一种柯萨奇a16型病毒样颗粒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体而言，本发明涉及A16型柯萨奇病毒前体衣壳蛋 白P1与3CD，其编码基因，及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 手足口病（HFMD)是常见的一种儿童流行病，又名发疹性水疱性口腔炎。多发生于 5岁以下儿童。近年来，HFMD频繁爆发于亚太地区，包括中国、日本、马来西亚、新加坡及香 港、台湾等地区。
[0003] 手足口病是由肠道病毒引起的传染病，柯萨奇A16(CA16)和EV71是手足口的主要 致病源。这两种肠道病毒都属于小核糖核酸病毒家族，都含有一条近7400碱基的正链RNA 基因组。
[0004] 2010年1月至8月，中国报道的病例1465600例，其中797例死亡。一直以来，由 于严重的并发症、高致死率及对中枢神经的损伤使得EV71成为手足口病（HFMD)的研究和 疫苗开发的焦点。2012年报道的2198442例HFMD案例中，CA16致病比例明显提高。感染 CA16-般症状较轻，表现为发烧、口腔溃疡及手、脚、臀部等部位皮疹，严重的能引起脑炎、 心肌炎和肺炎，临床上有CA16致死的报道。研究报告显示，伴有神经系统并发症的HFMD案 例中，21%是感染CA16引起的。这一研究结果表明，CA16病毒在亚太地区，尤其在中国，是 儿童健康的一个重要威胁源。
[0005] 整个肠道病毒基因组编码一个巨型的多聚蛋白，结构蛋白P1和非结构蛋白P2和 P3。P1能被进一步切割成4个亚基蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。P2和P3分别为蛋白酶2A、 3C和3CD，这些非结构蛋白在基因组复制和病毒组装中起到关键作用。在病毒感染过程中， 蛋白酶3⑶将P1切割成VP1，VP3和VP0三个亚基，这些亚基将组装成病毒空颗粒。体外 表达P1和3⑶实验表明，3⑶同样能够将P1切割成VP1，VP3和VP0并组装成病毒样颗粒 (VLPs)。
[0006] 单独表达得到的VLPs与天然病毒衣壳结构类似，但是不含有病毒基因组，可用于 诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。
[0007] 在2003年，YuchenHu等人在昆虫细胞中共转染带有EV71P1与3CD基因的重 组杆状病毒后，得到EV71病毒样颗粒。
[0008] 黄忠等人成功地在昆虫杆状病毒细胞中表达得到CA16病毒样颗粒（VLPs)，结果 证明P3前体蛋白中的3CD蛋白酶复合体发挥特异性蛋白水解酶功能，将共表达的P1前 体蛋白分解为VP1，VP0与VP3蛋白，并最终在电镜观察中获得形态均一的病毒样颗粒。
[0009] 为了满足CA16疫苗的工业化生产，本发明选用毕赤酵母表达系统并利用该系统 首次表达得到CA16病毒样颗粒。毕赤酵母表达系统表达量高、操作简便、成本低廉等特点， 适用于重组蛋白生产规模化。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵 母表达重组蛋白的时候，往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利 于翻译的DNA序列。因此，经过密码子优化后的P1与3CD在毕赤酵母中可以获得较高的表 达水平。
【发明内容】
[0010] 本发明采用的毕赤酵母双表达系统分别由弱启动子pZRVl和强启动子PA0X1操纵 3⑶与P1的表达，P1与3⑶基因整合入毕赤酵母基因组后拷贝数不同，同时调控两组重组 蛋白表达量以达到模拟病毒感染后期P1与3⑶蛋白在宿主中翻译与表达情况，从而更有效 地表达病毒颗粒蛋白。
[0011] 根据本发明的第一方面，提供一种分离的基因，其编码A16型柯萨奇病毒前体衣 壳蛋白P1蛋白，所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子。
[0012] 在优选的实施方式中，所述分离的基因为能够在毕赤酵母中表达的P1基因，所述 基因具有SEQIDN0 :3所示的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供一种分离的基因，其编码A16型柯萨奇病毒前体衣壳蛋白3CD蛋白， 所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子。
[0014] 在优选的实施方式中，所述分离的基因为能够在毕赤酵母中表达的3CD基因，所 述基因具有SEQIDN0 :4所示的核苷酸序列。
[0015] 在优选的实施方式中，所述分离的基因为能够在毕赤酵母中共表达的P1与3CD基 因，所述基因具有SEQIDN0 :3和4所示的核苷酸序列。
[0016] 在本发明的第二方面，提供一种表达载体，所述的表达载体中含有在毕赤酵母中 共表达的P1与3⑶基因的序列。
[0017] 在一优选的实施方式中，所述的表达载体是毕赤酵母表达载体。
[0018] 在本发明的第三方面，提供一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的 表达载体，或其基因组中整合有所述在毕赤酵母中共表达的P1与3CD基因。
[0019] 在一优选的实施方式中，所述表达载体含有本发明的在毕赤酵母中共表达的P1 与3⑶基因。
[0020] 根据本发明的一个具体实施方案，所述含有本发明的P1与3CD基因的表达载体分 别来源于pPICZaB载体和pZRVl载体。
[0021] 在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的 表达载体，或其基因组中整合有所述的基因。
[0022] 在一优选的实施方式中，所述的细胞是毕赤酵母细胞。较佳地，所述的毕赤酵母菌 株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168菌株。最佳的，所述的毕赤酵母菌株是毕赤 酵母X-33。
[0023] 在一优选的实施方式中，所述宿主细胞含有本发明的P1与3CD基因或表达载体的 毕赤酵母菌株，所述菌株能够高水平地共表达生产P1与3CD蛋白。
[0024] 在本发明的第五方面，提供一种具有免疫原性的大分子（即病毒样颗粒），其主要 由A16型柯萨奇病毒前体衣壳蛋白P1和3CD蛋白组成，所述的A16型柯萨奇病毒前体衣壳 蛋白P1和3⑶蛋白是毕赤酵母表达的。
[0025]在一优选的实施方式中，所述的具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得： (1)培养所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内共表达所述的A16型柯萨奇病毒前体衣 壳蛋白P1和3CD蛋白，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
[0026] 在本发明的第六方面，提供一种制备所述的具有免疫原性的大分子的方法，所述 方法包括： (1) 培养所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的A16型柯萨奇病毒前体衣壳 蛋白P1和3CD蛋白，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
[0027] 在本发明的第七方面，提供一种具有免疫原性的组合物，所述的组合物中含有： (i) 有效量的所述的具有免疫原性的大分子；和 (ii) 药学上可接受的载体。
[0028] 在一优选的实施方式，所述的药学上可接受的载体包括至少一种免疫刺激剂或佐 剂。
[0029] 在一优选的实施方式中，所述的佐剂是铝佐剂。
[0030] 在一优选的实施方式中，所述的组合物是疫苗。
[0031] 在本发明的第八方面，提供所述的具有免疫原性的大分子的用途，用于预防或治 疗A16型柯萨奇病毒感染相关疾病。
[0032] 在一优选的实施方式中，所述的A16型柯萨奇病毒感染相关