恩泽公司)，超声裂解菌体(超声条件200-300W，超声 2sec，间歇 lOsec，进行 90min);4°C，20000 rpm 离心 25min ； 使用一站式His标记蛋白质微量纯化套装(购自天恩泽公司)对上清液中的可溶性重组蛋白进行纯化。凝胶阻滞分析
1探针的制备
GCC: F 5' - AATTCATAAGAGCCGCCACTCATAAGAGCCGCCACTCCC -3‘ ；R 5' - GGGAGTGG CGGCTCTTATGAGTGGCGGCTCTTATG -3‘；
mGCC =F 5' - AATTCATAAGATCCTCCACTCATAAGATCCTCCACTCCC -3‘ ；R 5' - GGGAGTGG AGGATCTTATGAGTGGAGGATCTTATG -3‘；
按照上面的核苷酸序列送华大基因合成单链GCC、mGCC序列，合成双链DNA探针的退火反应体系如下
Sequence F (100 μ mol/L) 20 μ L Sequence R(100 μ mol/L) 20 μ L 10XPCR buffer 10 μ L 补水至总体积100 μ L。退火和纯化程序99°C水浴lOmin，关掉水浴锅，自然冷却至常温；4°C放置过夜， 加入250 μ L无水乙醇，-80°c放置Ih ;4°C，13000 rpm离心lOmin，弃上清，用70%乙醇洗涤；晾干后溶于50 μ L去离子水中，-20°C存储备用。2探针与蛋白的结合反应结合反应体系
双链探针0. 5 μ L
转录因子蛋白5-7 yg
5Xbinding buffer 2 μ L 补水至15 μ L。室温结合25min，加 2 μ L 6 X loading buffer (购自 Takafci)，点样于 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶，在0.5XTBE电极缓冲液中跑电泳(冰上进行)，110V恒压，至指示剂到达距板底部1/4处停止电泳，拆板，在EB中染色lOmin，凝胶成像仪拍照。附试剂配方5Xbinding buffer =Tris (1 mol/L, PH 7.5) 10 μ L, EDTA(0. 5 mol/L, PH 7.5) 2 μ L, 5 mol/L NaCl 10 μ L, 1 mol/L DTT 1 μ L, 80% 甘油 62.5 μ L, 去离子水14. 5 μ L ;8%非变性聚丙烯酰胺凝胶5XTBE 2 mL，40% Arc/Bis 2 mL，80%甘油 250 μ L，10% APS 100 μ L，TEMED 10 μ L，去离子水 5. 67 mL。结果如图4所示，GmERF7蛋白可以与GCC_box特异结合。实施例5 -.GmERF7转录激活活性分析
植物表达载体的构建方法同实施例4。觅AtPDFl. 启动子(起始密码子ATG上游346bp 序列，包含GCC-box)替换pCAMBIA1301 (购自CAMBIA)的CaMV35S启动子构建报告质粒表达载体，用替换PCAMBIA1301上的Gtt？基因构建效应质粒表达载体。测序鉴定正确后，将报告质粒和效应质粒分别转化农杆菌ΕΗΑ105 (购自Biovector)。参照 Yang 等(In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinf iltration of tobacco leaves, 2000)的方法注射烟草叶片进行瞬时表达。⑶S荧光测定参照《植物基因工程原理和技术第二版》和Jefferson (Assayingchimeric genes in plants: the GUS gene fusion system, 1987)的方法进行。取注身寸的烟草叶片约100 mg，放入研钵中，用液氮研磨成粉末，加入600 uL提取缓冲液，离心后的上清液为GUS蛋白粗提液。样品粗提液分为两部分，一部分采用Bradford法测定GUS蛋白含量；另一部分用于荧光定量检测，粗提液中加2 mmol/L的⑶S反应底物4-MUG，37°C保温 15min后，加0.2 mmol/L Na2CO3反应终止液终止反应，在激发波长365nm，发射波长455nm 下，测定荧光值。GUS活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。
荧光测定结果如图5所示，具有转录激活活性，可以在烟草中激活启动子中含有GCC-box的下游基因的表达。
实施例6基因对烟草的转化
植物表达载体的构建方法同实施例4，将基因全序列克隆于植物表达载体 ΡΒΙ121 (购自Clontech)的多克隆位点上，测序鉴定正确后，转化农杆菌ΕΗΑ105。利用农杆菌侵染烟草叶盘法将pBI121-GmERF7转化烟草NC89(购自中烟种子有限公司)。具体方法如下
烟草转化
1将烟草种子置于1. 5 mL离心管中，用10%的次氯酸钠浸泡消毒;3min，无菌水冲洗4-5
次；
