专利名称：基于芯片纳流液相色谱/质谱的类黄酮代谢轮廓分析方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，是ー种基于芯片纳流液相色谱/质谱联用(LC-Chip/MS)的大豆类黄酮代谢轮廓分析的方法。
背景技术：
现代分析化学发展的ー个重要方向就是发展微量化、集成化的分离分析新方法。为了提高分析的灵敏度和通量，降低分析成本和样本消耗量，发展微量化、集成化的分析方法已成为当前研究的前沿领域。纳流液相色谱技术是上世纪九十年代发展起来的ー门技术，因其具有样本消耗小、分析速度快和易集成化的优点吸引了研究者的广泛关注，成为微型化分析领域中的研究热点。最近出现的芯片纳流液相色谱/质谱系统(LC-Chip/MS)把纳流液相系统的样本浓缩和分离功能与电喷雾质谱仪中使用的复杂连接和喷雾器无缝地整合在一起，大幅度降低了泄漏和系统无效体积，简化了工作流程，提高了分析的灵敏度和 可靠性。目前LC-Chip/MS技术已被用于蛋白质组、寡糖等研究，其易操作、灵敏度高及样本消耗量少的特点在代谢组学研究方面亦有很大优势，但迄今为止基于LC-Chip/MS的代谢组学轮廓分析技术鲜见报道。类黄酮是广泛分布于植物中的一大类衍生化合物，目前已知的类黄酮化合物有3000-4000种，其中食品中的主要类黄酮大致分为四类，分别为黄烷酮、黄酮、黄酮醇和异黄酮。目前研究较多的是大豆中的异黄酮，其作为大豆生长过程中的一类次生代谢产物，因具有预防癌症、心血管疾病及骨质疏松症等生理功能而备受关注。除异黄酮外，大豆中的其他黄酮类化合物也具有不同的生理功能，如对其含量及分布进行研究，并与代谢途径相关联，则可以获取更加全面、完整的信息。到目前为止，对大豆中黄酮类物质分析的文献报道大都局限于测定某几个黄酮类代谢物或水解后的总黄酮含量，仅有的几篇轮廓分析的报道也需要二次提取及纯化过程。而相对快速的提取及分析不仅可以减小人力物力的消耗，而且可以大大提高分析的通量。LC-Chip/MS分析系统作为仪器微型化的代表，除可以减小进样量外，其关键组成部分-芯片也具有较强的灵活性，我们采用订制的高富集容量芯片不仅可以大幅度提高检测灵敏度，简化样品预处理过程，在优化的分离分析条件下还可实现更多黄酮类化合物的分离分析。该方法具有操作简单、灵敏度高的优点，可对不同种植环境及遗传背景的大豆样本进行分析为大豆类黄酮的进ー步研究提供依据。
发明内容
本发明的目的在于建立ー种大豆类黄酮代谢轮廓分析的芯片纳流液相色谱/质谱方法，使预处理过程更为简单，样品用量更少，并可获得更多黄酮类代谢物信息。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下—种大豆类黄酮代谢轮廓分析的芯片纳流液相色谱/质谱(LC-Chip/MS)方法(I)加入提取液的大豆种子样本超声离心后，上清液直接上样分析，样品预处理过程简单，无须富集等预处理过程；(2)上清液直接上样分析，采用高富集容量芯片及优化的分离分析条件，可实现更多黄酮类化合物的轮廓分析，I U L样品在22分钟内可获得大豆中73种黄酮类化合物的代谢轮廓；高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、长150mm分析柱及喷针组成，富集柱及分析柱的填充材料均为Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通过六通阀相连，喷针固接于分析柱
的一端。具体步骤如下，(I)称取一定量的大豆种子样本 于玻璃管中，向每支管中加入含内标柚皮素、异槲皮苷及芦丁各0. 5-2 u g/mL的提取溶剂(含甲醇10-30%的水溶液)，超声10-20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于芯片纳流液相色谱/质谱联用分析。(2)LC-Chip/MS分析方法的具体參数为本分析最终选用的是高富集容量芯片，该芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 y mX 150mm)及喷针(10 y m ID)组成，富集柱及分析柱的填充材料均为Zorbax SB-C18 (5 y m)。