专利名称：一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法
技术领域：
本发明涉及兔体热反应测定方法，以替代家兔测定猪瘟兔化弱毒疫苗能否引起家兔产生热反应是否合格的方法，克服了因家兔个体差异和环境因素导致结果的偏差。
背景技术：
常规的兔体热反应测定方法是选取体重为1.5 3.0kg的健康家兔2只，将猪瘟兔化弱毒疫苗150倍稀释后从家兔耳缘静脉接种到体内，每只1ml，家兔接种后，上、下午各测体温I次，48小时后，每隔6小时测体温I次，定型热的兔子潜伏期24 48h，体温上升呈明显曲线，超过常温1°C以上，至少有3个温次，并稽留18 36h ;当2只家兔均呈定型热反应(++)，或I只兔呈定型热反应(++)、另I只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格；此方法因家兔个体差异、环境因素、人为操作因素造成假阳性和假阴性，导致检测结果的偏差，最终导致猪瘟兔化弱毒疫苗质量的不稳定。对国内最新相关研究的进展和成果进行检索后结果表明:猪瘟兔化弱毒株除用上述方法进行兔体热反应测定，还有实时荧光定量PCR，此方法有相关机构正在研究，但此方法成本高，对设备和人员素质要求较高，从研发到推广尚需时日；而用免疫荧光检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法经国内范围内的检索查证，国内未见与本项目研究内容相同的成果公开报道。本发明构思是将已知兔体热反应的猪瘟兔化弱毒疫苗接种PK-15细胞，培养5天后，用免疫荧光检测猪瘟病毒的半数组织感染量(TCID5tl)，得到兔体热反应和半数组织感染量之间的关系，用猪瘟病毒的TCID5tl替代家兔感染量，结果表明采用猪瘟病毒的TCID5tl替代家兔感染量，本检测方法具有极强的稳定性与可重复性。
发明内容
本发明的目的在于:提供得的用免疫荧光检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法，替代了用家兔进行兔体热反应的测定，确定猪瘟兔化弱毒疫苗是否合格，既节省时间又节约人力。本发明目的是这样实现的:一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法，将猪瘟兔化弱毒株2倍梯度稀释，然后接种于PK-15细胞，在37°C含5%的CO2培养箱中培养5日进行免疫荧光法的测定，Reed-Muench法计算病毒价，即为TCID5tl ；
其中病毒的稀释:
将空白的96孔板中加入100 ill的无血清的MEM，然后将已知兔热反应的猪瘟兔化弱毒株用移液器吸取100 u I加入96孔板的第I排，每个稀释度做8重复，用移液器反复吹打混匀，从第I排吸取100 U I加至第2排进行2倍梯度稀释，如此稀释至第11排，从第11排吸取IOOiU弃去，第12排为阴性对照；
其中PK-15细胞的制备:
将生长致密的PK-15单层细胞用D-Hanks洗2次，加入浓度为0.25%的EDTA 胰酶消化细胞，消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞，取其中IOOMl,加900M1的D-Hanks液,混匀后滴于血细胞计数板上,按白细胞计数法,于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞，计数完毕后将细胞稀释到约1.0X IO5个/ml，加入96孔板内，加细胞顺序从第12排阴性开始,从使每孔细胞数约为1.0\104个,然后置于37°(:、5%的CO2培养箱中培养，培养5天后备用；
其中间接免疫荧光法的检测:
1)细胞的固定，将培养5天的接种猪瘟兔化弱毒株的PK-15细胞板取出，将病毒液倒入废弃桶中，每孔加入200 ill的PBST洗6次后，每孔加入100 ill的4%福尔马林，固定10分钟；其中PBST是0.lmol/L的PBS中加入0.05%的吐温20配制所得；
2)一抗反应，固定完毕，每孔加入200 u I的PBST洗6次，以1%PBA 1000倍稀释一抗，每孔加入50 u I的一抗，置于室温反应I小时后，每孔再加入200 u I的PBST洗6次；其中1%PBA,即PBS中加入1%BSA配制所得；
3)二抗反应，以1%PBA1000倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG 二抗，每孔加入50 yl的FITC标记的兔抗猪的IgG 二抗，置于室温反应I小时，每孔加入200 u I的PBST洗4次；
4)毒价的判定，将PBST倒干后，再加入50u 1PBST，并于倒立于荧光显微镜下，判读猪瘟兔化弱毒株毒价，以Reed-Muench方式计算病毒毒价，以TCID5ciAil表示，测得兔体热反应和TCID5tl之间的关系；
其中兔体热反应和TCID5tl之间的关系的验证:
