专利名称：慢生大豆根瘤菌提高莱茵衣藻产氢量的方法
技术领域：
本发明涉及生物制氢技术，具体地说是利用慢生大豆根瘤菌提高莱茵衣藻产氢量的方法。
背景技术：
能源危机与环境污染都是当今世界面临的突出问题，氢气是一种清洁、燃烧值高、利用形式多样的可再生生物能源[1]。光合生物制氢技术能直接转化太阳能为氢能，特别是微藻光合制氢的底物是水，来源丰富，是利用太阳能生产氢气的理想模式。而且微藻培养容易，不占用可耕地，是目前国际上生物制氢领域的研究热点[2]。莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)因为其氢化酶活性高、培养容易、生长速度快、遗传学背景清晰和转化容易等原因被选为生物制氢研究的模式物种[3]。但是，衣藻的氢化酶活性很容易受氧气的抑制 而失去活性[3’4]，而氧气又是衣藻光合作用的主要产物，是导致了衣藻产氢效率低的主要原因，所以要提高衣藻氢气产量就要降低其细胞内氧气的含量。目前降低衣藻细胞内氧气含量的方法主要是通过去除培养基中硫元素来抑制光合系统II活性、进而降低光解水产生的氧气、提高氢化酶的活性和延长产氢时间[5]。应用该方法发展而来的两步法莱茵衣藻产氢技术是目前产氢效率最高的技术，该技术是在第一阶段使用正常TAP培养基，进行莱茵衣藻的营养生长，以获得最大生物量的积累，在第二阶段更换缺硫培养基，进行产氢培养，获得氢气。但是该方法同时抑制了光解水所产生的电子产量，最终仍然不能满足工业生产的需求[3_5]。因此，要提高衣藻的产氢效率就需要既降低细胞内的氧浓度又要保障电子的供应。豆科植物根瘤中的固氮酶与氢酶有相似的特性，也对氧气敏感，但是根瘤中的固氮酶却有很高的固氮活性，这与根瘤细胞中含有大量的豆血红蛋白Ieghemoglobin,简称Lb，有着密切的关系，它对氧气具有极高的亲和力和快速的氧周转率，能促进氧气在细胞内的扩散并将氧气运输给呼吸作用，有效降低了根瘤细胞内类菌体周围的氧浓度，保证了同样对氧气敏感的固氮酶的活性，同时也保障了呼吸作用需氧和固氮作用需要的大量能量[6$。中国专利CN200380107352. 7和CN02138702. 8分别公开了利用表达豆血红蛋白改变植物贮藏储备物含量和提高植物抗涝能力。生物发酵工程的已有技术中也有应用其它血红蛋白体外重组表达而使产量提高的报导。豆血红蛋白有两个亚基构成，一个是球蛋白亚基，由豆科植物合成；另一个是血红素辅基，由共生的根瘤菌合成，两个亚基结合成为有活性的豆血红蛋白[6]。本发明人曾将大豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱茵衣藻产氢量提高了 50% (中国发明专利申请CN201010107922. 4)；
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用根瘤菌提高转基因莱茵衣藻产氢量的方法，并提供一种新思路，用于指导基因工程技术改造莱茵衣藻及其它具有相似代谢特征的微藻产氢代谢途径的方法，使之更适合于在与根瘤菌共培养的两步法产氢技术中提高莱茵衣藻或其它微藻生物量的累积和进一步促进产氢量的方法。本发明将慢生大豆根瘤菌与叶绿体中转化了大豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因莱茵衣藻Iba进行共培养，发现可以进一步提高转基因衣藻Iba的生物量积累和显著促进其产氢量的增加。本发明的方法为指导基因工程技术改造衣藻莱茵衣藻和在两步法广氢!技术中进一步提闻广氢!量提供新思路和实验基础。随着生物制氢!技术的发展，本发明将显现出越来越大的实用性和重要性本发明一方面提供了一种在两步法产氢技术中提高莱茵衣藻产氢量的方法，其特征在于将慢生大豆根瘤菌与莱茵衣藻共培养。在一个实施方案中，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻藻株cc849 (Chlamydomonasreinhardtii strain cc849)。优选地，所述莱茵衣藻为叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因莱茵衣藻藻株lba。在最优选的实施方案中，在共培养体系中慢生大豆根瘤菌的浓度为0D_ = I、莱茵衣藻的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L，藻液与菌液的体积比为40 1，共培养体系的产氢
量最大。本发明的另一方面提供了慢生大豆根瘤菌在两步法产氢技术中提高莱茵衣藻产氢量的用途。在一个实施方案中，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻藻株cc849。优选地，所述莱茵衣藻为叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因莱茵衣藻藻株lba。其中慢生大豆根瘤菌在两步法产氢技术的第一阶段促进莱茵衣藻藻株Iba的生长，以及在第二阶段提高莱茵衣藻藻株Iba的产氢量。本发明具有以下优点本发明的方法可以在两步法产氢技术中提高莱茵衣藻产氢量，在最优选的实施方案中，能够提高莱茵衣藻藻株Iba的产氢量达17倍之多。