2 将烟草禾中子铺于MS培养基(A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Murashige and Skoog, 1962)上，培养条件16h (28°C ) 光照/8h (22°C)黑暗；
3取萌发后生长1-2个月的无菌烟草叶片，将其剪成0.5 cm2的小块(去掉主脉)，并接种于MS分化培养基上(MS添加3 mg/L 6-BA和0. 2 mg/L NAA),预培养2天；
4挑取pBI121-GmERF7单克隆于5 mL附加50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的 YEP (蛋白胨 10 g/L、酵母粉 10 g/L ,NaCl 5 g/L)中，28°C，120 rpm 振荡培养 Mh ；
5按1 100的比例将上述培养物转入50 mL附加50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的 YEP 中，28°C，120 rpm 振荡培养至 OD600=O. 4-0. 5 ；
6 5000 rpm,室温下离心15min，去除上清，将菌体重悬于MS液体培养集中(添加100 μ mol/L AS)，至 OD600=O. 5 左右；
7将预培养后的烟草叶片在重悬液中侵染20min，吸干叶片表面的菌液，置于共培养基上(MS添加100 μ mol/L AS, PH至调至5. 4左右)，共培养3天；
8将共培养后的烟草叶片用含500 mg/L羧苄青霉素的MS液体培养基清洗，晾干后转移到筛选培养基上(MS添加3 mg/L 6-BA、0. 2 mg/L NAA、500 mg/L羧苄青霉素和100 mg/ L卡那霉素)，每15天继代一次；
9待抗性芽长到1 cm时，移入生根培养集中(MS添加200 mg/L羧苄青霉素和100 mg/ L卡那霉素)，促其长根；
10待烟草苗根系发育好后，移入土中，常规管理。转基因烟草的筛选及鉴定
1 取 TO 代烟草叶片，按照 Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3· 0 (购自 TaKaRa)说明书中的方法提取叶片总DNA ；
2将提取的DNA稀释50倍后，取1 μ L为模板，以实施例1中的引物进行常规PCR验证。其中以未转化的野生烟草阴性对照，质粒pBI121-GmERF7为阳性对照； 3收获阳性烟草植株的种子，即TO代种子；
4将TO代种子种入土中获得Tl代烟草苗，对其继续提取DNA进行PCR检测，取Tl代阳性烟草植株进行后续抗性鉴定试验。图6为GmERF7在部分Tl代转基因烟草中的PCR鉴定结果，表明基因已经成功整合到烟草基因组中。实施例7 =Tl代转基因烟草耐盐性分析
用打孔器取野生型烟草和Tl代转基因烟草叶片小圆片，置于MS添加400 mmol/L NaCl溶液中，同时将野生型烟草和Tl代转βΗβ /^基因烟草叶片小圆片置于MS溶液中作为对照，于25°C，16h光照/8h暗条件下培养5天，拍照并测定叶绿素含量。叶绿素含量的测定
将处理后的野生型烟草和Tl代转基因烟草叶片称重，置于1.5 mL离心管中， 加入适量的SiOjPl mL 80%丙酮，充分研磨，12000 rpm离心lOmin，取上清，用分光光度计测定663 nm和645 nm波长处的光吸收值。叶绿素a 浓度(mg/L) =12. 72Α663_2· 59Α645 叶绿素 b 浓度(mg/L) =22. 88A645-4. 68A663
叶绿素总浓度(mg/L)=叶绿素a浓度+叶绿素b浓度
每克鲜叶叶绿素含量(mg/g)=(叶绿素总浓度X提取液体积X稀释倍数)/样品鲜重结果如图7和图8所示，野生型烟草叶绿素含量损失较多，叶片开始变白，相反，转基因野烟草的叶绿素含量与对照相比没有明显下降，叶片仍然呈现出正常的绿色。
权利要求
1.一种大豆ERF转录因子，其特征在于其氨基酸序列为kquence NO. 2。
2.如权利要求1所述的大豆ERF转录因子，其特征在于其编码基因的核苷酸序列是 Sequence NO. 1。
3.如权利要求1所述的大豆ERF转录因子在转基因植物耐盐方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种大豆ERF转录因子及其编码基因与耐盐应用，属于基因工程领域。一种大豆ERF转录因子，其氨基酸序列为SequenceN0.2，其编码基因的核苷酸序列是SequenceN0.1，所述的大豆ERF转录因子，在转基因植物耐盐方面的应用。本发明克隆了一个大豆耐盐相关的GmERF7转录因子基因，研究该基因在大豆中的表达模式、与逆境元件的体外结合及转录调节活性，比较了野生型烟草和转GmERF7基因烟草的耐盐性，为其有效应用提供依据，对改良植物的抗逆性，特别是培育耐盐大豆品种具有重要意义。
文档编号C12N15/82GK102516377SQ20121000798
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者唐心隆, 张庆林, 张鑫生, 李景文, 李艳杰, 杨旭光, 王庆钰, 王洪预, 王英, 翟莹, 闫帆, 雷婷婷 申请人:吉林大学