25°C孵育25min，加 lmol/L HC150yl/孔终止反应打开酶标仪，调整到OD45q读数，并且记录相关的数据，阴性值 几乎小于0.06,以数值大于0.2的为阳性值，抗体效价检测如（图4)，由图4可见，氢氧化铝+ VPl免疫组、氢氧化铝+MPLA+VP1免疫组、MPLA+VP1免疫组的ELISA抗体效价比较接近，大约 在1:70000多;氢氧化铝+灭活病毒免疫组ELSIA效价相对较低，大约在1:512多；正常小鼠对 照组和只加氢氧化铝佐剂对照组效价只有1:16。
[0087] 3.不同免疫佐剂和VPl抗原组血清的中和抗体滴度检测
[0088] 上述9种的血清样品经ELSIA检测后，取抗体效价较高的血清用来做中和保护试 验，中和保护实验步骤如下：
[0089] 1)稀释病毒:用DMEM细胞培养液将病毒在无菌容器内稀释至100TCID5〇/50yl。 [0090] 2)血清稀释:将上述6个血清分别标注六、8、(：、0』、？，在无菌管中加入0.351111的含 10 %双抗的细胞培养液，再加入0.05ml的血清样品，混匀，56°C、30min灭活，即为1:8的稀释 血清，再用含1 %双抗的细胞培养液配制成1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512和1:1024 稀释血清梯度。
[0091] 3)在96孔板中，每孔加入50μ1稀释血清。
[0092] 4)在每孔中加入50μ1浓度为100TCID5Q/50yl的稀释病毒液。
[0093] 5)混匀，放入37°CC02孵箱中孵育2h。
[0094] 6)加入处于对数生长期的Vero细胞悬液100μΙ每孔(为复苏后传代4-5代细胞），细 胞悬液浓度为2 X IO5个/ml，放入37°CC02孵箱中孵育培养。
[0095] 7)使用倒置显微镜每天观察CPE并记录，当病毒对照孔出现完全病变时，判定最终 结果(约5-7d)，试验结果如（图5)。由图5可见，氢氧化铝+灭活病毒免疫组的中和抗体效价 是最高的，大约在1:256;氢氧化铝+1031^+￥?1免疫组次之，大约为1:128;1^1^+￥?1免疫组中 和抗体效价大约为1:64;其它免疫组中和抗体抗体效价在1:8以内，因此，相对VPl亚单位疫 苗，氢氧化铝和MPLA混合佐剂免疫组为最优方案。
【主权项】
1. 一种混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于包括EV71的VP1蛋白以及 铝和MPLA联用的混合佐剂。2. 如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于EV71的VP1 蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDN0.1所示，EV71的VP1蛋白氨基酸序列如SEQIDN0.2所 不。3. 如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于所述的 EV71的VP1蛋白为大肠杆菌中重组表达并经过超声、洗涤、变性得到。4. 如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于表达的VP1 蛋白不带任何多余的序列，且在变性条件下经过相应的离子交换纯化和分子筛纯化得到。5. 如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于所述的亚 单位疫苗为VP1蛋白在尿素变性条件下和铝佐剂结合，经漂洗液洗涤后与MPLA佐剂混合得 到。6. 如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于所用的铝 佐剂为氢氧化铝或者磷酸铝。7. 如权利要求1~6中任一项所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在 于VP1蛋白和铝以及MPLA佐剂的重量比为1-50:1-100:1-10;优选25:50:5。8. 如权利要求1所述的肠道病毒71型亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包含以下步 骤： (1) 将SEQ ID N0.1所示的VP1序列克隆入pET22b表达载体构建成pET22b-VPl重组表达 载体，将质粒导入大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达，得到的菌液经过超声离心获得 VP1包涵体蛋白； (2) 包涵体蛋白经过含不同浓度的尿素以及表面活性剂的洗涤缓冲液多次洗涤和离 心，最终用含高浓度尿素的溶液溶解包涵体;溶解的包涵体蛋白在尿素存在的条件下经强 阴离子交换纯化能得到纯度较高的VP1蛋白，进一步用凝胶过滤层析纯化后得到纯度超过 95 %的抗原VP1蛋白； (3) 纯化后尿素溶解的变性VP1蛋白与铝佐剂结合，用生理缓冲液多次洗涤漂去变性 剂，得到铝佐剂和抗原蛋白的混合物，将此混合物与MPLA佐剂混合最终制备成EV71亚单位 疫苗。