专利名称：抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂制备方法
技术领域：
本发明属于 一种大豆根瘤菌剂的制备技术，主要涉及抗咪唑乙 烟酸大豆根瘤菌剂的制备方法。
背景技术：
农田土壤中大豆根瘤菌侵染大豆根毛表皮细胞后刺激细胞加速 分裂而形成根瘤，在根瘤内部根瘤菌可将空气中的氮气转化为大豆 可以利用的氨态氮素营养，同时根瘤菌利用大豆提供的营养维持生 存。咪唑乙烟酸是目前大豆田目前广泛应用的长残留性土壤兼茎叶 处理除草剂，由于咪唑乙烟酸在大豆生产中的长期大量应用造成对 大豆根圈环境的严重破坏，导致大豆根瘤菌侵染大豆根毛形成根瘤 能力降低、根瘤数量减少，使固氮活性和效率降低而造成大豆产量 和品质下降。为了解决咪唑乙烟酸长期大量应用所造成的大豆根瘤 菌侵染大豆根毛形成根瘤能力的降低和固氮活性下降这一降低大豆 根瘤固氮效率、导致大豆产量降低的难点问题，生产上常常采取降 低咪唑乙烟酸用量的方法，但结果却导致对大豆田杂草防除能力的 降低。
发明内容
本发明的目的就是针对上述已有技术存在的问题，研究提供一 种抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂制备方法，利用本方法培育生产的抗 咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂接种大豆后，以解决大豆才艮瘤菌因受咪唑 乙烟酸的影响导致的根瘤数减少、固氮效率降低这一 大豆生产中制
约产量和品质提高的难题。
本发明的目的是这样实现的
① 、在蔗糖酵母膏培养基中加入咪唑乙烟酸，使蔗糖酵母膏培 养基中的咪唑乙烟酸浓度为100mg/L;将上述蔗糖酵母膏培养基在 每个摇瓶中装入150ml，在120—125。C条件下灭菌30—40分钟，冷 却后挑取一环具有高效固氮活性的大豆根瘤菌加入摇瓶中，在28 — 30。C条件下培养5 — 7天，得培养基液备用；
② 、在蔗糖酵母膏培养基中加入咪唑乙烟酸，使蔗糖酵母膏培 养基中的咪唑乙烟酸浓度为200mg/L;将此咪唑乙烟酸浓度的蔗糖 酵母膏培养基在每个摇瓶中装入150ml，在120—125。C条件下灭菌 30—40分钟，冷却后再将上述①中得到的培养基液挑取一环接种到 灭菌后含咪唑乙烟酸浓度为200mg/L的蔗糖酵母膏培养基中，在28 —3(TC条件下培养5 — 7天，得培养基液备用；
③ 、依此类推，重复②的作业过程，每次在蔗糖酵母膏培养基 中增加100mg/L的咪唑乙烟酸，直至蔗糖酵母膏培养基中咪唑乙烟 酸浓度为500mg/L;
@、把咪唑乙烟酸浓度为500mg/L的蔗糖酵母膏培养基中具有 抗性的大豆根瘤菌进行纯系分离后保存于斜面试管中；
⑤、把纯系分离后的抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌在蔗糖酵母膏斜 面试管基中培养为一级菌种，再将该一级菌种在灭菌的蔗糖酵母膏 培养基摇瓶中扩繁培养为二级菌种；对含有6%豆粉、8%麦麸、2%食 盐、1%甘露醇、PH值为7.5 — 7.8的水溶液培养基进行灭菌冷却后 接种二级菌种，在28 — 30。C条件下发酵培养48 — 72小时，过滤后 得到液态抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂，或者选择固定载体添加抗咪 唑乙烟酸大豆根瘤菌液内制成固态抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂产
口Po
本发明的工艺技术简单，制剂产品生产成本低廉，其制剂产品 性能质量好，在长期大量使用咪唑乙烟酸的大豆产区应用抗咪唑乙 烟酸根瘤菌剂，使大豆形成大量的根瘤，并提高根瘤固氮活性和效 率，解决了咪唑乙烟酸对大豆根瘤固氮的伤害，从而提高大豆产量
和品质。
具体实施例方式
下面详细描述本发明的实施方式。
本发明利用目前已经推广应用的具有高效固氮活性大豆根瘤 菌，在蔗糖酵母膏培养基中逐步提高咪唑乙烟酸浓度，在咪唑乙烟 酸高压选择条件下培育抗性大豆根瘤菌，经纯系分离后形成抗咪唑 乙烟酸大豆根瘤菌原原种，将原原种挑取到斜面试管中形成一级菌 种，再将一级菌种扩繁形成二级菌种接种到发酵罐进行菌剂生产。
详细工艺过程如下 一种抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂制备方法
① 、在蔗糖酵母膏培养基中加入咪唑乙烟酸，使蔗糖酵母膏培 养基中的咪唑乙烟酸浓度为100mg/L;将上述蔗糖酵母膏培养基在 每个摇并瓦中装入150ml，在120—125。C条件下灭菌30—40分钟，冷 却后挑取一环具有高效固氮活性的大豆根瘤菌加入摇瓶中，在28— 3(TC条件下培养5 — 7天，得培养基液备用；
② 、在蔗糖酵母膏培养基中加入咪唑乙烟酸，4吏蔗糖酵母膏培 养基中的。米唑乙烟酸浓度为200mg/L;将此咪唑乙烟酸浓度的蔗糖 酵母膏培养基在每个摇瓶中装入150ml，在120—125。C条件下灭菌 30—40分钟，冷却后再将上述①中得到的培养基液挑取一环接种到 灭菌后含咪唑乙烟酸浓度为200mg/L的蔗糖酵母膏培养基中，在28 一30。C条件下培养5 — 7天，得培养基液备用； ③、依此类推，重复②的作业过程，每次在蔗糖酵母膏培养基
