专利名称：一种猪瘟亚单位疫苗复合免疫佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于猪瘟亚单位抗原肌注免疫的复合佐剂，属于生物技术领域， 专用于提高猪瘟亚单位疫苗的免疫效果。
背景技术：
猪瘟(Classical Swine i^ever)是由猪瘟病毒引起猪的一种急性热性传染病，该病传染性强，病死率高，给我国养猪业造成重大经济损失。世界动物卫生组织将它列入A类 16种动物传染病之一。猪瘟病毒只有一个血清型。猪群对猪瘟的免疫力与中和抗体一致，以体液免疫为主。免疫母猪可通过初乳将抗体传给仔猪，并使其获得一定的被动免疫力，可以持续1-2个月。母源抗体对猪瘟弱毒疫苗的免疫有一定的干扰作用。我国从1956年起就广泛应用兔化弱毒疫苗进行猪群的预防接种，取得了显著的效果。但是免疫猪群仍时有猪瘟发生，猪群先天性感染或发生免疫抑制导致免疫失败是重要原因之一。目前尚没有方法区分商品猪群的弱毒疫苗接种和野毒感染，因此一些发达国家禁止使用弱毒疫苗进行猪瘟的预防。近年来，欧洲一些国家研制的猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗显示出良好的应用前景。尽管基因工程亚单位疫苗由于安全性好、受母源抗体干扰小、能够配套试剂盒区分疫苗免疫和野毒感染等优点具有广阔的应用前景，但是基因工程亚单位抗原免疫原性相对较弱、抗体应答慢，为了更好的激发猪体的免疫系统，使其对猪瘟病毒有足够的抵抗力， 有必要寻求安全高效的方法提高基因工程亚单位疫苗的免疫活性。目前提高亚单位疫苗免疫活性的方法不仅限于疫苗抗原的改进，选择合适的免疫佐剂来刺激免疫系统，增强动物免疫系统对抗原物质的摄取、加工和递呈等免疫应答也是一个重要的途径。一个理想的免疫佐剂应该特异性辅助疫苗抗原激活免疫系统，同时不会对动机体产生副作用。α干扰素是动物机体遭受病原感染时产生的一种具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子。近年来的研究发现，IFN-α在动物的先天性免疫向获得性免疫的发展中起着十分重要的作用。一方面抑制病原的增殖与传播，另一方面刺激抗原递呈细胞的分化和成熟、 激活淋巴免疫细胞，如提高NK细胞的杀伤活性、巨噬细胞的吞噬活性等，从而建立高效的病原或抗原特异性获得性免疫应答。国外近期研究发现与单独免疫流感疫苗相比，一定剂量的α干扰素配合流感疫苗免疫小鼠可显著提高血清中特异性IgG2 α和IgA的水平，并对10倍致死剂量流感病毒的攻击产生完全的免疫保护，而单独流感疫苗免疫小鼠的保护率近有60%。但是α干扰素在动物机体中的半衰期较短，难以发挥较为持续的免疫刺激作用，免疫佐剂效果有时不够稳定。氢氧化铝佐剂是以4. 5nmX2. 2nmX IOnm存在的纤维状粒子，这种粒子聚集后以松散的1-10 μ m大小的形式存在。抗原与氢氧化铝佐剂的吸附作用主要是依靠静电引力、 疏水作用和配体交换。因此，氢氧化铝佐剂与干扰素和抗原蛋白等配合后不会引起活性蛋白的变性和失活，从而发挥协同增强的免疫调节功能。
发明内容
针对以上所述，本发明提供了一种猪瘟亚单位疫苗的复合免疫佐剂，用于与猪瘟亚单位抗原配合，通过肌注免疫提高猪瘟亚单位疫苗的免疫原性，增强猪体免疫系统对猪瘟抗原的免疫应答，更安全、高效的预防猪瘟的发生。为达到以上目的，本发明采用了以下技术方案一种猪瘟亚单位疫苗的复合免疫佐剂，该复合免疫佐剂由重组猪α干扰素和氢氧化铝佐剂配合而成，每头份猪瘟亚单位疫苗中重组猪α干扰素的含量为IX 10 ;所述的重组猪α干扰素是通过重组DNA技术将猪 α干扰素基因在各种表达系统中高效表达产生的具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；复合免疫佐剂综合了氢氧化铝佐剂颗粒化缓释作用和猪α干扰素的免疫调节作用。采用以上技术方案后，本发明具有以下有益效果复合免疫佐剂可显著增强仔猪对猪瘟Ε2蛋白抗原的免疫应答；复合免疫佐剂显著提高猪瘟Ε2蛋白抗原颈部肌注免疫仔猪后产生的猪瘟特异性中和抗体水平；复合免疫佐剂可显著增强猪瘟Ε2蛋白抗原免疫猪体后产生的免疫记忆。
