重组柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒的制备方法及其应用的制作方法

专利名称：重组柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法，特别涉及利用经过密码子优化的柯萨奇病毒A16型Pl基因和3CD基因，通过酵母表达系统制备重组柯萨奇病毒 A16型病毒样颗粒的方法。
背景技术：
手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由人肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒 (ECHO viruses)和肠道病毒71型(EV 71)感染引起。其中以EV 71及Cox A16型最为常见(Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system. J Infect Dis 1974 ；129 304-309.)。CoxA16感染会导致心肌炎、心肌病和无菌性脑膜炎等并发症，除此之外，CoxA16 还是多种人类疾病的致病原，可引起呼吸道感染、结膜炎、发热性皮疹、疱疹性咽峡炎、急性弛缓性麻搏等(Yang F, Zhang Τ, Hu YF. Survey of Enterovirus Infections from Hand, Footand Mouth Disease Outbreak in China,2009. Virology Journal 2011;8:1-4·)。 2008年1月1日至2011年10月31日止，全国感染手足口病近476万例，造成1821名患儿死亡。在2009年中国爆发的手足口病中发现，存在同时感染EV71和CoxA16两种病毒的病例。
柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CoxA16)属小RNA病毒，其毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳，直径约为23-30nm，无包膜。病毒基因组为约 7kb的单链RNA，其组成从5’端到3’端的方向依次为5’端非编码区，Pl区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。Pl区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白(capsule protein)，其转录及翻译产物经蛋白酶水解后，最终得到4个蛋白产物，分别为VP4(IA)，VP2 (IB)，VP3 (IC) 及VP4(1D)。主要的中和抗原位点就在Pl区得VPl上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原决定簇，但它们存在的区域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣壳的外表面，所以不具有中和性抗原决定簇。P2区呈现P2A、P2B和P2C三个部分。P2A蛋白的这一区域是起抑制宿主细胞mRNA转录作用的。P2B的功能与转膜作用有关，而P2C蛋白据推测其参与病毒RNA基因组的复制。P3区中，VPg(P3A)前体通过加工成为成熟的VPg。P3C 是一个蛋白酶，可以自动催化自我剪切释放。3D是一个RNA合成酶，是在RNA复制过程中的依赖RNA的RNA多聚酶，它可以复制合成病毒的RNA。
研究显示CoxA16灭活病毒免疫小鼠可产生具有保护效力的抗CoxA16和抗 EV71两种中和抗体，可显著提高攻毒试验中实验动物的存活率(Wu TC, Wang YF, Lee YP. Immunity to Avirulent Enterovirus 71 and Coxsackie A16 Virus Protects against Enterovirus 71 Infection in Mice. Journal Of Virology 2007 ；81 10310-10315.)。但目前，还没有针对CoxA16感染的特效药或疫苗上市，因此，研制CoxA16 预防性疫苗对于控制婴幼儿手足口病的流行具有重要意义。而病毒样颗粒在形态上和真实的病毒类似，并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以病毒样颗粒为抗病毒预防性疫苗的开发提供了理想的备选方案。发明内容
本发明的一个目的是提供一种柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法。
本发明所提供的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法包括如下步骤
1)将柯萨奇病毒A16型的Pl基因和3⑶基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；
2)用步骤1)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述Pl基因和 3⑶基因的重组酵母细胞；
3)裂解步骤幻得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒。
上述步骤1)中，所述Pl基因和所述3CD基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型柯萨奇病毒A16型Pl蛋白和野生型柯萨奇病毒A16型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型柯萨奇病毒A16型Pl基因和野生型柯萨奇病毒A16型3CD基因的密码子替换为酵母细胞偏好(高频使用)的密码子。所述优化还包括对Pl基因序列和 3⑶基因序列的其他改造，以适合在酵母细胞中表达。本发明中使用的术语“偏好的密码子” 具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性(CodonPref erence)，是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。
在本发明的一个实施例中，上述步骤1)中所述Pl基因(经过密码子优化的基因， 命名为COXA16P1Y)的核苷酸序列为序列表中序列1所示；所述3CD基因(经过密码子优化的基因，命名为Cox A163CDY)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。
