专利名称：一种使用液相色谱-质谱检测转基因大豆中痕量黄酮类代谢物的方法
技术领域：
本发明涉及利用液相色谱-质谱联用技术检测转基因大豆中痕量黄酮类代谢物的方法及黄酮类物质分子印迹聚合物的合成方法。
背景技术：
自抗草甘膦转基因大豆商品化以来，已经建立了不少的检测方法，以检测核酸为目标的各种PCR检测技术以及PCR快速检测试剂盒；以检测外源蛋白为目标的ELISA检测技术以及酶联免疫快速检测试纸条、试剂盒，这些检测方法都可以为鉴定转基因作物以及为转基因作物的环境安全评价提供技术支持。但是自中国2009年批准转基因水稻和转基因玉米生产安全证书的释放，成为第一个批准主粮商业化种植的国家后，对转基因作物安全性评价、特别是转基因作物在食品安全性评价方面提出更高的要求。生物信息是按DNA — mRNA—蛋白质一代谢产物方向流动的，代谢物是细胞调控过程的终产物，它们的种类和数量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应 (Fiehn, 2002)，转基因作物均是通过调控基因的表达来控制目的性状的改变，基因表达上极微小的变化即可导致代谢物种类、含量、分布的大幅改变。因此，对转基因作物代谢物的分离鉴定，检测分析可以为生物安全、特别是食品安全相关预警信号提供一个预知平台。由于植物代谢物在时间和空间都具有高度的动态性(Stitt et al.，2003)，尤其是次生代谢物种类繁多、结构迥异，且产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，难于进行分离分析，所以人们一直在寻找更为强大的检测分析工具与方法。对代谢组的分析力求可检测样品中的每种代谢物，并可监测各种条件变化下代谢物的变化。 在转基因产品的食品安全分析上，利用代谢组学工具发现外源基因在目标植物体内表达的相关代谢物标志物可以为转基因产品在安全性评价方面提供一种新的技术。代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析(Metabolomic fingerprinting)，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法，比较不同样品中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析(Metabolomic profiling)，研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究，再结合模式识别方法，有可能找出与之相关的生物标志物(Biomarker)。用于代谢物检测的主要技术手段是核磁共振(NMR)，质谱(MS)，色谱(HPLC，GC)。 对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征，由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物。此外，质谱分析发现，代谢产物的同质性不高，由于缺乏均勻性，使色谱分析变得更加困难，无法识别出样品中的未知物质。采用核磁共振(NMR)的方法，可以弥补色谱的不足，但由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。因此，对代谢产物的分析最大的挑战就是对代谢产物的识别以及高效的检测方法。抗草甘膦转基因大豆中外源EPSPS基因的表达可能导致黄酮类代谢物在种类以及含量上的差异，我们探索通过分析转基因与非转基因大豆间黄酮类代谢物的差异，进而判断是否是转基因大豆的技术难点在于如何分离富集大豆中的黄酮，提高检测的灵敏度和特异性。本发明就是利用可以特异性吸附黄酮的分子印迹聚合物作为分离富集材料，从基质中分离黄酮，并与液相色谱_质谱联机建立在线检测方法，实现转基因大豆中痕量黄酮的准确检测。
发明内容
利用液质联用技术痕量检测转基因大豆中黄酮类代谢物的方法。1、一种可以检测转基因大豆植株中痕量黄酮的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于使用具备对转基因大豆植株中黄酮类化合物有特异性吸附的分子印迹材料作为填充材料的固相萃取柱与液相色谱-质谱仪在线联用，实现对转基因大豆中痕量黄酮的准确检测。2、黄酮分子印迹材料的制备方法包括下面两个步骤1)使用芦丁作为模板分子，二烯丙基胺作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，模板分子、交联剂和功能单体按照摩尔比例为1 6 9溶解到含水30%的乙醇中，加入引发剂偶氮二异丁腈，缓慢通入氮气15min，365nm紫外光照射引发聚合12h ；2)反应结束后，产物经过粉碎、过筛，取粒径大小为80-125 μ m的颗粒，以50mL乙醇和50mL 1. Omol L—1盐酸的混合溶液搅拌洗涤6h，用体积比为9 1的乙醇-冰乙酸混合溶液索氏提取24h，进一步去除模板分子，将除去模板分子的聚合物在70°C真空干燥10h， 即可作为固相萃取柱的填充材料；3、分子印迹材料在固相萃取柱中的填料量决定于萃取柱的容量，一般为萃取柱体积的5%，本发明使用容积为2毫升的萃取柱，分子印迹材料填料为10毫克；4、固相萃取柱与流动注射仪的连接方式为将流动注射仪的出样端与固相萃取柱的进样端联接，萃取柱的出样端与液相色谱进样口相联，通过液相色谱分离和质谱检测可以同时检测大豆植株中27种黄酮类化合物，具体化合物见下表
权利要求
1.一种可以检测转基因大豆植株中痕量黄酮的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于使用具备对转基因大豆植株中黄酮类化合物有特异性吸附的分子印迹材料作为填充材料的固相萃取柱与液相色谱-质谱仪在线联用，实现对转基因大豆中痕量黄酮的准确检测。
2.权利要求1所述及的黄酮分子印迹材料，其制备方法包括如下步骤1)使用芦丁作为模板分子，二烯丙基胺作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，模板分子、交联剂和功能单体按照摩尔比例为1 6 9溶解到含水30%的乙醇中， 加入引发剂偶氮二异丁腈，缓慢通入氮气15min，365nm紫外光照射引发聚合12h ；2)反应结束后，产物经过粉碎、过筛，取粒径大小为80-125μ m的颗粒，以50mL乙醇和 50mLl. Omol Γ1盐酸的混合溶液搅拌洗涤6h，用体积比为9 1的乙醇-冰乙酸混合溶液索氏提取24h，进一步去除模板分子，将除去模板分子的聚合物在70°C真空干燥10h，即可作为固相萃取柱的填充材料。
3.权利要求1所述及的固相萃取柱其特征在于所使用的分子印迹材料填料为10毫克。
4.权利要求1所述及的检测方法，其特征在于将固相萃取柱通过流动注射仪与液相色谱_质谱仪连接，可以同时检测大豆植株中27种黄酮类化合物。
全文摘要
本发明涉及一种准确检测转基因大豆中痕量黄酮的液相色谱-质谱联用检测方法，其主要的技术要点是使用芦丁作为模板分子，二烯丙基胺作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，模板分子、交联剂和功能单体按照摩尔比例为1∶6∶9溶解到含水30％的乙醇中，加入引发剂偶氮二异丁腈，缓慢通入氮气15min，365nm紫外光照射引发聚合12h，合成分子印迹材料作为固相萃取柱的填充材料，将所制备的固相萃取柱与液相色谱-质谱通过流动注射仪联接，建立在线检测方法，实现对转基因大豆中痕量黄酮的准确检测。所建立的检测方法可以为鉴定抗草甘膦转基因大豆提供一种新的手段。
文档编号G01N30/02GK102466660SQ20101054558
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者林敏 , 王俊平, 王俊英 申请人:中国农业科学院生物技术研究所