图I莱茵衣藻cc849和转基因藻Iba分别与根瘤菌共培养的生长状况。图2不同根瘤菌浓度对莱茵衣藻cc849和转基因藻Iba产氢量的影响。图3正常TAP条件下cc849和Iba及其与根瘤菌共培养的呼吸速率。图4缺硫产氢条件下cc849和Iba及其与根瘤菌共培养时的呼吸速率。图5最佳产氢条件下cc849和Iba及其与根瘤菌共培养体系上方的氧气(A)和氢气⑶含量变化。
具体实施例方式—、莱茵衣藻培养A、选取细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849，购自美国Duke大学衣藻藻种库；转基因衣藻Iba为中国发明专利申请CN201010107922. 4中的方法构建B、培养莱茵衣藻藻种、
(a)莱茵衣藻培养条件温度25± 1°C ;日光灯光照强度100 200微摩尔光量子/平方米 秒；50 IOOml三羟甲基氨基甲烷-こ酸-磷酸盐(TAP)培养基液体培养，初始PH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天I %接种继代培养[10]；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉I. 5% ;挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每2至3周继代一次；C、产氢培养条件使用氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌制备缺硫TAP培养基；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min,收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装入培养管，培养瓶上方留IOml的空间，用翻ロ橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时；然后放在光照強度60微摩尔光量子/平方米 秒连续光照件下培养，温度25±1°C ;姆24小时进行气体成分和含量检测一次；D、用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛型号5X1/8,柱长2m,内径3mm,热 导检测器T⑶，以氩气作为载气，柱温50°C，进样温度200°C，热导检测温度300°C;测气体的组成和含量；ニ、慢生大豆根瘤菌培养慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)购于中国农业科学院,正常培养条件是28°C，黑暗培养，水平摇床转速200r/min，培养基是YEM (pH 7. 2)[11]，固体培养基含2 %琼脂，每3周继代一次保种。三、衣藻和根瘤菌共培养方法A、正常培养条件下纯净的衣藻cc849和Iba分别在正常TAP培养基中培养至对数期中期，将藻细胞密度调整为lX107cellS/mL。将根瘤菌培养至对数后期，将其4000g离心5分钟，用TAP培养基洗三遍去除YEM培养基，然后重悬于TAP培养基中，浓度调整至0D_为1.0。然后将30mL藻液与2mL根瘤菌分别在IOOmL的三角瓶中混合，培养条件为温度25°C，光照強度60 UmolnT2s'以纯净的莱茵衣藻cc849作为对照，培每天取ImL藻液，观察藻7天内的生长情況。B、缺硫产氢培养条件下分别取对数生长中后期的衣藻cc849和Iba培养液,5000r/min离心5min,收集细胞。收集后的藻细胞用全缺硫的培养基(TAP-S)洗三次，然后悬浮在TAP-S中，测定其叶绿素浓度，按照每管0. 5mg叶绿素的量分装在50mL的培养瓶内，同时将每种细菌的浓度调整为OD6tltl为1，分别按照藻液菌液(体积比)为8 1、20 1、80 1,200 1,400 I的比例加入每管藻液中，最后用TAP-S补充至40mL，密封，黑暗24小时呼吸耗氧以诱导氢酶的表达。然后放在连续光照的条件下培养，每隔24小时用微量进样器抽取瓶中气体，用高压气相色谱仪(GC)測定氢气和氧气的含量。从而得出最佳产氢量的菌液和藻液的体积比例。四、衣藻的生长情况检测每天取ImL藻液，用血细胞计数板在显微镜下数藻细胞数。五、光合速率和呼吸速率的检测在衣藻培养过程中，每天取样上下充分混匀后取2ml的藻液加入Hanstech Dff/1型氧电极仪的反应杯中，暗适应5分钟，同时记录反应杯中不同光照条件下的溶解氧下降的速率，即为呼吸作用耗氧的速率。然后在不同光照強度下检测溶解氧上升的速率，即为光合放氧速率。数据分析后按照下列公式计算，即为呼吸速率V = S K 60 1000/P其中v为吸氧活性，单位是UmolO2 *mg_1Chl S为曲线的斜率，单位是mirT1，K为常数，表示25°C下水中的溶氧量，单位是iimol02/ml，P为样品的叶绿素浓度，单位是mgChl/ml,60表示60min，1000表示记录纸的满量程为1000。