上述步骤幻中，所述目的酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述目的酵母细胞具体为酿酒酵母INVSCl。
所述Pl基因和3⑶基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述Pl基因的启动子方向和驱动所述3CD基因的启动子方向相反。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为将所述Pl基因和所述3CD基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处。具体可将所述Pl基因插入到所述PESC-URA的多克隆位点1(MCS1/FLAG)的 SpeI和I^c I之间；将所述3⑶基因插入到所述pESC-URA的多克隆位点2 (MCS2/myc)的 Sal I和Kpn I之间，得到的重组质粒。
利用本发明所提供的方法制备得到的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因和3CD基因。
本发明所提供的密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因(CoxA16 PlY)的核苷酸序列为序列表中序列1所示；本发明所提供的密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的3CD基因(Cox A16 3CDY)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。
其中，序列1由2589个核苷酸组成，为优化后柯萨奇病毒A16型Pl基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列5所示的蛋白，序列5由862个氨基酸组成；序列2 由1941个核苷酸组成，为优化后的柯萨奇病毒A16型3CD基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列6所示的蛋白，序列6由646个氨基酸组成。
含有上述密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3⑶基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体可为将所述Pl基因和所述3⑶基因分别插入到pESC-URA质粒的两个多克隆位点处，得到的重组质粒。所述重组菌可为携带有上述密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因的重组酵母细胞。所述酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母细胞具体为酿酒酵母INVSCl。
所述表达盒由能够启动所述密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3CD 基因表达的启动子，所述密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因，以及转录终止子组成。在本发明的一个实施例中，所述启动子具体为酿酒酵母GALl和GALlO启动子，当然也可以使用其他公知的酵母启动子的任何一种，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK启动子， 或者其他真核基因启动子。在本发明的一个实施例中，所述转录终止子具体为ADHl和CYCl 终止子。
上述密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因在制备下述a)或b) 中的应用也属于本发明的保护范围
a)柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒；
b)以柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。
本发明还涉及并提供了在重组宿主细胞中同时表达Cox A16 Pl蛋白和3⑶蛋白的方法，该方法包括(1)将含有编码Cox A16 Pl蛋白和3CD蛋白的编码基因的重组表达载体导入重组宿主细胞，如重组的酵母细胞(酿酒酵母INVSC1)。( 在允许所述的Cox A16 Pl蛋白和3CD蛋白同时表达的条件下培养重组宿主细胞，如重组的酵母细胞(酿酒酵母 INVSC1)。
本发明对野生型的柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CoxA16)的Pl基因或3⑶基因进行了酵母细胞偏好型密码子优化，从而提高了 CoxA16 Pl蛋白和CoxA16 3⑶ 蛋白在酵母细胞中的表达水平(见图5)。在本发明中，Cox A16 Pl蛋白和CoxA16 3⑶蛋白在酵母细胞中同时表达，Cox A16 3⑶蛋白对Cox A16P1蛋白进行酶切后得到VP1、VP2、 VP3、VP4四种结构蛋白(3⑶是3C的前体，由3⑶蛋白产生的3C蛋白为一种蛋白酶，可将 Pl蛋白水解为VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白)。这四种结构蛋白进而自行组装成柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒(Cox A16VLPs)。
实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统(酿酒酵母INVSC1)中成功的制备了 Cox A16 VLPs0同时较野生型Pl基因和3⑶基因相比，本发明对Pl基因和3⑶基因的密码子优化大大提高了 Cox A16 VLPs在酵母表达系统中的产量。所述Cox A16 VLPs可以用于制备基于VLP的Cox A16预防性疫苗。


图1为pESC-P 1Y质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker ；泳道B为pESC_URA质粒对照；泳道C为pESC-PlY质粒。
图2为pESC-PIY质粒的SpeI及I^ac I酶切鉴定结果。其中，用泳道A为15000bpDNA Marker ；泳道B为pESC-PlY质粒的SpeI及I^ac I酶切鉴定结果。
图3为PESC-P1Y-3CDY质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bpDNA Marker ；泳道B为pESC-PlY质粒对照；泳道C和泳道D为pESC_PlY_3⑶Y质粒。
