专利名称：优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法
技术领域：
本发明涉及外源基因表达和生物制氢技术，具体地说是一种优化密码子提高外源 基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法。
背景技术：
光合生物制氢是未来清洁能源的重要来源之一，包括莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在内的许多微型绿藻和蓝藻可以在缺氧的条件下诱导细胞内的氢酶(H2aSe) 基因表达，将光合作用中产生的H+和e_合成H2，释放到细胞外。这项技术是利用太阳能生 产氢气的理想模式莱茵衣藻生长速度快，培养成本低，氢酶活性高，是极有开发潜力的微 藻光合制氢藻种。但是，氢酶对氧气极其敏感，很容易受氧气的抑制而失去活性，而氧气又 是衣藻光合作用的主要产物，这一对矛盾限制了衣藻产氢技术的应用。为了提高衣藻光合 产氢的效率，需要尽可能的降低衣藻细胞内的氧气含量或者提高氢化酶的氧耐受性。豆科植物根瘤中的固氮酶与氢酶有相似的特性，也对氧气敏感，但是根瘤中的固 氮酶却有很高的固氮活性，这与根瘤细胞中含有大量的豆血红蛋白leghemoglobin，简称 Lb，有着密切的关系。豆血红蛋白有两个亚基构成，一个是球蛋白亚基，由豆科植物合成；另 一个是血红素辅基，由共生的根瘤菌合成，两个亚基结合成为有活性的豆血红蛋白。豆血红 蛋白具有与氧气可逆结合、降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用的特性，既能维持根瘤细胞 内较低的氧气含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中国专利200380107352. 7 和02138702. 8分别公开了利用表达豆血红蛋白改变植物贮藏储备物含量和提高植物抗涝 能力。生物发酵工程的已有技术中也有应用其它血红蛋白体外重组表达而使产量提高的报 导。在植物细胞内，尤其是叶绿体中，存在着血红素辅基合成的前体，即可以通 过叶绿素合成途径的原扑啉在根瘤菌(Bradyrhizobium Japonicum)亚铁螯合酶 (ferrochelatase)催化下合成血红素辅基(Sangwan 和 0，Brain，1991 ；Santana 等，1998)。 本发明人曾将大豆血红蛋白球蛋白亚基Iba基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱 茵衣藻产氢量提高了 50% (中国发明专利申请号201010107922. 4)；将根瘤菌亚铁螯合酶 基因hemH与1 基因共同转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱茵衣藻产氢量提高了 4 倍(中国发明专利申请号201010115015. 4)。莱茵衣藻叶绿体基因表达的密码子具有明显的腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)偏向性 (Nakamura et al.，2000)，2002年，Franklin等在莱茵衣藻叶绿体中成功表达了密码子优 化的绿色荧光蛋白基因GFP基因，表达量提高了 80倍。随后在2003年和2004年Mayfield 等将密码子优化后的报告基因IuxCt转入莱茵衣藻叶绿体，该基因得到了成功表达并具有 活性。1991年Goldschmidt-Clermont构建的aadA基因表达原件之所以能用于莱茵衣藻叶 绿体转化筛选的标签是因为ζ在构建时考虑了它的密码子偏向性与衣藻叶绿体中密码子 的偏向性一致。Franklin和Mayfield 2004年指出莱茵衣藻的核基因组也具有密码子的偏 向性。2004年，Gustafsson等提出其它的一些生物体包括原核(Dos和flfernisch，2003)和真核生物(Kanaya等，2001)也具有密码子的偏向性。2005年，Liu等指出在高等植物中也 存在密码子的偏向性，同年Lavner和Kotlar指出人类基因组也存在密码子的偏向性。因 此，除了启动子、内含子和5’ UTRs和3’ UTRs之外，在外源基因的表达中密码子偏向性也是 一个重要的调控因子。因此发明一种利用密码偏向性进行密码子优化，并将优化后的hemHc基因和Ibac 基因转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，提高豆血红蛋白基因表达量和莱茵衣藻产氢量的方法 是十分重要的。本发明首次对豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和大豆血红蛋白球蛋白亚基基因 Iba按照衣藻叶绿体基因表达的A、U密码偏向性进行密码子优化，并将优化后的hemHc基 因和Ibac基因转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，结果使重组蛋白hemH和Lba的表达量提高 了 6. 8倍，使转基因莱茵衣藻的产氢量进一步提高了 22%。本发明方法解决了外源基因在 莱茵衣藻叶绿体中表达量低的技术难题，具有实用性，而且为进一步利用豆血红蛋白特性 提高衣藻产氢的生物工程技术提供理论和实验基础。随着生物制氢技术的发展，本发明将 显现出越来越大的实用性和重要性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对豆血红蛋白基因hemH和Iba的密码子偏向性进行 优化的方法，使之更适合于在莱茵衣藻叶绿体中表达，提高外源基因在莱茵衣藻叶绿体中 表达量和提高莱茵衣藻及其它微藻制氢产量的方法。本发明的目的是这样实现的一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，步骤如下(1)莱茵衣藻培养A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849 ；B、培养莱茵衣藻藻种(a)正常培养条件温度25 士 1°C ；日光灯光照强度100 200微摩尔光量子/平 方米·秒；50 100ml TAP培养基液体培养，初始pH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每 5 6天接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉1. 