慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻彼此促进生长的方法
【专利摘要】本发明涉及生物制氢技术，具体地说是利用慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻彼此促进生长的方法。本发明将慢生大豆根瘤菌（以下简称根瘤菌）与另外三种莱茵衣藻藻株cc124（以下简称124）、藻株cc503（以下简称503）和转基因莱茵衣藻hemHc-lbac（以下简称hemHc-lbac）分别在正常培养基和缺硫培养基中共培养，结果表明莱茵衣藻与根瘤菌的生长都受到促进，并且在产氢衰减之前根瘤菌聚集在衣藻细胞周围生长，说明莱茵衣藻与根瘤菌存在阶段性互惠共生现象。本发明为进一步拓宽根瘤菌的寄主范围、促进莱茵衣藻大规模培养的生物量累积、可再生生物能源生产、改善生态环境提供实验基础和新思路。
【专利说明】慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻彼此促进生长的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制氢技术，具体地说是利用慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻彼此促进生长的方法。
【背景技术】
[0002]煤、石油、天然气等化石燃料的大量使用造成了严重的环境问题；另一方面这些能源的储量有限，长期无节制的使用造成了目前的能源短缺。氢气是一种燃烧清洁、燃烧热值高、利用形式多样的可再生生物能源，是未来清洁能源体系的重要组成部分。微藻光合制氢技术是利用微藻和太阳能在特殊条件下生产氢气的技术，被认为是未来氢气的可持续清洁生产的重要途径。绿藻中的莱茵衣藻reinhardtii)氢化酶活性高,生长周期短，培养成本低，遗传背景清晰，便于进行分子操作，是国际上公认的研究绿藻生物制氢的模式物种。
[0003]衣藻产氢量与其生物量密切正相关。目前对衣藻产氢的研究几乎都是基于Melis提出的缺硫“两步法”，而硫元素是植物生长的必需营养元素，缺硫会抑制衣藻生物量增加。有研究报道指出某些细菌可以促进藻类的生长，例如郑天凌等发现赤潮藻类塔马亚历山大藻与盐敏芽孢杆菌共培养时，对双方生物量积累均有一定的促进作用Jetswaart等发现缺陷假单胞菌和泡囊假单胞菌这两种专性需氧菌与藻类共同培养可以促进栅藻和小球藻的生长。因此，利用某些细菌与藻类共培养有可能促进藻类的生物量累积。
[0004]日本慢生大豆根瘤 菌(Mradyrhizobium japoni cum')属于慢生型根瘤菌的一种，具有上述根瘤菌的一切生理特性。专利CN201210007835.0曾经将慢生大豆根瘤菌与莱茵衣藻藻株cc849和转基因莱茵衣藻藻株Iba混合共培养，发现可以显著提高衣藻的产氢量，并且能促进藻株Iba的生长。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种慢生大豆根瘤菌iBradyrhizobium japoni cum)和莱茵mChlamydomonas reinhardtii )彼此促进生长的方法,将慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻藻株在培养基中共培养，使慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻的产量均有较大提高。
[0006]在本发明的一个实施方案中，所述莱茵衣藻藻株为ccl24、cc503或转基因莱茵衣藻hemHc-lbac,优选为转基因莱茵衣藻hemHc-lbac。
[0007]在本发明中，在共培养体系中，慢生大豆根瘤菌的浓度为OD6tltl = 1.0，莱茵衣藻的细胞浓度为0D75(i=2.0，藻液与菌液的体积比为20~60: 1，优选为25:1。所述培养基为正
常培养基和缺硫培养基。
[0008]本发明将慢生大豆根瘤菌(以下简称根瘤菌)与另外三种莱茵衣藻藻株ccl24(以下简称124)、藻株cc503 (以下简称503)和转基因莱茵衣藻hemHc-lbac (以下简称hemHc-lbac)分别在正常培养基和缺硫培养基中共培养，结果表明莱茵衣藻与根瘤菌的生长都受到促进，并且在产氢衰减之前根瘤菌聚集在衣藻细胞周围生长，说明莱茵衣藻与根瘤菌存在阶段性互惠共生现象。本发明为进一步拓宽根瘤菌的寄主范围、促进莱茵衣藻大规模培养的生物量累积、可再生生物能源生产、改善生态环境提供实验基础和新思路。
【具体实施方式】
[0009]下面将进一步的详细举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
[0010]莱茵衣藻(C reinhardtii )藻株ccl24、cc503购自美国莱茵衣藻中心(Chlamydomonas Resource Center, http: / / chlamyco I lection, org/)，转基因莱茵衣藻藻株hemHc-lbac由本实验室许丽丽构建(构建方法参见上海师范大学硕士论文:密码子优化对豆血红蛋白基因在莱茵衣藻叶绿体中表达和产氢的影响，作者许丽丽，2011年)。缺硫培养基(简称TAP-S)是把正常培养基内的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌。日本慢生大豆根瘤菌(汉應)购于中国农业科学院。
[0011]实施例1正常培养基中共培养
在正常TAP培养基中将转基因莱茵衣藻hemHc-lbac培养至对数期中期(OD75tl值约为
2.0左右)，在YEM培养基中将根瘤菌培养至对数期后期(0D_值约为1.0)，分别4000g离心5分钟，用TAP培养基洗3遍去除去原TAP培养基和YEM培养基的影响；按照20:1的藻液和菌液的体积混合比例，将根瘤菌和莱茵衣藻分别加入到三角瓶中混合培养。培养条件为:温度 25 0C ±rc,光照强度为 60 μ mo I.m_2.s-1。
[0012]实施例2-7
除下表参数外，其他同实施例1
【权利要求】
1.一种慢生大豆根瘤菌{Bradyrhizobium japonicum)和莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii )彼此促进生长的方法,其特征在于,将慢生大豆根瘤菌和莱茵衣藻藻株在培养基中共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述莱茵衣藻藻株为ccl24、cc503或转基因莱茵衣藻hemHc-lbac。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述莱茵衣藻藻株为转基因莱茵衣藻hemHc—lbacο
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在共培养体系中，慢生大豆根瘤菌的浓度为OD6tltl = 1.0,莱茵衣藻的细胞浓度为0D75(i=2.0,藻液与菌液的体积比为20~60: I。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述藻液与菌液的体积比为25: I。
6.根据权利要求1所 述的方法，其特征在于，所述培养基为正常培养基和缺硫培养基。
【文档编号】C12N1/20GK104017763SQ201410303327
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】吴双秀, 李德志, 许丽丽, 王全喜 申请人:中国科学院北京基因组研究所