图4为pESC-P 1Y-3⑶Y质粒的Ml I及Kpn I酶切鉴定结果。其中，用泳道A为 15000bp DNA Marker ；泳道 B 为 pESC_PlY_3CDY 质粒的 Sal I 及 Kpn I 酶切鉴定结果。
图5 S^festern Blot鉴定重组Cox A16衣壳蛋白的表达。其中，泳道A为蛋白分子量对照；泳道B为INVSCl/pESC-PlY-3CDY蛋白提取物；泳道C为INVSCl酵母蛋白提取物；泳道D为INVSCl/pESC-PlW-3CDW蛋白提取物。
图6为通过透射电镜技术显现的Cox A16病毒样颗粒(VLPs)的代表样品。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的密码子优化及全基因合成
以下按分步骤详细描述Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的密码子优化及全基因合成的流程。
UCox A16 Pl基因和Cox A16 3CD基因的密码子优化
根据野生型Cox A16 Pl基因序列(如序列表中序列3所示)和野生型Cox A16 3CD基因序列(如序列表中序列4所示)，经过设计和反复验证得到适合于在酵母细胞中表达的优化型Cox A16 Pl基因序列和优化型Cox A16 3⑶基因序列，即将Cox A16病毒的Pl 基因序列和3CD基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有如Siarp PM等Gharp PM, Cowe E. Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae. Yeast,1991,7 (7) 657-678.)所描述的酵母优选密码子的优化序列，从而提高Cox A16 Pl蛋白和Cox A16 3⑶ 蛋白在酵母细胞培养环境中的表达水平。
根据上述方法，最终获得按酵母密码子偏好设计的优化型Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因，分别命名为Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y，其基因序列分别为序列表中序列 1和序列2。Cox A16 PlY基因(序列1)编码的蛋白与序列3所示野生型Cox A16 Pl基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列5所示氨基酸序列组成的蛋白；Cox A16 3CDY基因 (序列2)编码的蛋白与序列4所示野生型Cox A16 3CD基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列6所示氨基酸序列组成的蛋白。
2、密码子优化型Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的全基因合成
使用序列重叠延伸PCR法全基因合成Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y，具体方法如下根据优化Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y的基因序列合成多条IOObp的上下游片段，两6片段间3’端互补重叠Mbp，所述上下游片段互为模板、引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段，再以此相邻的回收片段互为引物、模板进行下一轮PCR扩增，得到拼接序列，再以相邻拼接序列互为模板、引物进行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互为模板、引物进行PCR拼接，依此类推最终合成全长的密码子优化型Cox A16 Pl基因和 Cox A163CD 基因，即 Cox A16 PlY 和 Cox A163CD Y。
实施例2、携带Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y的酵母重组表达载体的构建
1、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
从37°C培养16 20h的新鲜平板上挑取DH5 α单菌落(Takara公司，产品目录号为D9057S)，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜(12 16h)。 次日从上述培养物中吸取0.5ml按体积比1 100转入50ml LB培养基中继续培养约池， 至菌液的0D600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中， 冰浴30min。在4°C条件下，4000rpm离心lOmin，弃上清，将管倒置lmin，使残留培养液流尽，以IOml用冰预冷的IOOmM的CaC12溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4°C，4000rpm离心 IOmin,弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重悬细菌沉淀，分装成200 μ 1每管，_80°C保存备用。
2、pESC-URA 质粒的转化
用无菌吸头分别吸取1 μ g pESC-URA质粒(一种具有双向启动子的酵母表达质粒，购自Angilent technologies，产品目录号为217454)加入200 μ 1上述步骤1制备的 DH5a感受态细胞中，轻轻旋转混勻，冰浴30min。将管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1 2min。每管加入800 μ 1不含抗生素的LB培养基(蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素购自北京欣经科公司，NaCl购自国药化学试剂有限公司)， 将管转移至37°C摇床上，温育45min (转速< 150rpm)。取50 μ 1已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的LB平板表面，将平板置于室温至液体被吸收， 倒置平皿，于37°C培养12 16h。
3、pESC-URA质粒的小量制备