富集柱和分析柱通过六通阀相连，富集柱的两端分别与六通阀的接ロ①④相连，分析柱的一端与六通阀的接ロ③相连，喷针固接于分析柱的另一端，六通阀的接ロ②作为流动相端、其通过nano泵与流动相A和B相连，六通阀的接ロ⑥废液端、即废液出ロ端，六通阀的接ロ⑤作为试样端、其通过毛细管泵与洗脱液和试样存储容器相连。富集时，芯片通过毛细管泵接通试样端和废液端引入试样存储容器中的样品并在富集柱上实现富集，此时六通阀的接ロ⑤、④、①、⑥依次连通，试样端洗脱液为含体积2%的こ腈水；样品分析时，通过nano泵接通流动相端和分析柱，样品进入分析通道，此时六通阀的接ロ②、①、④、③依次连通；分析流动相A为含体积0. 1%甲酸的水溶液，B为含体积
0.I % 甲酸的 ZJ青；梯度洗脱条件=Omin 时 90/10 (A/B, V/V)，13min 时 70/30 (A/B, V/V)，18min 时 5/95 (A/B，V/V)并保持 4min，22. Imin 时 90/10 (A/B，V/V)，随后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)平衡8min ;其中0_13min为第一段线性梯度洗脱、13_18min为第二段线性梯度洗脱，18-22. Imin为第三段梯度洗脱；毛细管泵的流速为4-6 V- L/min, nano泵的流速0. 3-0. 6 u L/min ;进样量为
0.1-1 U L，进样后富集柱冲洗体积为3-4 y L ;分析柱的柱后流出液未经分流导入质谱系统检测；质谱条件为电喷雾离子源，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度300°C，干燥气流速为4L/min ;毛细管电压为1800-1900V ;Centroid模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z 100 1000 ;在上述条件下可获得大豆类黄酮的代谢轮廓谱，即大豆类黄酮LC-Chip/MS分析的TIC图(图I)。本发明具有的效果是样本的储存、预处理及分析均采用自主建立的标准化程序，避免引入人为误差。所采用的预处理过程简单，不需要二次富集及纯化，可避免目的化合物的部分损失，同时减小了预处理过程误差，保证了分析方法的稳定性。采用微型化分析仪器及自主订制的高容量富集芯片，在优化的分析条件下节省了分析时间和样品用量，提高了分析通量，与预处理过程相结合可鉴定更多的目标化合物。另外，采用不同类型的内标及质量控制样本校正预处理过程和实验中仪器响应微小漂移带来的误差，进ー步确保了该方法的稳定性。对样本中9个特征离子的方法重复性考察结果见表1，其相对标准偏差为I. 50-7. 66%,进ー步证明了本专利所阐述方法的稳定性。
图I大豆类黄酮LC-Chip/MS分析的TIC图(A)及典型离子的EIC图⑶。图2不同种植地点大豆样本的PLS-DA得分图。每个点表示ー 个样本，t表示样本在主成分投影值。 :种植地点济南，▲:种植地点吉林。 图3为本发明中高富集容量芯片结构示意图。图中I洗脱液，2废液，3富集柱，4流动相，5分析柱，6喷针。
具体实施例方式实施例II.大豆种子样本采集5个大豆品种分别为吉育73、长农16、九农30、荷豆12、中黄13。其中吉育73、长农16和九农30的种植地点为吉林。荷豆12和中黄13的种植地点为济南。大豆种子样本采集后放在_80°C冰箱保存。2.分析方法2. I大豆种子样本预处理大豆种子样本从_80°C冰箱中取出，在干燥器中等待其温度恢复至室温。将每种大豆种子样本放在粉碎机中粉碎，过60目筛，得到粒径均一的粉末。将大豆种子粉末分装至塑料管中，备用。称取5个品种大豆种子样本各3份(姆份0. Ig),分别置于5mL玻璃管中。称取每种大豆种子样本0. 5g，混合均匀，作为质量控制(QC)样本。然后称取QC样本6份(姆份0. Ig),分别置于5mL玻璃管中。称取内标柚皮素0. 4mg及异槲皮苷、芦丁各I. 6mg于I. 5mL离心管中，加入ImL乙腈。斡旋，超声，使之完全溶解，获得浓度分别为柚皮素0. 4mg/mL、异槲皮苷I. 6mg/mL、芦丁I. 6mg/mL的混标溶液。取IOmL 7欠，39. 