图1为本发明复合免疫佐剂对猪瘟亚单位疫苗单次免疫诱导抗体消长的影响。图2为本发明复合免疫佐剂对猪瘟亚单位疫苗初免和二免后产生中和抗体水平的影响。图3为本发明复合免疫佐剂对猪瘟亚单位疫苗接种猪免疫记忆的影响。
具体实施例方式本发明一种猪瘟亚单位疫苗复合免疫佐剂，该复合免疫佐剂由重组猪α干扰素和氢氧化铝佐剂配合而成，每头份猪瘟亚单位疫苗中重组猪α干扰素的含量为IX 10 。所述的重组猪α干扰素是通过重组DNA技术将猪α干扰素基因在表达系统中所表达产生的具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白。1、重组猪α干扰素的制备参照文献[周国栋.猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其免疫佐剂功能.南京农业大学硕士论文，2006]的方法发酵获得重组猪α干扰素，通过50kDa滤膜除去大分子杂质，再经5kDa滤膜超滤除盐浓缩后用无菌生理盐水稀释为107U/mL。2、氢氧化铝佐剂的制备取5%硫酸铝溶液250ml，在强烈搅拌下加入5%氢氧化钠溶液100ml，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使达250ml。免疫接种时，取适量氢氧化铝佐剂加等体积抗原即可免疫。3、重组猪瘟亚单位抗原的制备参照文献[(1)徐学清，曹瑞兵，蔡梅红，任雪枫，周斌，陈溥言.猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原域在毕赤酵母中的表达.西北农林科技大学学报(自然科学版).2005，33 (3) 11-15.和(2)徐学清，郑其升，曹瑞兵，苏小运，陈溥言.猪瘟病毒E2蛋白B/C抗原区基因在毕赤酵母中的表达与鉴定.中国生物工程杂志.2004，M (9) :53-57.]的方法发酵获得猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原和B/C抗原蛋白，分别通过50kDa滤膜除去大分子杂质，再经5kDa 滤膜超滤除盐浓缩，用无菌生理盐水稀释配置猪瘟亚单位抗原，猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原和B/C抗原蛋白含量均为0. 5mg/mL。4、复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗的制备将上述氢氧化铝佐剂、重组猪α干扰素和重组猪瘟Ε2蛋白抗原生理盐水按 5:1: 4的比例混合、配勻。ImL佐剂疫苗中含有猪瘟病毒Ε2蛋白A/D抗原和B/C抗原蛋白各200 μ g和重组猪α干扰素106U。根据附图所示，本发明将11头(一窝)30日龄仔猪随机分成4组，猪瘟细胞苗组 (A)、无佐剂猪瘟亚单位疫苗组(B)、复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗组(C)各3头，生理盐水对照组(D)2头。无佐剂猪瘟亚单位疫苗的抗原蛋白含量与复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗相等，系用生理盐水配制。与在35日龄分别在耳后颈部肌注疫苗或生理盐水2mL;3周后各组加强免疫一次，免疫疫苗与剂量与初免相同；初免后7周各组均用商品化猪瘟细胞苗三免。各组仔猪分别在初免后0、3、5、7和9周采血样化验。本发明复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗免疫效果测定细胞微量病毒中和试验检测猪瘟中和抗体，采用固定病毒量，稀释血清的方法。血清样品经56°C灭活30分钟后过滤除菌，用PBS倍比稀释。