挑取经上述步骤2转化培养所得的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1. 5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30_60s， 倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用ΙΟΟμ 1预冷的溶液1(终浓度为50mmol/L的葡萄糖，终浓度为25mmol/L的Tris-HCl，终浓度为lOmmol/L的EDTA，pH8. 0)重悬菌体，剧烈振荡混勻；加入200 μ 1新鲜配制的溶液II (终浓度为0. 2mol/L的NaOH，终浓度为质量百分含量1 %的SDS)，温和混勻，冰浴3min，至液体清亮；加入150 μ 1预冷的溶液III (配制100ml 溶液 III :5mol/L KAc 60ml，冰乙酸 11. 5ml，水 28. 5ml)温和混勻，冰浴 lOmin, 12000rpm 离心lOmin，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用70 %乙醇洗一次，室温晾干后，用30 μ 1含 RNaseAdOOy g/ml)的TE (pH 8. 0)溶解沉淀，37°C水浴30 60min后置_20°C保存备用。
4、酵母重组表达载体pESC-ΡΙΥ的构建
将实施例1得到的Cox A16 PlY基因克隆到pESC-URA质粒的多克隆位点1 (MCS1/ FLAG)的SpeI和I^cI之间，得到酵母重组表达载体pESC-ΡΙΥ。具体按照如下步骤进行
1)将实施例1得到的Cox A16 PlY基因(如序列表中序列1所示)的5’端和3’端分别引入限制性内切酶SpeI和I^c I (限制性内切酶SpeI及I^c I购自大连宝生物工程有限公司)的酶切位点，在Cox A16 3⑶Y基因(如序列表中序列2所示)的5’端和3’ 端分别引入限制性内切酶Ml I和Kpn 1(限制性内切酶Ml I及Kpn I购自大连宝生物工程有限公司)的酶切位点。具体操作如下(1)以实施例1得到的Cox A16 PlY基因(如序列表中序列1所示)为模板，用如下引物进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶SpeI和I^ac I酶切位点的Cox A16P1Y基因片段上游引物为5，-GGACTAGTACCAT GGGTTCTCAAGTTTCTACTCA-3’(下划线处为限制性内切酶SpeI酶切位点的序列)；下游引物为 5，-CCTTAATTAATTACAAAGTAGTAATTTTATAGAA-3‘(下划线处为限制性内切酶 Pac I 酶切位点的序列)。(2)以实施例1得到的Cox A16 3CD Y基因(如序列表中序列1所示)为模板，用如下引物进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶Ml I和Kpn I 酶切位点的Cox A16 3CD Y基因片段上游引物为5’ -ACGCGTCGACACCATGGGT-3’ (下划线处为限制性内切酶Ml I酶切位点的序列)；下游引物为5’ -GGGGTACCTTAAAACAATTCCAACC AATTTCT-3’(下划线处为限制性内切酶Kpn I酶切位点的序列)。
2)使用限制性内切酶SpeI和I^c I酶切上述步骤3制备的pESC_URA质粒，回收骨架载体(大片段，由于小片段大小仅约为^bp,琼脂糖凝胶电泳时经常无法显示)与经同样酶切的Cox A16 PlY基因片段按1 4比例混合，依次加入IOX T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶(T4 DNA连接酶及10XT4 DNA连接酶缓冲液购自大连宝生物工程有限公司)，反应体积为20μ 1，16°C连接过夜，取10μ 1连接反应产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒(图1)。并用内切酶SpeI及I^c I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2所示， 得到大小约为6600bp和^OObp的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有Cox A16 PlY基因的重组质粒命名为pESC-ΡΙΥ。采用相同的方法构建含有野生型Cox A16 Pl基因(Cox A16 P1W，序列幻对照重组质粒，命名为 PESC-Plff0
5、酵母重组表达载体pESC-PlY-3CDY的构建
将实施例1制备的所述Cox A16 3CDY基因克隆到上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-ΡΙΥ的多克隆位点2 (即为pESC-URA质粒的多克隆位点2，MCS2/myc)的Sal I和Kpn I之间，得到酵母重组表达载体pESC-PlY-3⑶Y。具体按照如下步骤进行
使用限制性内切酶Ml I和Kpn I酶切上述步骤4制备的酵母重组表达载体 pESC-ΡΙΥ，回收骨架载体(大片段)与经同样酶切的CoxAie 3⑶Y基因片段按1 4比例混合(DNA Marker和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司)，依次加入 10XT4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为20μ 1，16°C连接过夜，取10μ 1连接反应产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒(图幻。并用内切酶Ml I及Kpn I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图4所示，得到大小约为9200bp和1900bp的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有CoxAie 3⑶Y基因的重组质粒命名为PESC-P1Y-3CDY。酵母重组表达载体PESC-P1Y_3CDY中，启动所述CoxA16 PlY基因转录的启动子为酿酒酵母GALlO启动子，转录终止子为ADHl终止子；启动所述CoxA16 3CDY基因转录的启动子为酿酒酵母GALl启动子，转录终止子为CYCl终止子。采用相同的方法构建同时含有野生型CoxA16 Pl基因(CoxA16 P1W，序列；3)和野生型CoxA16 3CD基因 (CoxA 16 3CDW，序列4)的对照重组质粒，命名为pESC_PlW_3CDW。