95mL甲醇，超声混匀作为提取溶剤，向提取溶剂中加入上述混标溶液50 u L，混匀后共50mL提取溶剤。向每个玻璃管中加入2mL提取溶剂，超声20分钟。取出ImL移至eppendorf管中，于4°C，14000rpm下离心10分钟，将上清液移至进样瓶。2. 2芯片纳流液相色谱/质谱联用分析如图3所示，高富集容量芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 V- mX 150mm)及喷针(10 y m ID)组成，富集柱及分析柱的填充材料均为ZorbaxSB-C18(80A, 5iim)。富集柱和分析柱通过六通阀相连，富集柱的两端分别与六通阀的接ロ①④相连，分析柱的一端与六通阀的接ロ③相连，喷针固接于分析柱的另一端，六通阀的接ロ②作为流动相端、其通过nano泵与流动相A和B相连，六通阀的接ロ⑥废液端、即废液出ロ端，六通阀的接ロ⑤作为试样端、其通过毛细管泵与洗脱液和试样存储容器相连；芯片通过毛细管泵接通试样端和废液端引入样品(试样存储容器)并在富集柱上实现富集，此时六通阀的接ロ⑤、④、①、⑥依次连通，试样端洗脱液为含体积2%的こ腈水；样品分析时，通过nano泵接通流动相端和分析柱，样品进入分析通道，此时六通阀的接ロ②、①、④、③依次连通。分析流动相A为含体积0.1%甲酸的水溶液，B为含体积0.1%甲酸的こ臆。梯度洗脱条件(其中0-13min为第一段线性梯度洗脱、13-18min为第二段线性梯度洗脱，18-22. Imin为第三段梯度洗脱)0min时90/10 (A/B, V/V)，13min时 70/30 (A/B, V/V)，18min 时 5/95 (A/B, V/V)并保持 4min, 22. Imin 时 90/10 (A/B, V/V)，随后起始梯度90/10 (A/B，V/V)平衡8min。毛细管泵的流速为4 y L/min，nano泵的流速
0.30 u L/min ;进样量为I y L，进样后富集柱冲洗体积为4 y L，分析采用反冲模式以减小谱带展宽；柱后流出液未经分流导入质谱系统检测。质谱条件为电喷雾离子源(ES I)，采 用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剤，干燥气温度300°C，干燥气流速为4L/min ;毛细管电压为1800-1900V ;Centroid模式采集质谱数据；质量扫描范围m/zlOO 1000。在上述条件下可获得大豆类黄酮LC-Chip/MS分析的TIC图。15个大豆种子样本的芯片纳流液相色谱/质谱分析顺序为随机进行，在分析过程中,先将QC样进样一次，然后每分析3个样本后，再将QC样进样一次，通过保证QC样本保留时间和响应信号的重现性，确保实验过程中芯片纳流液相色谱/质谱联用仪有较好的稳定性。结果提示，整个分析时间内QC样本的重复性良好，没有出现明显的组分变化，保留时间没有出现飘移，表I和表2为方法重复性和仪器精密度的考察結果。3.模式识别及标志物筛选为了考察不同种植地点的大豆类黄酮代谢轮廓差别，我们采用定性分析软件(MassHunter Qualitative Analysis)对所有大豆种子样本的黄酮类化合物进行峰提取形成ー个数据矩阵，即把每个样本的測量数据匹配成ー张由保留时间、质量数和峰面积构成的峰表，同时通过总峰面积归ー化来减少系统误差。然后利用SMCA-P 11.5(Umetrics,Umea, Sweden)进行 PLS-DA 分析。非參数检验采用 SPSS 13. 0 (SPSS Inc. , Chicago, IL)进行。图2是不同种植地点大豆的PLS-DA得分图。从中可知，9个种植地点为吉林的大豆样本和6个种植地点为济南的大豆样本的投影在第一主成分上可以得到很好的分离，表明不同种植地点的大豆样本的类黄酮代谢轮廓存在明显的区別。将VIP > I. 0的信息提取并进行独立样本非參数检验，通过非參数检验的变量(P < 0. 05)认为是对分类有重要贡献的化合物，它们分别是 glycitein 0-hexoside，genistein 0-hexoside，daidzeinO-hexosidemalonylated, daidzein 0-hexoside malonylated 等黄酮类物质(表3)。基于本方法操作简单、灵敏度高的优点，可对不同品种及遗传背景的大豆样本中的类黄酮做进ー步分析，为其深入研究提供依据。表I大豆类黄酮LC-Chip/MS分析方法的重复性考察(n = 4)
