专利名称：一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种干细胞诱导方法，具体地说是一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达多巴胺能神经元成熟所必须的Nurrl基因的方法。
背景技术：
Nurrl 基因(Nuclear related factor I)又称之为 N0T/TINUR/RNR-1/HZF-3,作为即早基因产物，属于孤儿核受体超家族。Nurrl蛋白几乎完全集中表达在中枢神经系统内，与神经干细胞向多巴胺能神经元分化及多巴胺能神经元生存和发展关系密切。研究表明,Nurrl蛋白能够通过多种途径激活酪氨酸轻化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)启动子， 促进TH的表达。此外，还影响多巴胺能神经元代谢，促进中脑多巴胺能神经元前体细胞向多巴胺能神经元分化，并在分化的维持及晚期分化的信号转导中起决定性作用。帕金森(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，发病率仅次于阿尔茨海默病。其基本的病理改变是特异性的中脑黑质多巴胺能神经元的渐进性变性坏死，致使纹状体内多巴胺神经递质减少，引起锥体外系的功能失调，从而产生静止性震颤、肌肉强直等一系列运动障碍症状。目前，临床上尚无有效的治疗H)的方法。理论上讲,细胞移植替代治疗是最为理想的治疗途径。目前，体外获得的多巴胺能神经元多由胚胎干细胞(ESCs)或神经干细胞(NSCs)诱导分化而成。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量的有限，在一定程度上都限制了其未来的的临床移植应用。有研究表明，在多因子诱导条件下可将来源更为丰富的间充质干细胞可诱导分化为多巴胺能神经元，但阳性率较低。为了进一步提高阳性率，目前，国内主要采用Nurrl基因修饰间充质干细胞的方法来提高Nurrl基因的表达，使其更易向多巴胺能神经元分化。但对于未来的临床应用，基因修饰方法也存在一定的风险。如何通过非基因修饰的方法使得间充质干细胞自身高表达Nurrl基因，是目前急需解决的重要课题。此外，国内目前研究向多巴胺能神经元分化的间充质干细胞多来自骨髓、脐血等。 与之相比，脐带源的间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UC_MSCs)取材更为方便、体外扩增能力更强且免疫原性低。在短时间内即可获得数量充足、安全而且适于移植应用的细胞，是未来临床应用更为理想的种子细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达 Nurrl基因的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurrl基因的方法，在添加了维甲酸(RA)、环化腺核苷一磷酸(CAMP)和Sonic Hedgehog(SHH)的DMEM/F-12培养体系中诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurrl基因。所述的诱导方法，其特征在于DMEM/F_12培养体系添加的RA为10_6 M 10_4 M、CAMP 为 O. 5 mM 2 mM 和 SHH 为 200 ng/mL 750 ng/mL。所述的诱导方法，其特征在于上述的培养体系添加的RA的优选量为1(T5M，CAMP 的优选量为I HiM和SHH的优选量为500 ng/mL。具体包括以下步骤
1)取2 8代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80% 90%融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取5 10 mL O. OlM磷酸缓冲液PBS轻轻加入T75培养瓶内洗涤，弃去洗液；
2)加入(质量/体积比)0.25%胰蛋白酶-O. 01%乙二胺四乙酸EDTA消化液I. O mL, 浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
3)加入20mL O. 01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T25培养瓶中接种5X IO5个人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为含体积比浓度为5%胎牛血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的 DMEM/F-12 完全培养液，添加了 1(T5 M RAU mM CAMP和 500 ng/mL SHH，总体积为 5 mL/瓶， 置37 C，5% 二氧化碳培养箱中培养2 4天。本发明的有益效果是通过体外诱导，而非基因修饰的方法使间充质干细胞高表达Nurrl基因，更利于移植应用。与现有技术相比，本诱导方法可以使间充质干细胞Nurrl 基因的表达明显增高(约为诱导前的23倍)，使其更易向多巴胺能神经元分化，且避免了由基因修饰所带来的风险，为临床提供更为理想的种子细胞。诱导使用的间充质干细胞可以来源于骨髓、脐血、脂肪等组织，但最好是取自脐带来源。与胚胎干细胞、神经干细胞或其他来源的间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞取材方便、易于体外扩增、免疫源性低且合乎伦理学要求，可在短时间内为临床提供适用于移植应用的细胞。
图I是PCR检测UC-MSCs诱导前后的Nurrl表达情况 I: UC-MSCs诱导前β-actin的表达情况；
2: UC-MSCs诱导前Nurrl的表达情况；
3: UC-MSCs诱导后12h Nurrl的表达情况;
4: UC-MSCs诱导后24h Nurrl的表达情况;
5: UC-MSCs诱导后48h Nurrl的表达情况;
6: UC-MSCs诱导后72h Nurrl的表达情况。图2是Real-time检测UC-MSCs诱导前后的Nurrl表达情况
1=Nurrl在未诱导的MSC中的表达情况；
2:诱导72h后，Nurrl的表达情况。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。