实施例I正常条件下根瘤菌与cc849和Iba共培养的生长情况在两步法产氢技术的第一阶段，为了研究根瘤菌对衣藻生长的影响，将根瘤菌按照2ml 30ml的菌藻体积比分别与莱茵衣藻cc849和转基因藻Iba混合培养于正常TAP 培养基中，分别以纯净cc849和Iba为对照，每天检测培养液的藻细胞数(如图I所示)，结果显示cc849和Iba分别与根瘤菌共培养时，其生长的时间动态趋势与cc849和Iba分别単独培养时相似藻细胞均在培养的第I天进入对数生长期，在第3-4天左右达到饱和，之后趋于平稳。但是，根瘤菌与Iba共培养的藻细胞数明显高于Iba的藻细胞数，其在第四天最大藻细胞数约为3. 86 X IO7个/mL，比Iba单独培养的3. 06 X IO7个/mL提高了约27%，而根瘤菌与cc849共培养却未对cc849的生长产生显著影响，最大细胞数都约为3. 2X IO7个/mL。由此可见，正常条件下，转基因藻Iba的生长略低于cc849，但是加入了根瘤菌共培养后，其生长速度明显提高，并超过了 cc849的生长速度。因此，在两步法产氢技术的第一阶段，适合将根瘤菌加入到转基因衣藻Iba中，以获得最大生物量的积累。实施例2缺硫产氢条件下根瘤菌对cc849和Iba产氢的影响在两步法产氢技术的第二阶段，分别将根瘤菌按照不同的体积比分别与cc849和Iba混合于缺硫培养基中共培养，分别以纯净cc849和Iba单独培养为对照，连续检测产氢量的差别(如图2所示)。从图2可以看出，根瘤菌显著促进了 cc849和Iba产氢量积累，并且促进作用与藻菌的体积比有夫。当根瘤菌的浓度为0D_ = l、cc849和Iba的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L时，根瘤菌在藻液菌液(体积比)为40 I吋，即40mL藻液中加入ImL菌液,共培养体系的产氢量最大，达到约298. 54 u mol,是Iba单独培养产氢量的18. 2倍。根瘤菌对cc849产氢的促进作用相对较弱，在藻液菌液(体积比)为100 : I吋，SP40mL藻液中加入0. 4mL菌液，最大氢气累积量约为82. 95 u mol,仅为cc849单独培养的5. 5倍。此结果表明根瘤菌在适当比例范围内能显著提高莱茵衣藻的产氢量，尤其是对叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因衣藻Iba产氢作用具有非常显著的促进作用，可用于两步法产氢技术的第二阶段，来大幅度提高莱茵衣藻产氢效率。实施例3藻菌共培养体系的光合放氧和呼吸耗氧在正常TAP培养基中，用氧电极法检测了根瘤菌分别与cc849和Iba共培养对系统中光合放氧和呼吸耗氧的影响。结果表明根瘤菌与衣藻cc849和Iba共培养时均检测不到光合放氧现象，只能检测到呼吸耗氧(如图3所示)。在7天连续培养的前3天中，cc849和Iba単独培养时候的呼吸速率均呈现逐渐下降趋势，在第三天达到最低，约为4. 22
4.30 u mol O2. mg 1Chl. h \ 之后又略有回升，但基本稳定 4. 46 4. 70 u mol O2. mg 1Chl. h 1之间。当cc849和Iba分别与根瘤菌共培养后，系统的呼吸速率均呈现一直升高趋势，而且分别显著高于cc849和Iba分别单独培养时的呼吸速率，尤其是Iba与根瘤菌共培养的最大呼吸速率约为7.709 ii mol O2. Hig-1Chl. h—1，提高了 64%;而cc849与根瘤菌共培养的最大呼吸速率约为5.904 ii mol O2. H^1Chl. h—1，仅提高了 32%。此结果表明根瘤菌能显著提高其与莱茵衣藻共培养体系的呼吸耗氧速率，尤其是对叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因衣藻Iba呼吸速率的促进作用更显著。在缺硫产氢培养条件下，仍然检测不到根瘤菌与cc849和Iba共培养的光合放氧现象，但是在产氢培养的第一天，根瘤菌分别与cc849和Iba共培养液的呼吸速率均非常显著地升高(如图4所示)，尤其是与Iba共培养的藻液的呼吸速率高达约42. 4 u mo I
O2.mg_1chl. IT1,比Iba单独培养时提高了约7倍之多。而根瘤菌与cc849共培养的第一天的的呼吸速率约为34. 2 u mol02. Hig-1Chl. h'仅提高了 5倍。在产氢培养的第二天，藻菌共培养液的呼吸速率又迅速下降，到第三天时候降到零，只有単独培养的cc849和Iba可以检测到呼吸作用。由此可见，根瘤菌与莱茵衣藻共培养体系呼吸耗氧的显著增加是其产氢量显著提高的重要原因，尤其是根瘤菌与转基因藻Iba共培养体系，这种作用更明显，这个发现 为将来利用基因工程手段改造莱茵衣藻产氢代谢途径提供了新思路，可将根瘤菌的某些代谢途径在莱茵衣藻中表达，再结合与根瘤菌共培养的方法，进ー步提高莱茵衣藻的产氢量，将具有重要的指导意义。