权利要求
1.基于芯片纳流液相色谱/质谱的类黄酮代谢轮廓分析方法，其特征在于 (I)加入提取液的大豆种子样本超声离心后，上清液直接上样分析；(2)上清液直接上样分析，高富集容量芯片分离分析条件高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、长150_分析柱及喷针组成，富集柱及分析柱的填充材料均为Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通过六通阀相连，喷针固接于分析柱的一端。
2.根据权利要求I所述方法，其特征在于步骤(I)中称取大豆种子样本于玻璃管中，向每支管中加入含内标柚皮素、异槲皮苷及芦丁各O. 5-2μ g/mL的提取溶剂，提取溶剂为含甲醇10-30%的水溶液，超声10-20分钟后离心，上清液用于LC-Chip/MS分析。
3.根据权利要求I所述方法，其特征在于 富集柱和分析柱通过六通阀相连，富集柱的两端分别与六通阀的接口①④相连，分析柱的一端与六通阀的接口③相连，喷针固接于分析柱的另一端，六通阀的接口②作为流动相端、其通过nano泵与流动相A和B相连，六通阀的接口⑥废液端、即废液出口端，六通阀的接口⑤作为试样端、其通过毛细管泵与洗脱液和试样存储容器相连。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于 步骤(2)选用的是高富集容量芯片，该芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75μπι)、分析柱(75ymX150mm)及喷针(ΙΟμπι ID)组成，富集柱及分析柱的填充材料均为ZorbaxSB-C18(80A,5um)； 富集时，芯片通过毛细管泵接通试样端和废液端引入试样存储容器中的样品并在富集柱上实现富集,此时六通阀的接口⑤、④、①、⑥依次连通,试样端洗脱液为含体积2%的乙腈水； 样品分析时，通过nano泵接通流动相端和分析柱，样品进入分析通道，此时六通阀的接口②、①、④、③依次连通；分析流动相A为含体积O. 1%甲酸的水溶液，B为含体积O. 1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件=Omin 时 90/10 (A/B, V/V)，13min 时 70/30 (A/B, V/V)，18min 时5/95 (A/B,V/V)并保持 4min，22. Imin 时 90/10 (A/B，V/V)，随后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)；其中0-13min为第一段线性梯度洗脱、13_18min为第二段线性梯度洗脱，18-22. Imin为第二段梯度洗脱； 毛细管泵的流速为4-6 μ L/min, nano泵的流速O. 3-0. 6 μ L/min ;进样量为O. 1-1 μ L,进样后富集柱冲洗体积为3-4 μ L ;分析柱的柱后流出液未经分流导入质谱系统检测； 质谱条件为电喷雾离子源，采用正离子模式检测；使用高纯Ν2辅助喷雾电离与脱溶齐U，干燥气温度300°C，干燥气流速为4L/min ;毛细管电压为1800-1900V ;质量扫描范围m/Z 100 1000 ;在上述条件下可获得大豆类黄酮的代谢轮廓谱。
全文摘要
本发明公开了一种大豆类黄酮代谢轮廓分析的芯片纳流液相色谱/质谱方法，采用简单的样本预处理方法，在高富集容量芯片及优化的分离分析条件下，微小进样量即可实现73种黄酮类化合物的轮廓分析。本发明的分析方法简单、快速，样本用量小且重复性好，适合于实际样本的批量分析。
文档编号G01N30/02GK102768246SQ20111027378
公开日2012年11月7日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年5月6日
发明者吴泽明, 周佳, 常玉玮, 许国旺, 赵春霞, 路鑫 申请人:中国科学院大连化学物理研究所