中增加100mg/L的咪唑乙烟酸，直至蔗糖酵母膏培养基中咪唑乙烟 酸浓度为500mg/L;
、把咪唑乙烟酸浓庋为500mg/L的蔗糖酵母膏培养基中具有 抗性的大豆才艮瘤菌进行纯系分离后保存于斜面试管中；
、把纯系分离后的抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌在蔗糖酵母膏斜 面试管基中培养为一级菌种，再将该一级菌种在灭菌的蔗糖酵母膏 培养基摇瓶中扩繁培养为二级菌种；对含有6%豆粉、8%麦麸、2%食 盐、1%甘露醇、PH值为7.5 — 7.8的水溶液培养基进^f亍灭菌冷却后 接种二级菌种，在28 —30。C条件下发酵培养48_72小时，过滤后 得到液态抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂，或者选择固定载体添加抗咪 唑乙烟酸大豆根瘤菌液内制成固态抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂产
口口 o
本发明提出了制备抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂的方法，该方法 生产的抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂接种大豆后，通过多年、多点较 大种植面积种植科研实验证明，使用该方法提供的抗咪唑乙烟酸大
豆根瘤菌剂可使大豆根瘤数平均每抹增加14个，固氮酶活性提高 35.9%，大豆蛋白质含量增加5. 2%,大豆平均增产15°/。以上，解决了 咪唑乙烟酸施用后导致大豆根瘤数减少、固氮效率降低这一 大豆生 产中制约大豆产量和品质提高的难题，提高了大豆品质和产量，增 产效果显著。
权利要求
1、一种抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂制备方法，其特征是:①、在蔗糖酵母膏培养基中加入咪唑乙烟酸，使蔗糖酵母膏培养基中的咪唑乙烟酸浓度为100mg/L；将上述蔗糖酵母膏培养基在每个摇瓶中装入150ml，在120—125℃条件下灭菌30—40分钟，冷却后挑取一环具有高效固氮活性的大豆根瘤菌加入摇瓶中，在28—30℃条件下培养5—7天，得培养基液备用；②、在蔗糖酵母膏培养基中加入咪唑乙烟酸，使蔗糖酵母膏培养基中的咪唑乙烟酸浓度为200mg/L；将此咪唑乙烟酸浓度的蔗糖酵母膏培养基在每个摇瓶中装入150ml，在120—125℃条件下灭菌30—40分钟，冷却后再将上述①中得到的培养基液挑取一环接种到灭菌后含咪唑乙烟酸浓度为200mg/L的蔗糖酵母膏培养基中，在28—30℃条件下培养5—7天，得培养基液备用；③、依此类推，重复②的作业过程，每次在蔗糖酵母膏培养基中增加100mg/L的咪唑乙烟酸，直至蔗糖酵母膏培养基中咪唑乙烟酸浓度为500mg/L；④、把咪唑乙烟酸浓度为500mg/L的蔗糖酵母膏培养基中具有抗性的大豆根瘤菌进行纯系分离后保存于斜面试管中；⑤、把纯系分离后的抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌在蔗糖酵母膏斜面试管基中培养为一级菌种，再将该一级菌种在灭菌的蔗糖酵母膏培养基摇瓶中扩繁培养为二级菌种；对含有6％豆粉、8％麦麸、2％食盐、1％甘露醇、PH值为7.5—7.8的水溶液培养基进行灭菌冷却后接种二级菌种，在28—30℃条件下发酵培养48—72小时，过滤后得到液态抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂，或者选择固定载体添加抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌液内制成固态抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂产品。
全文摘要
抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌剂制备方法属于菌剂制备技术；本方法利用具有高效固氮活性大豆根瘤菌，在蔗糖酵母膏培养基中逐步提高咪唑乙烟酸浓度，在咪唑乙烟酸高压选择条件下培育抗性大豆根瘤菌，经纯系分离后形成抗咪唑乙烟酸大豆根瘤菌原原种，将原原种挑取到斜面试管中形成一级菌种，再将一级菌种扩繁形成二级菌种接种到发酵罐内进行菌剂生产；本方法工艺技术简单，生产成本低廉，其制剂产品性能质量好，使用中解决了咪唑乙烟酸对大豆根瘤固氮的伤害，提高大豆产量和品质。
文档编号C12R1/41GK101381691SQ20081013736
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月22日 优先权日2008年10月22日
发明者伟 丁, 茁 程 申请人:东北农业大学