将未知兔体热反应和TCID5tl的猪瘟兔化弱毒株首先进行TCID5tl的测定，按照兔体热反应和TCID5tl之间的关系将猪瘟兔化弱毒株稀释至I个兔体热反应，接种家兔，测定家兔的热反应。所述方法避免了因家兔个体差异造成家兔定型热的假阴性和假阳性，确保所检测的猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的稳定性和可重复性。本发明的作用机理:猪瘟兔化弱毒株可在PK-15细胞上增殖，但不引起细胞病变，用常规的方法不能检测病毒的TCID5tl，而本发明利用免疫荧光的方法测定猪瘟兔化弱毒株的TCID5tl，猪瘟兔化弱毒株作为抗原结合在细胞上，固定细胞，加入猪瘟兔化弱毒株的抗体与抗原结合，然后再与带有荧光标记的二抗进行结合，最终使猪瘟兔化弱毒株的TCID5tl通过突光来判定。本发明方法，使用免疫荧光检测猪瘟病毒兔化弱毒株进行兔体热反应的测定，与常规的家兔测定猪痕兔化弱毒株的兔体热反应相比，避免了因家兔个体差异、环境因素、人为操作因素造成假阳性和假阴性，导致检测结果的偏差，最终导致猪瘟兔化弱毒疫苗质量的不稳定，同时节约了成本、时间和人力，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对发明作进一步说明。检测流程:病毒稀释、细胞制备、细胞计数、接种、免疫荧光的检测、计算TCID5tl，得到TCID5tl和兔体热反应之间的关系，检测未知病毒的TCID5tl,验证TCID5tl和兔体热反应之间的关系步骤；其中病毒的稀释:
将空白的96孔板中加入100 ill的无血清的MEM，然后将已知兔体热反应的猪瘟兔化弱毒株用移液器吸取IOOiU加入96孔板的第I排(每个稀释度做8重复)，用移液器反复吹打混匀，从第I排吸取100 u I加至第2排，如此稀释至第11排，第11排吸取100 Ul弃去，第12排为阴性对照。其中细胞的制备:
将生长致密的PK-15单层细胞用D-Hanks洗2次，加入浓度为0.25%的EDTA 胰酶消化细胞，消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞；取其中100M1,加900M1的D-Hanks液,混匀后滴于血细胞计数板上,按白细胞计数法,于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞；计数完毕后将细胞稀释到1.0X 105/ml，加入到上述稀释病毒的96孔板内，使每孔细胞数约为1.0 X IO4个，然后置于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养5天后备用。其中免疫荧光的检测:
I)细胞的固定，将培养约5天的接种猪瘟兔化弱毒株的PK-15细胞板取出，将病毒液倒入含有2%Na0H的废液桶中，每孔加入200 U I的PBST洗6次后，每孔加入100 U I的4%的福尔马林，固定10分钟。其中PBST是0.lmol/L的PBS (磷酸缓冲液)中加入0.05%的吐温20配制所得。2) 一抗反应，固定完毕后每孔加入200 ill的PST洗6次，以1%PBA1000倍稀释一抗，每孔加入50 u I的一抗，置于室温反应I小时后，每孔加入200 u I的PBST洗6次。其中1%PBA，即PBS中·加入1%BSA (牛血清白蛋白)配制所得。3)二抗反应，以1%PBA1000倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG 二抗(避光)，每孔加入50 ill的FITC标记的兔抗猪的IgG 二抗，置于室温反应I小时，每孔加入200 U I的PBST洗4次。4)毒价的判定，将PBST倒干后，再加入50 iUPBST，并倒立于荧光显微镜下判读猪瘟兔化弱毒株毒价，以Reed-Muench方式计算病毒毒价，以TCID5(l/ml表示，测得3个TCID5tl量相当于I个兔体感染。其中兔体热反应和TCID5tl之间的关系的验证:
将未知兔体热反应和TCID5tl的猪瘟兔化弱毒株首先进行TCID5tl的测定，测定方法按上述方法进行，测得猪瘟兔化弱毒株的TCID5tl,按照兔体热反应和TCID5tl之间的关系将猪瘟兔化弱毒株稀释至I个兔体热反应，接种家兔，测定家兔的热反应。猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验标准:兔体热反应的测定方法，用家兔效检，按测得的猪瘟兔化弱毒株灭菌生理盐水稀释至9个、3个、I个TCID5ciAil，每个稀释度耳静脉注射体重
1.5或2.0或3.0kg家兔6只，每只兔耳静脉注射1ml，家兔接种后，上下午各测体温I次，48小时后，每隔6小时测体温I次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。①家兔接种兔化弱毒株后，体温反应标准如下:
定型热反应(++)潜伏期48或96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过常温1°C以上,并稽留18或36小时,如稽留42小时以上,必须攻毒，攻毒后无反应可判为定型热；
轻热反应(+)潜伏期48或96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温0.50C以上，并稽留12或36小时；