9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)包括： ① VP1包涵体蛋白的洗涤： 将得到的包涵体用洗涤缓冲液1冰浴条件洗涤2- 3次，每次为1~1.5h，离心弃去上清 后，随后在沉淀中加入洗涤缓冲液2冰浴条件洗涤2-3次，每次为1~1.5h，离心弃去上清后， 加入洗涤缓冲液3，冰浴条件洗涤1~1.5h，离心去上清，最后将包涵体用超纯水冰浴洗涤1 ~1.5h，离心去上清，再次用超纯水润洗，最后得到的蛋白为洗涤后的VP1包涵体蛋白，将包 涵体蛋白用溶解缓冲液溶解，不溶物略微超声，离心收获上清即为尿素溶解后的包涵体蛋 白；其中，洗涤缓冲液1 配方为：20mmol/L Tris-HCl pH8 ·0，0 · 15mol/LNaCl，2mol/L尿素， l%TritonX-100,5mmol/L EDTA;洗涤缓冲液 2 配方为：20mmol/L Tris-HCl ρΗ8·0， 0 · 15mol/LNaCl，4mol/L尿素，1 % TritonX-100，5mmol/L EDTA;洗涤缓冲液3配方为： 20mmol/LTris-HClpH8·0,0·15mol/LNaCl，2mol/L尿素，l%TritonX-100,5mmol/LEDTA， 2%脱氧胆酸钠;溶解缓冲液配方为：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，8mol/L尿素，70mmol/U3-疏基乙醇； ② 包涵体蛋白的阴离子交换纯化： 预先装好经过酸碱漂洗的强阴离子交换柱或者弱阴离子交换柱，对包涵体溶解后的蛋 白进行强阴离子交换纯化，；先用大量的超纯水冲洗柱子，再用平衡缓冲液，直到基线平衡 为止，将25ml蛋白样品缓慢上样，再次用平衡缓冲液冲洗柱子，直到基线平衡为止，其中没 有收集到蛋白流穿液，蛋白几乎全部结合;将平衡后的样品用洗脱缓冲液1洗脱，纯化后得 到的目的蛋白，蛋白纯度在95 %以上;其中，所述的平衡缓冲液配方为:20mmol/L Tris-HCl pH8 · 0，8mol/L尿素，70mmol/U3-巯基乙醇，洗脱缓冲液1配方为：20mmol/L Tris-HCl pH8 · 0，8mol/L尿素，70mmol/U3-疏基乙醇，80mmol/LNaCl; ③ VP1包涵体蛋白的Sepharose CL-4B凝胶过滤层析纯化： 对离子交换纯化后的样品进行PEG20000透析袋包埋浓缩，浓缩后样品浓度大约1.2mg/ ml，体积大约25ml，对浓缩样品进行Sepharose CL-4B凝胶过滤层析纯化，具体步骤包括:首 先用超纯水冲洗柱子，再用平衡缓冲液，直到基线平衡为止，将离子交换纯化后的样品缓慢 上样，用平衡缓冲液冲洗柱子，收集相应的洗脱峰。10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)包括:将纯化的VP1蛋 白溶液先和氢氧化铝佐剂结合，得到氢氧化铝佐剂包裹的抗原蛋白，再将包裹蛋白加入 MPLA佐剂混合，得到所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗。
【专利摘要】本发明公开了一种混合佐剂的EV71亚单位疫苗及其制备方法。该疫苗用C4亚型的EV71病毒VP1蛋白为抗原，以氢氧化铝和单磷酰脂质A为混合佐剂。我们以大肠杆菌表达纯化后的不带任何标签的VP1蛋白作为抗原，得到的蛋白在变性条件下和铝佐剂结合，经过洗涤测定再和MPLA佐剂混合免疫小鼠，得到的多抗血清能特异的中和EV71病毒产生中和性保护抗体，其中和抗体效价接近1:128。本发明提供的人肠道病毒71型的亚单位疫苗，相比目前临床试验的EV71灭活疫苗，该疫苗在生产过程中具有成本低，操作简单，安全性高，易于大规模生产等特点，且该疫苗在体内能产生较好的免疫原性，得到的中和抗体效价较高，是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。
【IPC分类】C07K1/16, C07K14/085, A61P31/14, A61K39/125, C12N15/70, C07K1/18, A61K39/39
【公开号】CN105535963
【申请号】CN201511023413
【发明人】吴洪流, 胡广, 张明, 陈国 , 郭蕾
【申请人】北京凯悦宁医药科技有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月31日