一种猪瘟疫苗感染性cDNA及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及利用反向遗传操作获得一种猪瘟弱毒疫 苗C株感染性cDNA克隆，同时涉及该感染性cDNA克隆在构建高效价重组猪瘟活疫苗和猪 瘟疫苗载体中的应用。
【背景技术】
[0002] 猪瘟是猪的一种传染性极强的病毒性疾病，早期称为猪霍乱（HogCholera，HC)， 可感染各种年龄猪，一年四季流行，发病率和死亡率均很高，危害巨大。猪瘟的病原体是猪 癌病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV)，在国际兽疫局（0IE)制定的《国际动物卫 生法典》中，猪瘟被列入A类16种法定报告的传染病之一。我国近年来猪瘟频发，给养猪业 造成严重经济损失，妨碍了养猪业的发展和出口贸易。加强对猪瘟的有效防控，是促进养猪 业健康发展、提高养殖效益和让国民吃上放心肉的必然要求；发展高效的猪瘟控制技术和 疫苗制品，提升猪瘟防控水平是科技工作的重大课题。
[0003]CSFV基因组为长约12. 3kb的单股正链RNA，由5'末端非编码区（5'Untranstaled 1'叩1〇11，5'^'1〇、一个大的开放阅读框架（01^)和3'末端非编码区（3'^'1〇构成。01^编码 一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中或翻译后，被病毒自身 编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟蛋白质，包括4种结构蛋白C、Ems、El、 ￡2和8种非结构蛋白『。、？7、呢2、呢3、呢44、548、呢5八和呢58。其中41:'￡1和￡2嵌入 脂质双层膜中，在病毒粒子表面形成突触，介导病毒的吸附与入侵，是CSFV毒力相关因子 和保护性抗原蛋白。E2常以同源二聚体或E1E2异源二聚体存在于病毒粒子和宿主细胞的 表面；CSFV感染猪体能诱导机体产生Ems和E2抗体，对猪体再次感染猪瘟有保护作用。
[0004] 猪瘟疫苗接种是预防和控制猪瘟的最有效方法。早在1951年，我国研究人员筛选 出免疫原性优良的CSFV石门毒株（殷震，1997)，该毒株作为中国CSFV标准强毒株沿用至 今。当时使用CSFV石门毒株，灭活制成猪瘟结晶紫甘油灭活疫苗，使用后迅速控制了我国 的猪瘟疫情。1954-1956年间，中国兽药监察所等单位的研究人员将CSFV强毒株（其中包括 标准强毒石门株）适应家兔，在兔体内连续传代，选育出一株对猪基本无毒力，并保持CSFV 免疫原性的兔化毒株，即中国猪癌兔化弱毒疫苗株（hogcholeralapinizedvaccine, HCLV)，简称猪瘟疫苗C株。猪瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和应用，对我国猪瘟的预防和控 制起了决定性作用。然而，猪瘟兔化弱毒疫苗60年来的广泛使用，并未控制猪瘟的发生。尽 管疫苗的接种剂量和免疫次数增加，不仅没有根除猪瘟，近年来，我国猪瘟的发生出现了许 多新特点，表现为从频发的大流行转变为无规律的散发流行；临床症状从典型变为非典型 猪瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亚急性转变为以慢性为主，出现持续感染、胎盘感染、母 猪繁殖障碍以及新生仔猪的先天性感染等。猪瘟疫苗株在细胞中增殖滴度不高、制备高效 价疫苗困难是导致疫苗保护效力低下和猪瘟防控困难的重要原因之一。猪瘟的发生、传播 和流行是严重制约我国养猪业健康发展、增加农民收入和发展国际贸易的瓶颈。
[0005] 为满足我国预防、控制和最终根除猪瘟的需要，研制新一代高效价猪瘟疫苗制品， 提高猪瘟疫苗免疫保护效力，势在必行。此外，提高猪瘟疫苗细胞生长滴度也是降低疫苗生 产企业生产成本、提高疫苗质量和效益的根本保证。
[0006] 另一方面，CSFV感染引起猪体的免疫抑制，感染CSFV的猪体更容易发生圆环病 毒、猪繁殖和呼吸综合症病毒、乙型脑炎病毒等的混合感染，导致猪死亡率更高，危害更加 巨大。基于猪瘟活疫苗载体表达其他病原保护性抗原蛋白构建双价疫苗，能同时防控猪瘟 及相关猪病，具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的是提供一种猪瘟疫苗的全长感染性cDNA，该全长感染性cDNA 包含了猪瘟疫苗种毒全长cDNA、在该cDNA5'末端融合猪RNA聚合酶I启动子，在cDNA 3'插入鼠RNA聚合酶I终止子；
[0008] 进一步的，本发明提供猪瘟疫苗C株的全长感染性cDNA，该全长感染性cDNA包 含了猪瘟疫苗C株全长cDNA、在该cDNA5'末端融合猪RNA聚合酶I启动子（GenBank No.L31782. 1)，其序列为SEQIDNO:1 ;在cDNA3'插入鼠RNA聚合酶I终止子，其序列为 SEQIDNO：2 ；