在96孔细胞板上将50 μ L各稀释度的血清样品与50 μ L 200 TCID50 的猪瘟病毒混合，在37°C作用lh，每个血清稀释度重复2孔。加入IOOyL IXlO4个H(15 细胞37°C继续培养72h。应用猪瘟单克隆抗体进行间接免疫荧光法检测细胞中的猪瘟病毒。能够完全中和病毒的血清样品最大稀释度即为中和抗体效价。试验结果(表1)显示试验猪为规模化猪场的商品仔猪，在35日龄时部分仔猪体内存在低水平的猪瘟中和抗体。初免后3周无免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗免疫组的3头猪均没有产生中和抗体；复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗免疫组的3头仔猪均有猪瘟中和抗体的升高，但与商品化猪瘟细胞苗免疫组类似，中和抗体的水平还较低；二免疫后三组接种疫苗的仔猪均出现猪瘟中和抗体水平的提高，复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗免疫组仔猪的猪瘟中和抗体水平显著高于无佐剂疫苗组，但略低于商品化猪瘟细胞苗免疫组。在一免后9 周，各疫苗接种组仔猪在猪瘟疫苗活毒的刺激下，中和抗体水平显著提高，复合免疫佐剂猪瘟亚单位疫苗免疫组产生了类似商品化猪瘟细胞苗的免疫记忆，猪瘟中和抗体提升幅度显著高于无佐剂疫苗组。结果表明，复合免疫佐剂可促进猪体对猪瘟亚单位抗原的免疫应答， 产生更高效的抗原免疫记忆。兔体发热保护试验模型评价猪瘟亚单位疫苗的免疫保护效果猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)又称C株，是石门株猪瘟病毒在兔体长期传代的致弱株。HCLV对兔体没有致病性，但在首次静脉接种48_%h后可引起兔的特征性发热，二次接种不会再引起典型热；如果接种HCLV被试验猪血清中的猪瘟抗体中和，则接种兔体不会引起发热，再次攻毒后发生典型热。中国兽药监察所常用兔体发热保护试验作为判定试验猪瘟疫苗有效性的动物模型。取二免后2周的猪血清进行兔体攻毒保护试验，取用生理盐水1 16稀释的血清样品500 μ L与等体积的含100倍兔体反应热的HCLV在室温(15_25°C )作用lh，静脉接种 2月龄清洁级大白兔，每他测一次直肠温度，高于40°C判定为发热。在兔体温度恢复正常后用100倍兔体反应热的HCLV第二次攻毒，记录体温检测数据。
表1猪血清样品中猪瘟中和抗体滴度检测结果
权利要求
1.一种猪瘟亚单位疫苗复合免疫佐剂，其特征在于该复合免疫佐剂由重组猪α干扰素和氢氧化铝佐剂配合而成，每头份猪瘟亚单位疫苗中重组猪α干扰素的含量为1 XlOfiUtj
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟亚单位疫苗复合免疫佐剂，其特征在于所述的重组猪α干扰素是通过重组DNA技术将猪α干扰素基因在表达系统中所表达产生的具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种猪瘟亚单位疫苗复合免疫佐剂，该复合免疫佐剂由重组猪α干扰素和氢氧化铝佐剂配合而成，每头份猪瘟亚单位疫苗中重组猪α干扰素的含量为1×106U；所述的重组猪α干扰素是通过重组DNA技术将猪α干扰素基因在各种表达系统中高效表达产生的具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；复合免疫佐剂综合了氢氧化铝佐剂颗粒化缓释作用和猪α干扰素的免疫调节作用。
文档编号A61K39/39GK102188702SQ20111002349
公开日2011年9月21日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者吴双, 左伟勇, 曹瑞兵, 朱善元, 杨海峰, 洪伟鸣, 王健, 王安平, 王永娟, 黄文强 申请人:左伟勇, 曹瑞兵, 朱善元