一种测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法及测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种乳制品的污染物测定方法，特别涉及一种测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法及测定方法。
【背景技术】
[0002]磺胺类药物，如磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等，已用作兽药。由于科技的进步和人民生活水平的提高，对食品中残留的抗微生物药物越来越重视。欧盟、美国FDA以及日本等许多国家和监管机构都已经对该类抗生素在食品中的残留限量都作了明确的规定。我国也加强了该类抗生素在牛奶以及其它动物源性食品中的残留监控。
[0003]目前，牛奶中磺胺类药物检测的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱-串联质谱法。酶联免疫法应用局限于原奶等白奶类样本，不适合检测配方调制牛奶样本。现有的牛奶中磺胺类药物含量测定方法是GB/T 22966-2008《牛奶和奶粉中16种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》。但使用该方法处理朱古力牛奶、咖啡牛奶、花生牛奶等配方调制奶样本时，这些颜色深、基质复杂的样本经过pH=2高氯酸溶液提取后，提取液中的杂质不能完全沉淀，致使样本溶液难以通过HLB萃取柱，很难进行下一步实验操作，导致不能满足此类样本的日常检测。此外，该方法中使用高氯酸，操作和储存都具有一定危险，不利于使用者的安全。
[0004]《动物源食品磺胺类药物残留GPC法测定》(中国公共卫生2009年5月第25卷第5期)公开了一种以乙酸乙酯提取肉类样品的前处理方法和测定方法。但是此方法的检测对象是鸭肉等，若用该方法处理牛奶样品，会发生乳化现象，实际样品回收率低于60% ；且GPC法前处理操作步骤繁琐，检测耗时，不利于工厂样品批量性检验；此外，该方法有机溶剂用量很大，还使用三氟乙酸溶液作为流动相，使用三氟乙酸作为流动相的色谱柱，需用大量的水和有机相进行清洗维护，不利于环境保护。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法，简单快捷，而且对环境污染小。
[0006]本发明的目的是提供一种配方奶中磺胺类药物的测定方法，其操作简单快速，且回收率和精密度较高。
[0007]本发明提供了一种测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法，包括以下步骤:称取配方奶样品，先按每2g配方奶样品加入2-4mL体积分数为1%的乙酸水溶液，混匀，再按每2g配方奶样品加入10-15mL甲醇，混匀后离心；取离心后的上清液并蒸发除去甲醇，再按每2g配方奶样品加入5-7mL体积分数为1%的乙酸水溶液，得到稀释提取液；净化稀释提取液，净化的步骤为:将稀释提取液通过已活化的固相萃取柱，再用水淋洗固相萃取柱并弃去流出液；然后用甲醇洗脱，收集即得到净化液；以及将净化液蒸干，再按每2g配方奶样品加入0.5-2mL体积分数为20%的甲醇水溶液，即得复溶液，将复溶液经滤膜过滤，即得到待测液。
[0008]在本发明的测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法中，将上清液蒸发除去甲醇步骤，当上清液的体积小于加入甲醇之前样品溶液的体积时，即可认为甲醇已经通过蒸发除去。
[0009]在测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法的一种示意性实施方式中，离心的转速为5000r/min-8000r/min，离心时长为5-10分钟。
[0010]在测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法的一种示意性实施方式中，将上清液蒸发除去甲醇步骤，采用50°c水浴旋转蒸发。
[0011]在测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法的一种示意性实施方式中，固相萃取柱为HLB固相萃取柱，其活化方法为AXHLB固相萃取柱，用3-5mL甲醇过柱，再用3_5mL水过柱，得到已活化的HLB固相萃取柱；净化的步骤为:稀释提取液以I滴/秒的流速通过已活化的HLB交换固相萃取柱，再用3mL水淋洗固相萃取柱并弃去流出液；然后用3_5mL甲醇洗脱，收集即得到净化液。