5% ；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线 方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、产氢培养条件在缺硫培养基中进行，把TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜 和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵 衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分 别装在培养瓶内，培养瓶上方留IOml的空间，橡皮塞密闭；黑暗条件下培养M小时，然后放 在连续光照件下培养，光照强度50 100微摩尔光量子/平方米 秒，温度25士 1°C ；每24 小时进行气体成分和含量检测一次；D、气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛5X1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测 器TCD，以氩气作为载气，柱温50°C，进样温度200°C，热导检测温度300°C ；(2)豆血红蛋白hemHc基因和Ibac基因的密码子优化和合成A、从GenBank中调取序列号为M9M27的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为V00453的大豆1 基因序列；B、将豆血红蛋白hemH基因和Iba基因的密码子对应的DNA核苷酸序列中第三位 碱基对应的DNA核苷酸序列中的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)； 分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶McII的酶切位点序列；在Ibac基因 的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma I和Mc I的酶切位点序列；C、将优化后的hemHc基因和Ibac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内 切酶酶切位点核苷酸序列进行核苷酸序列合成；(3) hemHc基因和Ibac基因的扩增A、以步骤O) C合成的hemHc基因和Ibac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链 式反应，分别扩增hemHc基因和Ibac基因；反应条件94°C预变性5min，一个循环；94°C变 性 30s，hemHc 基因 58°C, Ibac 基因 59°C;退火 30s，72°C延伸 1. 5min ；30 个循环；72°C延伸 15min ；反应产物分别纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；B、PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和Ibac基因转录表达检测的特异性引物hemHc基因的特异性引物为hemHc-Pl :权利要求
1. 一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，步骤如下(1)莱茵衣藻培养A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；B、培养莱茵衣藻藻种(a)正常培养条件温度25士1°C ；日光灯光照强度100 200微摩尔光量子/平方 米 秒；50 100ml TAP培养基液体培养，初始pH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉1.5% ；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法 接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、产氢培养条件在缺硫培养基中进行，把TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫 酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻 3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装 在培养瓶内，培养瓶上方留IOml的空间，橡皮塞密闭；黑暗条件下培养M小时，然后放在连 续光照件下培养，光照强度50 100微摩尔光量子/平方米·秒，温度25士 1°C ；每M小 时进行气体成分和含量检测一次；D、气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛5X1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器 TCD，以氩气作为载气，柱温50°C，进样温度200°C，热导检测温度300°C ；(2)豆血红蛋白hemHc基因和Ibac基因的密码子优化和合成A、从GenBank中调取序列号为M9M27的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为 V00453的大豆Iba基因序列；B、将豆血红蛋白hemH基因和Iki基因的密码子对应的DNA核苷酸序列中第三位碱基 对应的DNA核苷酸序列中的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)；将优 化后的基因命名为hemHc和Ibac ；分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶 SacII的酶切位点序列；在Ibac基因的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma I和Mc I的 酶切位点序列；C、将优化后的hemHc基因和Ibac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内切酶 酶切位点核苷酸序列进行核苷酸序列合成；(3)hemHc基因和Ibac基因的扩增A、以步骤O)C合成的hemHc基因和Ibac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链式反 应，分别扩增hemHc基因和Ibac基因；反应条件94°C预变性5min，一个循环；94°C变性 30s, hemHc 基因 58°C，Ibac 基因 59°C ；退火 30s，72°C延伸 1. 5min ；30 个循环；72°C延伸 15min ；反应产物分别纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；B、PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和Ibac基因转录表达检测的特异性引物hemHc基因的特异性引物为
2.根据权利要求1所述的优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法， 其特征在于TAP培养基为三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐培养基。
全文摘要
本发明涉及外源基因表达和生物制氢技术，优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法。现有技术外源豆血红蛋白基因hemH和lba在莱茵衣藻叶绿体中的表达效率低，影响莱茵衣藻产氢量的提高。本发明公开了一种对豆血红蛋白基因hemH和lba的密码子偏向性分别优化的方法，并将密码子优化后的hemHc和lbac基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达。本发明的优点是显著提高了外源重组蛋白的表达量，外源豆血红蛋白hemH和Lba在莱茵衣藻叶绿体中的表达量提高6.8倍；莱茵衣藻产氢量比转未优化密码子的hemH和lba基因的莱茵衣藻提高22％；本发明适用于具有密码偏向性的更多物种的外源基因表达调控。
文档编号C12R1/89GK102146344SQ20101052872
公开日2011年8月10日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者吴双秀, 王全喜, 许丽丽, 阎光宇, 黄瑞 申请人:上海师范大学