实施例3、重组CoxAie病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化
1、酿酒酵母感受态细胞的制备
在酿酒酵母平板中挑取单克隆菌落INVk 1 (Saccharomyces cerevisiae，产品目录号C81000，购自Invitrogen)接种于IOml YPD培养液(购自北京欣经科公司)中，30°C 振摇培养16h，取合适体积的培养物加入48ml YPD培养液中混勻，使其0D600值为0. 5， 30°C振摇培养Ih后0D600值为0. 7，继续培养30min后，将培养物转入50ml无菌的离心管中，室温 1500rpm 离心 5min，弃上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit(购自 Invitrogen)中的溶液I (试剂盒自带)重悬沉淀，室温1500rpm离心5min，小心弃上清，用 Iml溶液II (试剂盒自带)重悬沉淀，50 μ 1/管分装灭菌的1. 5ml离心管中，置_70°C保存。
2、酵母重组表达载体PESC-P1Y-3CDY转化酵母感受态细胞
将4 μ 1实施例2制备的酵母重组表达载体pESC-PlY-3⑶Y加入到上述步骤1制备的酵母INVSCl感受态细胞中，加入500 μ 1 Sc EasyComp transformation kit (购自 Invitrogen)中的溶液III，在涡旋振荡器上剧烈振荡混勻，得到DNA/酵母混合物。将DNA/ 酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在涡旋振荡器上剧烈振荡混勻。取100 μ 1 涂布URA选择平板(选择性培养液(tea-) :YNB6.7g，酵母tea营养缺陷培养基粉末(Sigma 公司，Y1501) 1. 92g，如制平板加入20g琼脂粉，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至 50°C，加入IOOml无菌的20%葡萄糖。)0_，置30°C孵箱中倒置培养2_4天。随机挑取5个单克隆菌落接种于IOml URA选择培养液中，30°C振摇培养16h，离心收集酵母细胞。将经过上述鉴定表明成功转入重组表达载体PESC-P1Y-3CDY的酵母INVSCl细胞命名为INVSCl/ PESC-P1Y-3CDY。同时设置转入pESC_URA空载体的酵母INVSCl细胞的对照，将该酵母细胞命名为INVSCl/pESC-URA。采用相同的方法得到转入重组表达载体PESC-P1W_3CDW的酵母 INVSCl 细胞，将其命名为 INVSCl/pESC-PlW-3CDW。
3、重组Cox A16病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化
1)重组Cox A16病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达将经过上述步骤2获得的 INVSCl/pESC-PlY-3CDY(实验组)、INVSCl/pESC-PlW_3CDW(对照组)和 INVSCl/ pESC-URA (阴性对照组)单菌落分别接种于50ml URA选择培养液(选择性培养液⑴ra_) YNB 6. 7g，酵母tea营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501) 1. 92g，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50°C，加入IOOml无菌的20%葡萄糖。)中，30°C振摇培养16h，取合适体积的培养液接种于500ml URA选择培养液中，使0D600值为0. 4，30°C振摇培养4h，取合适体积的培养液接种3L URA诱导培养液(YNB6. 7g，酵母tea营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501) 1. 92g，溶于800ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50°C，加入100ml无菌的20% 半乳糖和100ml无菌的20%麦芽糖)，使0D600值为0. 4，30°C振摇培养48h，离心收集菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，APV高压均质仪以1500bar循环破碎3次，4°C 8000g离心15min， 收集上清(破碎菌液上清)，置-70°C保存。将1倍体积的50% PEG溶液(50% PEG溶液 50gPEG6000 (Ameresco公司)溶于100ml ddH20)缓慢加入到4倍体积的上述破碎菌液上清中，4°C搅拌过夜。第二日，4°C 8000rpm，30min离心，去除上清，收集沉淀。用无菌PBS重悬沉淀，浓缩至样品原体积的1/10，得到浓缩样品(实验组浓缩样品、对照组浓缩样品和阴性对照组浓缩样品)。
2)重组Cox A16病毒样颗粒的纯化在离心管中由下至上依次小心加入1. 4g/ml、 1. 32g/ml和1. 2g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步骤1)中得到的浓缩样品)置CsCl不连续密度梯度(CsCl购自北京欣经科公司)，4°C用Beckman SW32Ti转头 IOOOOOg离心21h，PBS缓冲液重悬沉淀，4°C 13000g离心15min，收集上清液置_70°C保存， 得到待测样品(实验组待测样品、对照组待测样品和阴性对照组待测样品)。
对纯化后的待测样品通过紫外分光光度计进行蛋白产量测定，结果显示利用本发明所提供的密码子优化后的重组表达载体PESC-P1Y-3⑶Y，在酵母表达系统中，每升发酵液可以制备得到约400-500mg的重组Cox A16病毒样颗粒；而野生型的重组表达载体 PESC-P1W-3CDW在酵母表达系统中，每升发酵液制备的Cox A16病毒样颗粒少于10mg。这一结果说明，密码子优化有效的提高了 Cox A16病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量。
实施例4、重组Cox A16病毒样颗粒的鉴定及电镜观察
对实施例3制备的待测样品(实验组待测样品和对照组待测样品)进行Western Blot鉴定和电镜观察。