[0009] 为实现上述目的，本发明提供一种构建上述猪瘟疫苗C株的全长感染性cDNA克隆 的方法，包括：
[0010] 1)以猪瘟疫苗C株RNA为模板，应用根据猪瘟疫苗C株全长基因组序列（Genbank No.AF091507)设计合成的6对特异性PCR扩增引物（SEQIDNO:3-14)，采用RT-PCR，获得 猪瘟疫苗C株全长基因组6个cDNA片段（CSf1-6);
[0011] 2)将所扩增的PCR片段采用限制性内切酶消化、T4连接酶连接的策略，克隆到质 粒载体中；
[0012] 3)猪瘟疫苗C株感染性cDNA克隆质粒的构建：
[0013] (1)构建5'端半长基因组大片段：即将片段CSfl、CSf2和CSf3依次连接到低拷 贝质粒PACNR1180 (由N.Ruggli和J.D.Tratschin博士赠送），构建pA-CSf123;
[0014] (2)构建3'端半长基因组大片段：即将片段CSf4、CSf5和CSf6依次连接到低拷 贝质粒PACNR1180,构建pA-CSf456;
[0015] (3)构建融合猪RNA聚合酶I启动子的猪瘟疫苗5 '末端的重组质粒 pSPI-CSfl23；
[0016]A).猪RNA聚合酶I启动子（pSPolI)片段制备：根据猪RNA聚合酶I启动子序列 (GenBankNo.L31782. 1)设计启动子片段PCR扩增引物（SEQIDN0:15-16)，以猪源PK-15 细胞的DNA为模板，扩增猪RNA聚合酶I启动子，采用DNA回收试剂盒纯化PCR产物，测序 确证，-70°C保存备用；
[0017]B).猪瘟疫苗C株5 '末端784bp片段扩增：构建猪瘟疫苗cDNA序列，设计一对 PCR引物（SEQIDN0:17-18)，扩增基因组Y末端784bp片段，以pA-CSfl23重组质粒为 模板，采用DNA回收试剂盒纯化PCR产物，测序确证，-70°C保存备用；
[0018]C).pACNR1180载体骨架片段扩增：根据pACNR1180载体序列（SEQIDN0 :19)设 计扩增引物（SEQIDN0 :20-21)，以pA-CSf123重组质粒为模板，获得pACNR1180载体片段 PCR产物，采用DNA回收试剂盒纯化PCR产物，测序确证，-70°C保存备用；
[0019] D).融合猪瘟疫苗C株5'末端和猪RNA聚合酶I启动子的PACNR1180载体骨 架片段扩增：以上述制备的猪瘟疫苗C株5'末端784bp片段、猪RNA聚合酶I启动子和 PACNR1180载体片段混合物为模板，以SEQ ID N0 :20为上游引物、SEQ ID N0 :18为下游引 物，PCR扩增获得融合猪瘟疫苗5'末端和猪RNA聚合酶I启动子的pACNR1180载体骨架片 段PCR产物A-SPI-CS-5'，采用DNA回收试剂盒纯化PCR产物，测序确证，-70°C保存备用；
[0020] E).融合猪RNA聚合酶I启动子的猪瘟疫苗5'末端重组质粒PSPI-CSH23构建： 分别用限制性内切酶Pmll和Mlul双酶切消化质粒pA-CSfl23和A-SPI-CS-5' DNA片段， DNA回收试剂盒纯化制备A CSfl23和A-SPI-CS-5'片段，两种片段按1:2混合，T4DNA连 接酶连接、转化，挑选阳性克隆，测序确证得到PSPI-CSH23 ;
[0021] (4)构建融合鼠RNA聚合酶I终止子〇\)的猪瘟疫苗3'末端重组质粒 pA-CSf456-TI:
[0022] 根据鼠RNA聚合酶I终止子序列（SEQIDNO:2)和猪瘟疫苗C株3'末端序列， 设计合成融合鼠终止子序列的长序列引物（SEQIDN0:9、22)，以重组质粒pA-CSf456为模 板，通过PCR获得融合鼠RNA聚合酶I终止子的猪瘟疫苗3'末端PCR产物05€456-1'1片 段；
[0023] 分别用限制性内切酶SphI和Mlul双酶切消化质粒pA-CSf456和03€456-1'1片 段，DNA回收试剂盒纯化制备双酶切粘性末端的线性化pA-CSf456和CSfASe-t片段，两 种片段按1:3-1:10摩尔比例混合，T4DNA连接酶连接、转化，挑选阳性克隆，测序确证得到 pA-CSf456-TI；
[0024] (5)基于猪RNA聚合酶I启动子（pSPolI)和鼠RNA聚合酶I终止子〇\)的猪瘟 疫苗感染性cDNA克隆pASPITfCS构建：
[0025] 将上述构建的猪瘟疫苗5'末端大片段质粒pSPI_CSfl23和3'末端大片段质粒 pA-CSf456-TAv别用BamHI和Mlul双酶切消化，回收线性化pSPI-CSf123和CSf456-T:片 段，两者按4:1摩尔比例混合，T4DNA连接酶连接、转化，挑选阳性克隆