本发明体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurrl基因的方法，在添加了 RA、 CAMP和SHH的DMEM/F-12培养体系中诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurrl基因。所述DMEM/F-12培养体系添加的RA为1(Γ6Μ 1(Γ4Μ ,CAMP为O. 5 mM 2 mM和 SHH 为 200 ng/mL 750 ng/mL。下面通过具体实施例叙述
实施例一
I.诱导
(1)取P4代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80%-90%融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取10 mL O. OlM憐酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)轻轻加入T75培养瓶内洗涤，弃去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates， EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL 0.01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T25培养瓶中接种5X IO5个人脐带间充质干细胞；
(4)培养体系为含5%胎牛血清，10011/1^青霉素，10(^8/1^链霉素的01^1/^-12完全培养液，添加了 KT6M RA,O. 5 mM CAMP 和 200 ng/mL SHH，总体积为 5 mL/瓶。置 37 C， 5% 二氧化碳培养箱中培养2 4天。2. Nurrl基因的鉴定
采用RT-PCR和real time PCR检测诱导后的人脐带间充质干细胞中Nurrl基因的表达水平。具体方法为用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)试剂并参照试剂盒说明书提取诱导前及诱导后12、24、48和72小时的人脐带间充质干细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板进行反转录，获得cDNA。50 uL反转录体系为5XMLV反转录缓冲液10 uL， dNTPs(10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制剂 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水补足至50 uLo然后以合成的cDNA为模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引导下进行PCR扩增，20 uL的PCR反应体系为10 XPCR缓冲液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，双蒸水14 uLo同时以人β-actin基因为内参,其引物序列为Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明， 与诱导前相比，诱导后的人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平明显增高。同时,用real time PCR进一步确定诱导前后人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平。具体方法为采用Roche LightCycIer 2.0系统。使用前,将LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 试剂盒内的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并将实验所需毛细管(Roche)放入毛细管冰盒内(Roche)。在每个毛细管内加入如下反应体系水(PCR级)9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I μ L，Master Mix4 μ L , cDNA 5 μ L。根据扩增显示的Cp (crossing point)值,计算基因表达量的变化。 反应独立重复3次，以消除系统误差。结果从RNA水平上看，诱导后人脐带间充质干细胞内 Nurrl基因的表达水平约为诱导前的8倍。实施例二 I.诱导
(1)取P4代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80%-90%融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取10 mL O. OlM憐酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)轻轻加入T75培养瓶内洗涤，弃去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL 0.01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T25培养瓶中接种5X IO5个人脐带间充质干细胞；
(4)培养体系为含5%胎牛血清，10011/1^青霉素，10(^8/1^链霉素的01^1/^-12完全培养液，添加了 KT5M RA、I. O mM CAMP 和 500 ng/mL SHH，总体积为 5 mL/瓶。置 37 C， 5% 二氧化碳培养箱中培养2 4天。3. Nurrl基因的鉴定
采用RT-PCR和real time PCR检测诱导后的人脐带间充质干细胞中Nurrl基因的表达水平。具体方法为用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)试剂并参照试剂盒说明书提取诱导前及诱导后12、24、48和72小时的人脐带间充质干细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板进行反转录，获得cDNA。50 uL反转录体系为5XMLV反转录缓冲液10 uL， dNTPs (10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制剂 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水补足至50 uLo然后以合成的cDNA为模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引导下进行PCR扩增，20 uL的PCR反应体系为10 XPCR缓冲液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，双蒸水14 uLo同时以人β-actin基因为内参,其引物序列为Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明， 与诱导前相比，诱导后的人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平明显增高。