择了铝佐剂和MPLA(单磷酰脂质A)两种佐剂混合作为免疫佐剂，MPLA能 有效的刺激机体产生Thl免疫反应，同时选择了大肠杆菌表达的不带有任何多余序列的VPl 蛋白作为抗原，免疫小鼠后在体内产生了很好的免疫原性反应，得到的血清具有较高中和 效价，这为EV71亚单位疫苗的研制奠定了基础。
[0030] 本发明提供的VPl序列是经公司全基因合成优化的，具体序列见SEQ ID NO. 1，把 得到的VPl核苷酸序列克隆入pET22b表达载体构建成pET22b-VPl重组表达载体，将质粒导 入大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达，得到的菌液经过超声离心获得包涵体蛋白。包涵 体蛋白经过不同浓度的尿素以及表面活性剂的多次洗涤和离心，最终用高浓度的尿素溶解 包涵体。溶解的包涵体蛋白在尿素存在的条件下经强阴离子交换纯化能得到纯度较高的蛋 白，进一步用凝胶过滤层析纯化后得到的抗原蛋白纯度超过95%。纯化后尿素溶解的变性 蛋白与铝佐剂结合，用生理缓冲液多次洗涤漂去变性剂，得到铝佐剂和抗原蛋白的混合物， 将此混合物与MPLA佐剂混合最终制备成EV71亚单位疫苗。
[0031] 本发明提供的VPl蛋白不带有任何多余的序列，目前国内外还没有不带标签的相 关蛋白疫苗的报道，相比其它带标签的蛋白纯化，具有制备过程简单、价格便宜等优点，且 使用的佐剂为铝佐剂和MPLA佐剂，得到的抗原蛋白相关检测指标都符合人用疫苗标准。 [0032] 本发明包涵体蛋白经过低浓度和中浓度的尿素洗涤，其中还加入了TritonX-IOO 以及脱氧胆酸钠，在洗涤过程中除去了绝大部分宿主菌的杂蛋白，为后续纯化提供了方便。
[0033]本发明纯化的抗原蛋白是在尿素和巯基乙醇存在的条件下，此时蛋白结构完全打 开，构象几乎变的一致，抗原表位也充分暴露，用强阴离子交换纯化时蛋白很多都吸附到柱 子上且能用低浓度的盐离子洗脱下来，这就进一步证明了此时的蛋白聚合度是很低的，甚 至很多可能是单体形式，选用了铝佐剂和MPLA混合佐剂免疫，这就大大增强了抗原蛋白的 免疫原性以及免疫反应性，得到的抗体效价和中和抗体效价都比较高。
[0034]本发明提供的人肠道病毒71型的亚单位疫苗，相比目前临床试验的EV71灭活疫 苗，该疫苗在生产过程中具有成本低，操作简单，安全性高，易于大规模生产等特点，且该疫 苗在体内能产生较好的免疫原性，得到的中和抗体效价较高，因此是具有潜在临床应用价 值的备选疫苗。
【附图说明】
[0035] 图1是pET22b_VPl重组载体酶切验证
[0036] 1 ·DNA标准分子量；2 ·pET22b-VPl酶切前；3 · pET22b-VPl NdeI单酶切；4 · pET22b-VPl NdeI和Sal I双酶切.
[0037]图2是VPl蛋白诱导表达
[0038] 1.蛋白标准分子量;2.诱导前;3.诱导后;4.破碎上清;5.破碎沉淀.
[0039]图3是VPl蛋白离子交换纯化和凝胶过滤层析纯化
[0040] 1.蛋白标准分子量；2 .包涵体尿素溶解后；3 .离子交换纯化;4.凝胶过滤层析纯 化·
[00411图4是ELISA检测IgG抗体滴度
[0042] 图5是微量中和法检测中和抗体滴度
【具体实施方式】
[0043] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步的描述。
[0044] 实施例1.
