专利名称：一种多肽gapM1及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种新型多肽，称之为gapM1(globulardomain of adipose abundant manuscript 1，gapM1)及其制备方法。具体地说，本发明涉及gapM1的氨基酸序列和基因序列、基因密码子优化(无义突变)、蛋白质表达、蛋白质纯化以及功能测定。
背景技术：
apM1(adipose abundant manuscript 1，apM1)是由脂肪细胞等机体细胞分泌，具有降低血糖、血脂和体重等重要生理功能的血浆蛋白质。gapM1是全长apM1的球状结构域，是全长apM1的活性结构域。全长apM1和gapM1在体内同时存在，gapM1是由全长apM1经体内蛋白酶消化后的产物。全长apM1的球状结构域(gapM1)有137个的氨基酸残基。在机体发挥比全长apM1更强的生物学活性。
目前生产重组gapM1的方法有以下几种1)，专利WO01/51645A1公开了利用大肠杆菌表达系统，表达全长apM1，然后再模拟体内的代谢过程，用乙酰化胰蛋白酶将全长apM1的氨基端切除，从而生成gapM1。这种方法的缺点是生产工艺复杂，成本很高；大肠杆菌表达的全长apM1是以非活性形式的包涵体纯在，需要复性；加入蛋白酶后不利于纯化；得率非常低。2)，专利WO03/055916A2)公开了在CHO真核表达系统表达全长apM1，然后再利用上述酶切的方法得到gapM1。此种方法虽然表达的gapM1是以活性形式存在，但是CHO真核表达系统表达水平很低；生产周期很长，是大肠杆菌、酵母等表达系统的几十倍；同时此系统生产成本极高，生产过程难以操控；同样酶切过程加入蛋白酶后不利于下游纯化。3)，专利CN1380304是直接利用大肠杆菌系统表达gapM1，这种方法虽然省去了蛋白酶切的过程，但是gapM1是以非活性形式的包涵体存在，而且没有了氨基端后的球状结构域由于二级结构的特点(全β折叠结构)，比全长apM1更难在体外复性，得率是上述方法中是最低的；同时很难复性的gapM1在生产工艺绝大多数步骤中，可溶性很差，给生产过程带来极大不便。因上述已知技术存在的种种缺陷，导致国外gapM1的三期临床实验终因gapM1制备困难，不能满足实验需要而终止。
发明内容
本发明的目的是提供多肽gapM1及其制备方法。所述的多肽，为gapM1(globular domain of adipose abundant manuscript 1，gapM1)，gapM1具有序列2的氨基酸序列，由137个氨基酸残基组成。本发明提供的制备方法能克服已知技术的缺点，所制得的多肽gapM1具有以可溶性的活性形式表达，表达水平高，得率高，且生产工艺简单，生产成本低的优点。
本发明所述的多肽gapM1经密码子偏好设计(无义突变)后，利用PCR方法合成经过优化后的gapM1的基因片段，然后与表达载体重组，转化相应的表达细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞。工程菌或工程细胞经扩增，收集培养基上清，应用分离纯化方法获得高纯度目的蛋白。
所述编码gapM1的密码子具有序列1的核苷酸序列，其它编码gapM1的密码子序列是能编码相应氨基酸残基的任何密码子。
表1突变核酸序列(无义突变)A
B 将本发明的gapM1 cDNA片断与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明所述的表达载体是真核表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用真核表达载体，例如pPIC9K等。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明所述的表达细胞是真核表达细胞，能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用毕赤酵母菌GS115等。
本发明的表达产物以具有活性的可溶性形式存在于培养基上清中，培养基上清经超滤浓缩、分子筛、离子交换后进行纯化即获得有活性的gapM1。
本发明从人cDNA文库中或人腹部脂肪组织中获取gapM1基因。为了实现gapM1的高效表达，本发明对其cDNA序列进行密码子优化，从而实现了gapM1在不同表达系统中的高效表达。生产工艺比原核表达系统更容易放大，生产成本也更低。并且纯化后的gapM1显示出更强的降低血糖、血脂和体重等作用。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》。
图1是表达上清、纯化的电泳图和免疫印迹检测。
图2显示r-gapM1能够明显降低高血糖模型的血糖水平，其中分组1，高剂量r-gapM1组(7.5ug/gBW)，2，中剂量r-gapM1组(5ug/gBW)，3，低剂量r-gapM1组(2.5ug/gBW)，
4，生理盐水组，5，空白对照组。
图3显示r-gapM1能够明显降低急性高血脂模型的血脂水平，其中分组1，生理盐水组，2，低剂量r-gapM1组(2ug/gBW)，3高剂量r-gapM1组(6ug/gBW)。
图4显示r-gapM1能够明显降低肥胖模型的体重水平。
具体实施例方式
实施例1 gapM1基因的优化和制备(1)gapM1基因的优化及真核表达质粒rpPIC9K/gapM1的构建gapM1基因的优化方法为按照毕赤酵母密码子使用的偏好性将gapM1的cDNA进行优化改造。采用PCR方法，利用引物以野生性gapM1的cDNA为模板扩增出优化后的gapM1编码序列。优化后的基因与真核表达载体pPIC9K重组，核苷酸序列分析证实基因序列与预期相符。