[0012]在测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法的一种示意性实施方式中，固相萃取柱为C18固相萃取柱，其活化方法为:取C18固相萃取柱，用3-5mL甲醇过柱，再用3_5mL水过柱，得到已活化的C18固相萃取柱；净化的步骤为:稀释提取液以I滴/秒的流速通过已活化的C18交换固相萃取柱，再用3mL水淋洗固相萃取柱并弃去流出液；然后用3-5mL甲醇洗脱，收集即得到净化液。
[0013]在测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法的一种示意性实施方式中，净化液蒸干的方法为，将净化液在50°C水浴中氮气吹干。
[0014]在测定配方奶中磺胺类药物的样品前处理方法的一种示意性实施方式中，复溶液经0.22 μ m有机系滤膜过滤。
[0015]本发明还提供了一种配方奶中磺胺类药物的测定方法，通过本发明的样品前处理方法得到待测液，再以UPLC-MS (超高效液相色谱-串联质谱)法检测。
[0016]在配方奶中磺胺类药物的测定方法的一种示意性实施方式中，UPLC-MS的色谱参数为:色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3柱(Φ2.1X100毫米，1.8微米);柱温:30°C ;进样体积:5 μ L ;流动相:流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1%的甲酸水溶液；梯度洗脱:O分钟，25%流动相Α，其余部分为流动相B ;0至1.0分钟，25%至60%流动相Α，其余部分为流动相B，曲线6 ; 1.0至3.0分钟，60%流动相Α，其余部分为流动相B，曲线6 ;3.0至5.0分钟，25%流动相Α，其余部分为流动相B，曲线I ;洗脱液流速:0.3毫升/分钟。其中曲线6和曲线I是表示液相色谱质谱仪器流动相比例变化的方式:曲线6指A、B两相由一个梯度呈45°角线性变化到另一个梯度，曲线I则为由一个梯度瞬时变化到另一个梯度。
[0017]在配方奶中磺胺类药物的测定方法的一种示意性实施方式中，UPLC-MS的质谱条件为:液相色谱-串联质谱法的质谱条件为:离子化模式:电喷雾正离子模式；质谱扫描方式:多反应监测；电离电压:3.00千伏；离子源温度:120°C ;去溶剂气温度:380°C ;去溶剂气:氮气；流量:650升/小时；碰撞气:高纯Ar ;流量:20升/小时。
[0018]在配方奶中磺胺类药物的测定方法的一种示意性实施方式中，本发明的样品前处理方法得到待测液，以HPLC法检测，使用紫外检测器或荧光检测器。
[0019]牛奶若采用《动物源食品磺胺类药物残留GPC法测定》(中国公共卫生，2009)的方法，即使用乙酸乙酯提取时，比较容易出现乳化现象，从而影响样品的提取效率。尤其是磺胺嘧啶，其回收率达不到60%，不能满足分析工作的要求；若采用本发明的测定方法，磺胺嘧啶的平均回收率可提高至70%-110%，能够满足GB/T 27404-2008附录F.1中关于回收率的相关规定(60%-120%)。
[0020]不仅如此，根据《动物源食品磺胺类药物残留GPC法测定》(中国公共卫生，2009)中介绍的方法，其溶剂配制约30分钟，称样约10分钟，加入乙酸乙酯匀浆5分钟，超声提取10分钟(提取2次)，离心5分钟，旋转浓缩约10分钟(浓缩2次)，凝胶渗透色谱柱的制备约30分钟，凝胶渗透色谱柱洗脱净化40分钟，上机检测时间约24分钟。该方法共9个步骤，其中，前处理最少需要2小时45分钟，上机检测约24分钟，共耗时189分钟。本发明的方法，若由相同技能程度的人员进行操作:溶液配制约30分钟，称样约10分钟，加入乙酸漩涡提取I分钟，加入甲醇漩涡提取I分钟，离心5分钟，取上清液浓缩10分钟，经HLB固相萃取柱净化约30分钟，洗脱固相萃取柱并氮气吹干约20分钟，最后溶解样品上机检测5分钟。本发明的测定方法共9个步骤，其中，样品前处理时间约I小时49分钟，上机检测时间5分钟，共124分钟。与上述现有技术方法相比较，本发明可节约34%的时间，大大提高了工作效率。
【具体实施方式】
[0021]为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本发明的【具体实施方式】。虽然本发明实施例只使用了磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶三种药物，但也适用于其他磺胺药物。
[0022]实施例1:前处理方法。
[0023]称取2g配方奶(分别为朱古力牛奶、咖啡牛奶和花生牛奶)样品，先加入2mL体积分数为1%乙酸水溶液，混匀；再加入1mL甲醇，混匀后离心(离心的转速为5000r/min，离心时间5min);将上清液50°C水浴旋转蒸发除去甲醇，再加入5mL 1%乙酸水溶液，即得到稀释提取液；将稀释提