一种混合佐剂的ev71亚单位疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体涉及到一种混合佐剂的EV71亚单位疫苗及其制备 方法。 技术背景
[0002] 手足口病是以发热和受手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡和疱疹性咽炎为主要特 征的一种常见小儿疾病，少数患者还可引起心肌炎、肺水肿以及脑炎等致命性并发症，多发 生于5岁以下的婴幼儿。引起手足口病的病原体主要是肠道病毒71型以及柯萨奇病毒A16 型。
[0003] 研究表明，EV71主要与重症手足口病相关，它具有嗜神经毒性并且进一步引起无 菌性脑炎、脑膜脑炎和心肌炎等并发症，严重者可能致残或者致死。EV71于1969年首次从加 利福尼亚的中枢神经系统疾病患者粪便标本中分离以来，在世界范围内多次发生过EV71感 染的手足口病流行，近几十年在中国台湾、马来西亚、越南以及中国大陆频繁爆发了高死亡 的EV71感染，严重危害了公共健康安全。
[0004] EV71属于小核糖核酸病毒，其基因组是由7408个核苷酸的单股正链RNA构成，编码 一个2194个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可被进一步水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，Pl 前体蛋白编码￥?1、￥?2、￥?3、￥?4四个结构蛋白，这四个蛋白共同组成了病毒的离子外壳，其 中VPl直接决定了病毒的抗原性，并且具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，因此在 EV71的基因组以及疫苗研制中广受重视。
[0005] 目前针对EV71还没有特效药物，因此疫苗的研制就迫在眉睫。由于对EV71的病原 学、感染机制、致病机制及流行病学等基础性研究做的还不够，EV71病毒株在流行过程中容 易发生变异，而且没有很好的动物模型，这就大大增加了疫苗研发的难度。目前EV71的疫苗 主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、类病毒颗粒疫苗、亚单位疫苗、转基因口服疫苗以及合成肽 疫苗，虽然灭活病毒疫苗已经处于临床m试验阶段，但其在安全性上还有待验证，其它的这 些疫苗都处在研发以及临床尝试阶段，真正上市的产品还没有看到，这就需要我们更大力 度的投入到疫苗研制的队伍中来。
[0006] EV71的亚单位疫苗主要以VPl作为首选靶标，相关研究表明能产生较好的中和性 抗体的抗原主要是昆虫细胞表达纯化得到的VPl蛋白，而大肠杆菌表达的VPl蛋白作为抗原 的普遍中和性抗体效价较低，但是大肠杆菌表达的VPl的蛋白具有表达效率高，生产成本低 以及易于大规模生产的特点，而且从大肠杆菌中得到的蛋白作为疫苗具有较高的安全性， 易于被人们接受，因此从大肠杆菌表达获得的亚单位疫苗研究也变得越来越受青睐。亚单 位疫苗自身的免疫原性较弱，必须选择合适的佐剂以增强疫苗的免疫效果，目前人用的佐 剂主要是铝佐剂，但是铝佐剂主要刺激机体产生Th2免疫反应，无法有效的刺激机体产生 Thl免疫反应，导致不能产生很好的免疫原性反应。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有EV71亚单位疫苗产生的中和保护性抗体效价低的缺 陷，提供一种用混合佐剂的EV71亚单位疫苗制备方法，用EV71的不带标签的VPl蛋白为抗 原，蛋白先和铝佐剂结合，经洗涤后再与MPLA佐剂混合制备成EV71亚单位疫苗。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，包括EV71的VPl蛋白以及铝和MPLA 联用的混合佐剂。
[0010] 其中，EV71的VPl核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，EV71的VPl蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO .2所示。
[0011] 所述的EV71的VPl蛋白优选为在大肠杆菌中重组表达并经过超声、洗涤、变性，表 达的蛋白不带任何多余的序列(如组氨酸标签序列），且是在变性条件下经过不同的分离纯 化方法得到。
[0012] 所述的亚单位疫苗进一步优选为VPl蛋白在尿素变性条件下和铝佐剂结合，经漂 洗液洗涤后与MPLA佐剂混合得到。
[0013] 所用的铝佐剂优选氢氧化铝或者磷酸铝。