gapM1密码子优化方法如下采用引物扩增法，根据酵母密码子使用的偏好性，合成引物，以野生性gapM1的cDNA序列为模板，进行PCR。PCR产物即为经过优化的gapM1的编码基因。优化后的编码基因经Xhol和NotI酶切后与pPIC9K重组。
上述限制性内切酶购自NEB公司，大肠杆菌DH5α、质粒pPIC9K、酵母菌GS115为Invitrogen公司产品。
(2)筛选高拷贝高效表达细胞株将质粒rpPIC9K-gapM1电转化毕赤酵母GS115，使其与酵母菌染色体发生重组，G418筛选高效表达细胞株。
筛选方法按照invitrogen说明书进行。
挑取上述阳性克隆接种于10ml低营养培养基BMGY〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗中，30℃快速振遥(250RPM)，培养过夜。次目测定光密度OD600，离心弃BMGY培液，用无菌水洗涤后用BMMY培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗稀释至OD600＝1。每天补加体积百分数为1％的甲醇两次，诱导培养3天，离心弃沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清与2x上样缓冲液等体积混合后取20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约16kd处有一浓集的条带，经扫描，目的蛋白约占上清总蛋白的60％；上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。
(3)发酵表达工程细胞株按上述筛选高表达细胞株作为工程细胞株，然后以30L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱培养2-3天。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于10ml BMGY培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液。再将一级种子液加入1000ml培养液中，30℃培养6-8小时，直至OD600＝6，此为二级种子液。种子菌接入后，自然扩增，待基础培养基中预加的甘油被耗尽以后，开始补充甘油，补充速度16ml/L/h，待OD600达到120左右，停止补加甘油。待培养液中甘油全部耗尽后，开始甲醇诱导。甲醇补料速度从1ml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，以后一直维持此速度。本发明的发酵技术是用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。
甲醇诱导30h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。发酵参数为温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。
(4)超滤浓缩脱盐将离心所获上清经Millipore超滤装置(NMWL3000kD，Millipore公司)超滤浓缩至0.4L。
(5)凝胶过滤Sephacryl 100(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH6.4)平衡后，将超滤浓缩液上样。然后用PB洗脱，流速1ml/min，收集蛋白峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析以20倍体积的20mmol/L PB(pH6.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的目的蛋白峰以30ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280达0.00，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB pH6.4)线性梯度洗脱，收集蛋白峰，分装，冷冻干燥，-80℃保存。
(7)纯度鉴定及分子量测定样品进行15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS扫描测定纯度、分子量。同时HPLC进一步鉴定纯度。所得产品纯度96％以上，分子量约16kD。
实施例2 gapM1的性质测定应用本发明所制备的gapM1进行活性测定，证实其具有降低血糖、血脂即体重的作用。
(1)降低血糖活性的测定，方法给予C57BL/6J小鼠腹腔一次性注射高剂量链脲霉素(STZ)，造成胰岛素抵抗型糖尿病模型。对照组给予生理盐水，治疗组给予rgapM1，4小时后测小鼠的空腹血糖水平。
结果见图2。结果显示rgapM1具有明显降低血糖的作用；(2)降低血脂活性的测定，给予C57BL/6J小鼠尾静脉注射一定剂量的脂肪乳剂，造成急性高血脂模型。然后于一小时后腹腔注射一定剂量的rgapM1，对照组给予生理盐水，一小时后取血测血脂水平。
结果见图3.结果显示rgapM1具有明显降低血脂的作用(3)减肥活性测定给3月龄C57BL/6J小鼠高脂饮食十周，造成饮食性肥胖小鼠模型。对照给予生理盐水和继续给予高脂饮食。治疗组给予一定量的rgapM1，每天一次，继续给予高脂饮食。二周后治疗组体重开始下降。
结果见图3，可见gapM1具有明显的降低体重的作用。