Uffestern Blot鉴定重组Cox A16衣壳蛋白的表达利用碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒(增强型)(POOlOS)，按照说明书操作步骤，对实施例3得到的纯化后的待测样品(实验组待测样品、对照组待测样品或阴性对照)进行蛋白定量。根据定量结果，对三种待测样品各取适量的悬液(保证三种样品的上样蛋白总量相等)进行10% SDS-PAGE电泳。用识别Cox A16全蛋白的兔多克隆抗体为一抗(一抗由北京义翘神州生物技术有限公司提供)，荧光标记羊抗兔抗体为二抗(二抗购自KPL，产品目录号为072-07-15-06)进行 Western Blot 分析(蛋白 Marker 购自 Fermentas 公司)。
结果如图5所示，实验组待测样品和对照组待测样品均检测到大小约为 34KD(VPl)、30KD(VP2)和27KD(VP3)的Cox A16三条特异性条带(由于VP4蛋白大小仅为 7KD，所以很难同时检测到)，且实验组(密码子优化后)所检测到的CoxAie三条特异性条带信号明显强于对照组(野生型)；而阴性对照组待测样品未检测到Cox A16的特异性条市ο
2、重组Cox A16病毒样颗粒的电镜观察将实施例3得到的纯化后的三个待测样品(实验组待测样品、对照组待测样品或阴性对照)调整蛋白浓度一致，各取10 μ 1悬液滴加在覆盖镀碳支持膜上静止lmin，吸干镀碳支持膜(购自中镜科仪，编号BZ11022;3)表面残余液体，用2%磷钨酸(购自中镜科仪，编号GZ02536)染色lmin，吸干镀碳支持膜表面残液，室温放置干燥后用透射电子显微镜观察其形态结构。
结果显示，实验组待测样品(图6)和对照组待测样品在电镜下均可见直径约30nm 左右的病毒样颗粒的存在，且相同浓度条件下，同一电镜视野下实验组(密码子优化后)待测样品观测到病毒样颗粒要明显多于对照组(野生型)待测样品；而阴性对照组(空载体) 测样品则没有在电镜下观察到病毒样颗粒的存在。
本实施例的结果表明，携带有密码子优化后的Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的重组表达载体在酵母系统中，成功的包装出Cox A16的病毒样颗粒，同时较野生型CoxA16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因相比，本发明经过密码子优化后提高了 Cox A16病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量。
权利要求
1.柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤1)将柯萨奇病毒A16型的Pl基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2)用步骤1)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述Pl基因和所述 3⑶基因的重组酵母细胞；3)裂解步骤幻得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型柯萨奇病毒A16SP1蛋白和野生型柯萨奇病毒A16型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型柯萨奇病毒A16型Pl基因和野生型柯萨奇病毒A16型3CD基因的密码子替换为酵母细胞偏好的密码子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示；所述3CD基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的酵母细胞为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述Pl基因的启动子方向和驱动所述3CD基因的启动子方向相反。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为将所述Pl 基因和所述3CD基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处各由一个启动子驱动转录得到的重组质粒。
7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒。
8.密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的Pl基因，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示；和/或密码子优化型的柯萨奇病毒A16型的3CD基因，其特征在于所述3CD基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。
9.含有权利要求8所述Pl基因和/或3CD基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.权利要求8所述Pl基因和/或3CD基因在制备下述a)或b)产品中的应用a)柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒；b)以柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。
全文摘要
本发明公开了重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤1)将柯萨奇病毒A16型的P1基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2)用步骤1)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3CD基因的重组酵母细胞；3)裂解步骤2)得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒。利用本发明所提供的方法能在酵母表达系统中制备得到柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒，同时较野生型P1基因和3CD基因相比，本发明对P1基因和3CD基因的密码子优化大大提高了柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量，可将其进一步用于生产婴幼儿手足口病候选预防性疫苗和药物组合物。
文档编号C12N1/19GK102533797SQ201210008528
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者曾毅, 李泽琳, 王晓雯, 盛望, 陈琳 申请人:北京工业大学