[0014] 所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，VPl蛋白和铝以及MPLA佐剂的重 量比优选为 1-50:1-100:1-10;进一步优选20-30:40-60:2-8;特别优选25:50: 5。
[0015]本发明所述的肠道病毒71型亚单位疫苗的制备方法，包含以下步骤：
[0016] (1)将SEQ ID N0.1所示的VPl序列克隆入pET22b表达载体构建成pET22b-VPl重组 表达载体，将质粒导入大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达，得到的菌液经过超声离心获 得VPl包涵体蛋白；
[0017] (2)包涵体蛋白经过含不同浓度的尿素以及表面活性剂的洗涤缓冲液多次洗涤和 离心，最终用含高浓度尿素的溶液溶解包涵体;溶解的包涵体蛋白在尿素存在的条件下经 强阴离子交换纯化能得到纯度较高的蛋白，进一步用凝胶过滤层析纯化后得到纯度超过 95 %抗原VPl蛋白；
[0018] (3)纯化后尿素溶解的变性VPl蛋白与铝佐剂结合，用生理缓冲液多次洗涤漂去变 性剂，得到铝佐剂和抗原蛋白的混合物，将此混合物与MPLA佐剂混合最终制备成EV71亚单 位疫苗。
[0019] VPl蛋白和铝以及MPLA佐剂的重量比优选为1-50:1-100:1-10;进一步优选20-30: 40-60:2-8;特别优选25:50:5。
[0020] 其中，所述的步骤(2)优选包括：
[0021]① VPl包涵体蛋白的洗涤：
[0022]将得到的包涵体用洗涤缓冲液1冰浴条件洗涤2-3次，每次为1~1.5h，离心弃去上 清后，随后在沉淀中加入洗涤缓冲液2冰浴条件洗涤2-3次，每次为1~1.5h，离心弃去上清 后，加入洗涤缓冲液3，冰浴条件洗涤1~1.5h，离心去上清，最后将包涵体用超纯水冰浴洗 涤1~1.5h，离心去上清，再次用超纯水润洗，最后得到的蛋白为洗涤后的VPl包涵体蛋白， 将包涵体蛋白用溶解缓冲液溶解，不溶物略微超声，离心收获上清即为尿素溶解后的包涵 体蛋白；其中，洗涤缓冲液 1 配方为：20mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.15mol/LNaCl，2mol/L尿 素，l%TritonX-100,5mmol/L EDTA;洗涤缓冲液2配方为：20mmol/L Tris-HCl ρΗ8·0， 0 · 15mol/LNaCl，4mol/L尿素 ，I % TritonX-100，5mmol/L EDTA;洗涤缓冲液3配方为： 20mmol/L Tris-HCl ρΗ8·0,0· 15mol/LNaCl，2mol/L尿素，l%TritonX-100,5mmol/L EDTA， 2%脱氧胆酸钠;溶解缓冲液配方为:20mmol/L Tris-HCl pH8.0,8mol/L尿素，70mmol/L β-疏基乙醇；
[0023]②包涵体蛋白的阴离子交换纯化：
[0024]预先装好经过酸碱漂洗的强阴离子交换柱或者弱阴离子交换柱，对包涵体溶解后 的蛋白进行离子交换纯化;先用大量的超纯水冲洗柱子，再用平衡缓冲液，直到基线平衡为 止，将25ml蛋白样品缓慢上样，再次用平衡缓冲液冲洗柱子，直到基线平衡为止，其中没有 收集到蛋白流穿液，蛋白几乎全部结合;将平衡后的样品用洗脱缓冲液1洗脱，纯化后得到 的目的蛋白，蛋白纯度在95 %以上；其中，所述的平衡缓冲液配方为：20mmoI/L Tr i s-HCl pH8.0,8mol/L尿素，70mmol/L β-巯基乙醇，洗脱缓冲液1配方为：20mmol/L Tris-HCl pH8 · 0，8mol/L尿素，70mmol/L β-疏基乙醇，80mmol/LNaCl;
[0025] ③VPl包涵体蛋白的Sepharose CL-4B凝胶过滤层析纯化：
[0026]对离子交换纯化后的样品进行PEG20000透析袋包埋浓缩，浓缩后样品浓度大约 1.2mg/ml，体积大约25ml，对浓缩样品进行Sepharose CL-4B凝胶过滤层析纯化，具体步骤 包括:首先用超纯水冲洗柱子，再用平衡缓冲液，直到基线平衡为止，将离子交换纯化后的 样品缓慢上样，用平衡缓冲液冲洗柱子，收集相应的洗脱峰。
[0027]所述的步骤(3)优选包括:将纯化的VPl蛋白溶液先和氢氧化铝佐剂结合，得到氢 氧化铝佐剂包裹的抗原蛋白，再将包裹蛋白加入MPLA佐剂混合，得到所述的混合佐剂的人 肠道病毒71型亚单位疫苗;其中，VPl蛋白和铝以及MPLA佐剂的优选为1-50:1-100:1-10;进 一步优选20-30:40-60:2-8;特别优选25:50:5。
[0028] 有益效果：
[0029] 本发明选