可疑反应(±)潜伏期48或96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应；
体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒，攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应；
无反应(一)体温正常。②结果判定:
注射病毒后，当2只家兔均呈定型热反应(++)，或I只兔呈定型热反应(++)、另I只兔呈轻热反应(+)时，稀释的猪瘟兔化弱毒株判为可引起家兔热反应，结果见下表。表三批猪瘟兔化弱毒株稀释后进行兔体热反应试验结果
权利要求
1.一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法，其特征在于:将猪瘟兔化弱毒株2倍梯度稀释，然后接种于PK-15细胞，在37°C含5%的CO2培养箱中培养5日进行免疫荧光法的测定，Reed-Muench法计算病毒价，即为TCID5tl ； 其中病毒的稀释: 将空白的96孔板中加入100 ill的无血清的MEM，然后将已知兔热反应的猪瘟兔化弱毒株用移液器吸取100 u I加入96孔板的第I排，每个稀释度做8重复，用移液器反复吹打混匀，从第I排吸取100 U I加至第2排进行2倍梯度稀释，如此稀释至第11排，从第11排吸取IOOiU弃去，第12排为阴性对照； 其中PK-15细胞的制备: 将生长致密的PK-15单层细胞用D-Hanks洗2次，加入浓度为0.25%的EDTA 胰酶消化细胞，消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞，取其中100M1,加900M1的D-Hanks液,混匀后滴于血细胞计数板上,按白细胞计数法,于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞，计数完毕后将细胞稀释到约1.0X IO5个/ml，加入96孔板内，加细胞顺序从第12排阴性开始,从使每孔细胞数约为1.0\104个,然后置于37°(:、5%的CO2培养箱中培养，培养5天后备用； 其中间接免疫荧光法的检测: 1)细胞的固定，将培养5天的接种猪瘟兔化弱毒株的PK-15细胞板取出，将病毒液倒入废弃桶中，每孔加入200 ill的PBST洗6次后，每孔加入100 ill的4%福尔马林，固定10分钟；其中PBST是0.lmol/L的PBS中加入0.05%的吐温20配制所得； 2)一抗反应，固定完毕，每孔加入200 u I的PBST洗6次，以1%PBA 1000倍稀释一抗，每孔加入50 u I的一抗，置于室温反应I小时后，每孔再加入200 u I的PBST洗6次；其中1%PBA,即PBS中加入1%BSA配制所得； 3)二抗反应，以1%PBA1000倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG 二抗，每孔加入50 yl的FITC标记的兔抗猪的IgG 二抗，置于室温反应I小时，每孔加入200 u I的PBST洗4次； 4)毒价的判定，将PBST倒干后，再加入50u 1PBST，并于倒立于荧光显微镜下，判读猪瘟兔化弱毒株毒价，以Reed-Muench方式计算病毒毒价，以TCID5ciAil表示，测得兔体热反应和TCID5tl之间的关系； 其中兔体热反应和TCID5tl之间的关系的验证: 将未知兔体热反应和TCID5tl的猪瘟兔化弱毒株首先进行TCID5tl的测定，按照兔体热反应和TCID5tl之间的关系将猪瘟兔化弱毒株稀释至I个兔体热反应，接种家兔，测定家兔的热反应。
2.按照权利要求1所述方法，其特征在于:该方法避免了因家兔个体差异造成家兔定型热的假阴性和假阳性，确保所检测的猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的稳定性和可重复性。
全文摘要
本发明是一种用于猪瘟兔化弱毒测定兔体热反应的新方法，即对已知兔体热反应的猪瘟兔化弱毒半数组织感染量(TCID50)实施测定，将病毒在96孔板内2倍梯度稀释，接种ST细胞，在37℃、5%的CO2培养箱中培养，用免疫荧光方法测定猪瘟兔化弱毒的TCID50，得到病毒TCID50与兔体热反应之间的关系；然后再用免疫荧光方法测定未知兔体热反应和TCID50的猪瘟兔化弱毒的TCID50，根据TCID50与兔体热反应之间的关系将猪瘟兔化弱毒稀释成9个TCID50，3个TCID50，1个TCID50，注射到家兔体内进行热反应检测，其中9个TCID50，3个TCID50可使家兔产生有效热反应，与最初得到的3个TCID50可使家兔产生有效热反应的关系一致。
文档编号G01N33/569GK103105493SQ201310048618
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者李俊辉, 李延涛, 贺笋, 王尊宝, 刘宏 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司