[0045] I .VPl基因的合成以及重组载体pET22b-VPl的构建
[0046] 来源于C4亚型的EV71病毒株从上海巴斯德研究所获得，用病毒RNA提取试剂盒(天 根生化科技有限公司）提取获得病毒RNA，用反转录试剂盒逆转录得到病毒的cDNA，设计引 物分段扩增病毒的全序列，将分段序列酶切连接成完整的序列，送上海英骏生物技术有限 公司测序，最终测得VPl的序列见SEQ ID NO. 1，氨基酸序列见SEQ ID NO. 2,且这个全长 cDNA序列还通过体外转录重新包装出了新的有感染能力的病毒，因此证实cDNA序列都是完 整的而且功能也没有丧失。
[0047]以上述测序得到的VPl序列为标准，在中美泰和生物技术有限公司合成VPl的全基 因序列，由于pET22b NdeI端存在起始密码子以开始蛋白的合成，因此VPl设计的时候在5' 端添加了Nde頂每切位点，在3 '端添加 SaH酶切位点，并且在3 '端添加了终止密码子，使表达 的VPl蛋白不带任何多余的序列，以pET22b为骨架质粒，将pET22b和VPl分别用NdeI和Sal I 双酶切，体系如下：
[0049] 将混合物轻轻混匀，离心收集于管底，37°C水浴3h后转入80°C水浴20min。取5μ1双 酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，其余酶切产物用于琼脂糖凝胶电泳回收，用多功能酶 标仪测定纯化回收产物的浓度。纯化回收后的产物片段用Τ4连接酶（TaKaRa) 16°C连接过 夜，连接体系如下：
[00511 于16°C连接过夜，连接产物转化100μΙ E.coli DH5a，培养过夜，等到克隆容易挑 取时，菌落PCR验证是否是阳性克隆，验证的阳性克隆提取质粒，用Nde I，Sal I单双酶切验 证是否连接成功（图1)，结果表明重组载体pET22b-VPl构建成功。
[0052] 2.重组载体pET22b-VPl转化表达菌株诱导表达
[0053] 将上述构建成功的重组载体转化E.coli BL21 trxB(DE3)感受态细胞，同时对菌 落进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定，对阳性克隆诱导表达。挑取单菌落于37°C过夜培养后以1: 50( v/v)转入100mL含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中继续培养，至OD6qq约0.6，取Iml菌 液至1.51111离心管中，1200〇1'/111；[11离心5111；[11，弃上清，剩余的菌液中加入1?16至终浓度为 0.5mmol/L，37°C诱导表达5h，取0.3ml诱导后的菌液做相同处理。将诱导表达后菌液于 10000rpm，4°C离心10min，收集菌体，用IOml 100mmol/L pH 7.0的PBS缓冲液重悬菌体，超 声破碎后取100μ1破碎液离心，作为破碎上清和破碎沉淀，同时取诱导前和诱导后的菌体， 加入上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳分析（图2)，结果表明表达的蛋白全部为包涵体蛋白， 且目的蛋白表达量大约为I00mg/L。
[0054] 3. VPl包涵体蛋白的洗涤
[0055]对500ml诱导表达的菌液超声破碎，离心收获包涵体蛋白，将得到的包涵体用 2mol/L低浓度尿素洗涤，洗涤缓冲液 1 为25ml(20mmol/L Tris-HCl pH8·0，0 · 15mol/LNaCl， 2mo I/L尿素 ，I % Tri tonX-100，5mmoI/L EDTA)，冰浴条件洗涤了两次，每次为1.5h，离心弃 去上清后，随后在沉淀中加入25ml(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，4mol/L尿 素 ，I % Tri tonX-100，5mmol/L EDTA)洗涤缓冲液2，冰浴条件洗涤了两次，每次为1.5h，离心 弃去上清后，加入25ml洗涤缓冲液3(20mmol/L Tris-HCl pH8 · 0，0 · 15mol/LNaCl，2mol/L尿 素 ，I %TritonX-100，5mmol/L EDTA，2%脱氧胆酸钠），冰浴条件洗涤1.5h，离心去上清，最 后将包涵体用超纯水冰浴洗涤1.5h，离心去上清，再次用超纯水润洗，最后得到的蛋白为洗 涤后的包涵体蛋白，将包涵体蛋白用25ml溶解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,8mol/L 尿素，70mmol/L β-巯基乙醇)溶解，不溶物略微超声，离心收获上清即为尿素溶解后的包涵 体蛋白。
[0056] 4. VPl包涵体蛋白的阴离子交换纯化
[0057]预先装好经过酸碱漂洗的强阴离子交换填料或弱阴离子交换填料，对包涵体溶解 后的蛋白进行阴离子交换纯化，其中上述蛋白体积25ml，浓度大约3mg/ml，离子交换纯化填 料用量大约在50ml左右。先用大量的超纯水冲洗柱子，再用平衡缓冲液(2〇111111 〇1/11^8-HCl pH8 ·0，8mol/L尿素，70mmol/L β-巯基乙醇），直到基线平衡为止，将25ml蛋白样品缓慢 上样，再次用平衡缓冲液冲洗柱子，直到基线平衡为止，其中没有收集到蛋白流穿液，蛋白 几乎全部结合。将平衡后的样品用洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-HCl pH8.0,8mol/L尿素， 70mmol/L β-巯基乙醇，80mmol/LNaCl)洗脱，纯化后得到的目的蛋白见（图3)，蛋白纯度在 95%以上