实施例4最佳产氢条件下藻菌混合培养体系中的氢气和氧气含量在两步法产氢技术的第二阶段，将根瘤菌分别与cc849和Iba以最佳产氢量的体积比混合共培养，其培养管上方的氧气含量和氢气含量的时间动态变化如图5A，B所示。图5A的结果显示在缺硫培养基中，与根瘤菌共培养的衣藻体系上方的氧气消耗的速度远远大于cc849和Iba単独培养体系的氧气消耗速度。黑暗培养24h后，cc849与根瘤菌共培养体系的氧气含量急剧降至6. 2%,之后12天一直保持在4% -5%左后；而Iba与根瘤菌共培养体系的氧气含量则急剧降至5. 0%，最低两天甚至降到只有2%。而cc849和Iba单独培养体系上方的氧气含量在黑暗24h后分别仅降至约25%和17%，直到培养的第六天才逐渐降到最低，分别约为7. 6%和4%，并保持在这ー较高的水平。相应的，与cc849和Iba分别单独培养相比，与根瘤菌共培养体系中的氢气积累量显著增加(如图5B所示)，尤其是Iba与根瘤菌共培养体系的最高氢气积累量达到约298iimol，提高了约17倍；而根瘤菌与cc849共培养体系的最大氢气积累量约为83 y mol，提高了约4. 5倍。cc849和Iba分别单独培养的最大产氢量约为16-17 y mol。由此可见，根瘤菌与莱茵衣藻共培养提高产氢的方法中，其根利于在叶绿体中表达了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因衣藻Iba的呼吸耗氧和产氢量的积累。这ー发现为为将来利用基因工程手段改造莱茵衣藻产氢代谢途径提供了新思路，可将根瘤菌的某些代谢途径在莱茵衣藻中表达，再结合与根瘤菌共培养的方法，进ー步提高莱茵衣藻的产氢量，将具有重要的指导意义。參考文献[I]Hemschemeier A, Melis A, Thomas Happe. Analytical approaches tophotobiological hydrogen production in unicellular green algae.PhotosynthesisResearch. 2009，102 :523-540[2]韩志国，李爱芬，龙敏南，韩博平.微藻光合作用制氢-能源危机的最終出路[J].生态科学.2003，22 (2) =104-108.
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权利要求
1.一种在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)两步法产氢技术中提高产氢量的方法，其特征在于将慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)与莱茵衣藻共培养。
2.根据权利要求I的方法，其中所述莱茵衣藻为莱茵衣藻藻株cc849。
3.根据权利要求I的方法，其中所述莱茵衣藻为叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因莱茵衣藻藻株lba。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，在共培养体系中慢生大豆根瘤菌的浓度为OD6tltl=I、莱茵衣藻的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L，藻液与菌液的体积比为40 I。
5.慢生大豆根瘤菌在莱茵衣藻两步法产氢技术中提高产氢量的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述莱茵衣藻为莱茵衣藻藻株cc849。
7.根据权利要求5的用途，其中所述莱茵衣藻为叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因的转基因莱茵衣藻藻株lba。
8.根据权利要求7的用途，其中所述慢生大豆根瘤菌在两步法产氢技术的第一阶段促进莱茵衣藻藻株Iba的生长，以及在第二阶段提高莱茵衣藻藻株Iba的产氢量。
全文摘要
本发明涉及生物制氢技术，具体涉及一种利用根瘤菌提高转基因莱茵衣藻产氢量的方法。本发明将慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japomcum)分别与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株cc849和叶绿体中转化了豆血红蛋白球蛋白亚基lba基因的转基因莱茵衣藻藻株lba在两步法产氢技术的第一阶段和第二阶段按一定体积比混合进行共培养，结果表明慢生大豆根瘤菌不仅在第一阶段促进莱茵衣藻藻株lba的生长，而且在第二阶段也显著提高了莱茵衣藻藻株lba的产氢量达17倍之多。
文档编号C12R1/41GK102732563SQ20121000783
公开日2012年10月17日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者吴双秀 申请人:中国科学院北京基因组研究所