实施例3本发明方法与已有技术优势比较之前的已有技术生产方法是在大肠杆菌系统表达rgapM1，表达的rgapM1是以包涵体形式(非活性形式)存在。所以在rgapM1被表达、纯化后需要复性的过程。由于空间结构的特点导致了变性后复性的困难，直接的结果就是生产得率低，生物学活性低。同时由于复性过程的复杂性，使得复性后的蛋白存在活性不均一和活性不能完全恢复天然活性的问题。
本发明方法的优点在于利用真核表达系统，rgapM1合成后被宿主细胞分泌到培养基中，以可溶的并且具有天然活性的蛋白形式存在。同时，分泌到培养基中的蛋白种类很少，在量上以重组居多，故利于下游工艺的操作，使的得率更高，生产成本降低。
表2是本发明方法与已有技术方法的比较。
表2 无需进一步详细阐述，相信采用上述所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>gapM1的一种制备方法<130>Fudan-1206<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>411<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(411)<400>1gcc tat gtt tac aga tca gct ttc tcc gtt ggt ttg gag act tac gtt48Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val1 5 10 15act atc cca aac atg cca att aga ttt acc aag atc ttc tac aat cag96Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln20 25 30caa aac cac tat gat ggc tcc act ggt aaa ttc cac tgc aac att cct144Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro35 40 45ggg ctg tac tac ttt gcc tac cac atc aca gtc tat atg aag gat gtg192Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val50 55 60aag gtc agc ctc ttc aag aag gac aag gct atg ctc ttc acc tat gat240Lys Val Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp65 70 75 80
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Gln Tyr Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu85 90 95His Leu Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly100 105 110Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr115 120 125Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn130 13权利要求
1.一种多肽gapM1，具有序列2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的多肽gapM1的制备方法，其特征是包括下述步骤，gapM1经密码子偏好设计(无义突变)，利用PCR方法合成经过密码子偏爱性优化后的gapM1的基因片段，然后与表达载体重组，转化相应的表达细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞，工程菌或工程细胞经扩增，收集培养基上清，用分离纯化方法获得高纯度目的蛋白，所述编码gapM1的密码子具有序列1的核苷酸序列。
3.根据权利要求2的制备方法，其中所述的表达载体是真核表达载体。
4.根据权利要求3的制备方法，其中所述的表达载体是pPIC9K。
5.根据权利要求2的制备方法，其中所述的表达细胞是真核表达细胞。
6.根据权利要求4的制备方法，其中所述的表达细胞是毕赤酵母GS115。
7.根据权利要求2的制备方法，其中所述的分离纯化方式是超滤后，进行分子筛和离子交换层析。
8.权利要求1的多肽gapM1在制备降低血糖药物中的用途。
9.权利要求1的多肽gapM1在制备降低血脂药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一种多肽gapM1及其制备方法，所述多肽具有序列2的氨基酸序列。gapM1经密码子偏爱性设计(无义突变)后，用PCR方法合成优化的gapM1的基因片段，与表达载体重组，转化相应的表达细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞，经扩增，收集培养基上清，分离纯化获得高纯度目的蛋白。所制得的多肽具有以可溶性的活性形式表达，表达水平高，得率高，具有良好的降低血糖、血脂和体重等作用。本发明制备方法克服已知技术的缺点，具有生产工艺简单，生产成本低的优点。
文档编号A61K38/17GK1740195SQ200510025128
公开日2006年3月1日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者汤其群, 刘宏磊, 李希, 宋后燕 申请人:复旦大学