同时,用real time PCR进一步确定诱导前后人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平。具体方法为采用Roche LightCycler 2.0系统。使用前,将LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 试剂盒内的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并将实验所需毛细管(Roche)放入毛细管冰盒内(Roche)。在每个毛细管内加入如下反应体系水(PCR级)9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I μ L，Master Mix 4 μ L , cDNA 5 μ L。根据扩增显示的Cp (crossing point)值,计算基因表达量的变化。 反应独立重复3次，以消除系统误差。结果从RNA水平上看，诱导后人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平约为诱导前的20倍。实施例三 I.诱导
(1)取P4代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80%-90%融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取10 mL O. OlM憐酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)轻轻加入T75培养瓶内洗涤，弃去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL O. 01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T25培养瓶中接种5X IO5个人脐带间充质干细胞；
(4)培养体系为含5%胎牛血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM/F12完全培养液，添加了 KT4M RA,2. O mM CAMP 和 750 ng/mL SHH，总体积为 5 mL/瓶。置 37 C， 5% 二氧化碳培养箱中培养2 4天。2. Nurrl基因的鉴定
采用RT-PCR和real time PCR检测诱导后的人脐带间充质干细胞中Nurrl基因的表达水平。具体方法为用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)试剂并参照试剂盒说明书提取诱导前及诱导后12、24、48和72小时的人脐带间充质干细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板进行反转录，获得cDNA。50 uL反转录体系为5XMLV反转录缓冲液10 uL， dNTPs (10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制剂 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水补足至50 uLo然后以合成的cDNA为模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引导下进行PCR扩增，20 uL的PCR反应体系为10 XPCR缓冲液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，双蒸水14 uLo同时以人β-actin基因为内参,其引物序列为Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明， 与诱导前相比，诱导后的人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平明显增高。同时,用real time PCR进一步确定诱导前后人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平。具体方法为采用Roche LightCycler 2.0系统。使用前,将LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 试剂盒内的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并将实验所需毛细管(Roche)放入毛细管冰盒内(Roche)。在每个毛细管内加入如下反应体系水(PCR级)9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I μ L，Master Mix 4 μ L , cDNA 5 μ L。根据扩增显示的Cp (crossing point)值,计算基因表达量的变化。 反应独立重复3次，以消除系统误差。结果从RNA水平上看，诱导后人脐带间充质干细胞内 Nurrl基因的表达水平约为诱导前的13倍。实施例四I.诱导
Cl)分别取P2、P3、P4、P5、P6和P7代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80%_90% 融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取10 mL O. OlM磷酸缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)轻轻加入T75培养瓶内洗涤，弃去洗液；
(2)加入O. 25% 膜蛋白酶-O. 01% 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1.0 mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL 胎牛血清中止胰蛋白酶消化；
(3)加入10mL O. 01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T25培养瓶中接种5 X IO5个各代次人脐带间充质干细胞；
(4)培养体系为含5%胎牛血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM/F12完全培养液，添加了 KT5M RA、I mM CAMP和SHH为500 ng/mL，总体积为5 mL/瓶。置37 C， 5% 二氧化碳培养箱中培养2 4天。2. Nurrl基因的鉴定
采用RT-PCR和real time PCR检测诱导后的人脐带间充质干细胞中Nurrl基因的表达水平。具体方法为用PureLink RNA Mini Kit (invitrogen)试剂并参照试剂盒说明书提取诱导前及诱导后12、24、48和72小时的人脐带间充质干细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板进行反转录，获得cDNA。50 uL反转录体系为5XMLV反转录缓冲液10 uL， dNTPs (10 mM)2. 5 uL, oligodT premier 2.5 uL, RNAse 抑制剂 I uL，RT MLV I uL, mRNA lug, DEPC水补足至50 uLo然后以合成的cDNA为模板,在Forward primer (正向引物) 5，-GGA TGG TCA AAG AAG TGG TTC G -3，和 reverse primer (反向引物)5，- CCT GTG GGC TCT TCG GTT T-3’的引导下进行PCR扩增，20 uL的PCR反应体系为10 XPCR缓冲液 2 uL, dNTPs (2. 5 mM) 2 uL,模板 0.5 uL,正、反向引物各 0.5 uL，rTaq 酶 0.5 uL，双蒸水14 uLo同时以人β-actin基因为内参,其引物序列为Forward primer (正向引物) 5，-CCT GGC ACC CAG CAC AAT -3，和 reverse primer (反向引物):5，_GGG CCG GAC TCG TCA TAC -3’。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明， 与诱导前相比，诱导后的人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平明显增高(如图I所示)。同时,用real time PCR进一步确定诱导前后人脐带间充质干细胞内Nurrl基因的表达水平。具体方法为采用Roche LightCycler 2.0系统。使用前,将LightCycler FastStart Materplus SYBR Greenl 试剂盒内的 Ia 溶液(LightCycler FastStart enzyme) 70 μ L 吸入 Ib (LightCycler FastStart Materplus Reaction Mix SYBR Greenl)溶液中， 制成Master Mix。并将实验所需毛细管(Roche)放入毛细管冰盒内(Roche)。在每个毛细管内加入如下反应体系水(PCR级)9 μ L，正、反向引物(10 ηΜ)各I yL，Master Mix 4 μ L , cDNA 5 μ L。根据扩增显示的Cp (crossing point)值,计算基因表达量的变化。反应独立重复3次，以消除系统误差。结果从RNA水平上看，P2、P3和P7人脐带间充质干细胞诱导后Nurrl基因的表达水平约为诱导前的10倍，相比较而言，P4-6间充质干细胞诱导后的表达水平约为诱导前的23倍(如图2所示)，明显高于前者。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种体外诱导间充质干细胞高表达Nurrl基因的方法，其特征是在添加了维甲酸 (RA)、环化腺核苷一磷酸(CAMP)和Sonic Hedgehog (SHH)的基础培养基中诱导间充质干细胞高表达Nurrl基因。
2.根据权利要求I的方法，所述基础培养基为DMEM/F-12。
3.根据权利要求I的方法，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，所述基础培养基中添加的RA为10_6M 10_4 M、 CAMP 为 O. 5 mM 2 mM 和 SHH 为 200 ng/mL 750 ng/mL。
5.根据权利要求4的方法，所述RA为ΙΟΙ，CAMP为ImM和SHH为500 ng/mL。
6.根据权利要求5的方法，其包含以下步骤(1)取2 8代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80% 90%融合时，吸除T75培养瓶内原有培养液，取5 10 mL O. OlM PBS轻轻加入T75培养瓶内洗涤，弃去洗液；(2)加入O.25%(w/v)胰蛋白酶-O. 01%(w/v) EDTA消化液I. O mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入20mL 0.01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T25培养瓶中接种5X IO5个人脐带间充质干细胞；(4)培养体系为含5%胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM/F-12完全培养液，添加了 1(T5 M RAU mM CAMP和500 ng/mL SHH，总体积为5 mL/瓶，置37 C，5% 二氧化碳培养箱中培养2 4天。
全文摘要
本发明公开了一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法，在添加了RA、CAMP和SHH的DMEM/F-12培养体系中诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因。本发明通过体外诱导方法，而非基因修饰的方法可以使间充质干细胞Nurr1基因的表达明显增高(约为诱导前的23倍)使其更易向多巴胺能神经元分化，且避免了由基因修饰所带来的风险，为临床提供了更为理想的种子细胞。与胚胎干细胞或神经干细胞相比，脐带间充质干细胞取材方便、易于体外扩增、免疫源性低且合乎伦理学要求。
文档编号C12N5/0775GK102586183SQ201210008088
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者刘拥军, 朱德琳, 谢姜, 赵雅宁 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司