猪瘟‑猪圆环二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术：

猪瘟是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养猪和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(oie)将其定为a类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。

猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状rna病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。csfv基因组全长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(orf)，此orf编码约3898个氨基酸残基、分子量约438kda的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，依次为npro,c,erns,e1,e2,p7,ns2,ns3,ns4a,ns4b,ns5a,ns5b，其中c,erns,e1和e2为结构蛋白,其余为非结构蛋白。e2是csfv最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗csfv强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

猪圆环病毒2型(porcinecircovirus,pcv-2)被认为是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(pmws)、猪增生性坏死性肺炎(pnp)、猪皮肤与肾病综合征(pdns)、猪呼吸系统疾病综合征(prdc)、猪繁殖障碍、猪先天性震颤及肠炎等疾病的主要病原，统称为猪圆环病毒2型相关疾病，而且pcv-2感染还会引起免疫抑制，极易导致其它病原混合感染或继发感染，是目前严重危害我国养猪业的病原之一。在我国，目前几乎100％的猪场为猪圆环病毒2型阳性。

pcv2是目前已知的最小的病毒之一，其基因组是一条共价闭合单链dna，约1.76kb～1.77kb。一般认为，pcv2仅有3个开放阅读框(openreadingframes，orfs)可以编码蛋白。其中orf2又称为cap基因，位于互补链上，呈逆时针方向，负责编码唯一的结构蛋白cap蛋白，其氨基酸长度为233～234氨基酸残基。cap蛋白也是pcv2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生并且能够保护猪抵抗pcv2强毒株的攻击，也是研究猪圆环病毒2型基因工程疫苗的重要靶蛋白。

在我们规模化养殖的发展中，由于频繁引种、生物安全防范意识较差、管理不到位、人员专业素质较低等原因导致目前规模化猪场疾病多且杂，疫苗免疫仍是防治这些疾病爆发的首要选择。因此，目前猪用疫苗很多，一头商品猪在整个生长周期中，要进行多次免疫接种。在实际操作中，多针次、多剂量、多种疾病免疫程序难以合理安排，这样既繁琐、费时、费力、增加成本，而且容易造成遗漏，直接影响免疫效果和猪群的健康。因此，研究能同时预防2种或2种以上疾病的猪用疫苗是猪用兽用制品的一个发展方向。

目前，猪瘟疫苗主要是弱毒活疫苗，主要有3种，即猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)、猪瘟乳兔组织活疫苗(组织苗)、猪瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)。这些疫苗普遍存在生产工艺复杂、批间差异大、易受外援病毒污染等缺点，另外，由于长期使用活疫苗，导致无法从根本上净化猪瘟。目前，圆环疫苗主要有全病毒灭活苗和杆状病毒表达cap蛋白的灭活疫苗。由于目前猪瘟疫苗是活疫苗，若与其他疫苗配制联苗，可能会导致猪瘟病毒与其他病毒的基因组或其他疫苗中残留的核酸重组，易引起猪瘟病毒的变异，存在极大的生物安全隐患，不利于猪瘟与其他疾病研究联苗；再次，活疫苗与其他疫苗联用，可能会存在免疫干扰的问题，最后，有的将活疫苗与其他疫苗在制备联苗时分开包装，使用时再混合在一起，这样一会造成包装成本升高，二来不方便终端用户使用。由于亚单位疫苗是病毒的抗原蛋白组成，不存在病毒重组和变异的隐患，也不存在免疫干扰的问题，更不用分开包装并在使用时混合，因此是研究猪用联苗一个非常好的方向。猪瘟病毒e2蛋白的等电点是6.3，而猪圆环病毒2型cap蛋白的等电点是9.4，在中性缓冲液中(如pbs、生理盐水等)，猪瘟病毒e2蛋白带正电荷，猪圆环病毒2型cap蛋白带负电荷，因此两种蛋白在同一体系中存放时间较长时，可能会结合从而沉淀，从而会影响联苗的保存期和免疫效果。因此，在猪瘟和猪圆环二联亚单位疫苗的研究中需要克服这一影响稳定性的重要问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题：一是开发一种可大规模工业化生产、质量好、无免疫干扰且能够同时预防猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的疫苗，二是克服目前规模化猪场存在的多针次、多剂量、多种疾病免疫程序难以合理安排的问题；三是克服利用猪瘟活疫苗研制联苗时可能导致猪瘟病毒与其他病毒的基因组或其他疫苗中残留的核酸重组，引起猪瘟病毒的变异，从而存在极大的生物安全隐患以及可能存在的免疫干扰的问题；四是避免使用猪瘟活疫苗制备二联苗时需要将猪瘟病毒和其他疾病抗原分开包装并在使用时混合的麻烦。

本发明提供了一种猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗，所述疫苗包含猪瘟病毒e2蛋白、猪圆环病毒2型cap蛋白以及药学上可以接受的佐剂；所述疫苗中每头份含猪瘟病毒e2蛋白7.5～140μg，所述疫苗中每头份含猪圆环病毒2型cap蛋白25～200μg。

本发明的技术方案中，所述猪瘟病毒e2蛋白为全长的猪瘟病毒e2蛋白、或截断的猪瘟病毒e2蛋白。

本发明的技术方案中，所述猪圆环病毒2型cap蛋白为全长的猪圆环病毒2型cap蛋白、或截断的猪圆环病毒2型cap蛋白。

本发明的技术方案中，所述疫苗中每头份含猪瘟病毒e2蛋白为30μg。

本发明的技术方案中，所述疫苗中每头份含猪圆环病毒2型cap蛋白为60μg。

本发明的技术方案中，所述药学上可以接受的佐剂为水包油佐剂(如10号白油等)、水包油包水佐剂(如isa201vg佐剂、isa206vg佐剂等)、油包水佐剂(如isa15avg、isa35vg佐剂等)、水佐剂(如铝胶佐剂、ims251cvg佐剂等)，优选的为montanidegel01pr佐剂。

本发明的技术方案中，所述疫苗还含有防腐剂，优选的防腐剂为硫柳汞，优选的硫柳汞的含量为2μg/头份。

本发明还提供了一种制备猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗的方法，该方法包括以下步骤：1)制备猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白；2)将1)中制备的猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白制备成抗原液；其中，每头份含猪瘟病毒e2蛋白7.5～140μg，每头份含猪圆环病毒2型cap蛋白25～200μg；3)将抗原液与montanidegel01pr佐剂按照质量比10:1混合搅拌。

本发明的技术方案中，优选的制备疫苗的抗原液中还含有防腐剂。

本发明的动物免疫实施例中，发现无论是猪瘟e2蛋白还是猪圆环病毒2型cap蛋白，表达全长蛋白制备的疫苗与表达截短的蛋白制备的疫苗在免疫原性方面相当。

本发明的动物免疫实施例中，发现，发现无论是猪瘟e2蛋白还是猪圆环病毒2型cap蛋白，二免前不同剂量的疫苗产生的抗体效价有差异，免疫高剂量的疫苗比免疫低剂量的疫苗产生的抗体效价要高，但是在二免后效价基本无差异。

本发明的动物免疫实施例中，发现免疫该猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗与单独免疫猪瘟亚单位疫苗或猪圆环亚单位疫苗相比，在免疫后存在一定的协同刺激作用，即在免疫后，联苗的效价滴度较单独免疫猪瘟亚单位疫苗或猪圆环亚单位疫苗效价滴度高，且基本上能够达到甚至优于单独免疫猪瘟亚单位疫苗或猪圆环亚单位疫苗的保护效果。

本发明继续跟踪了实施例中制备的疫苗的稳定性，发现实施例中制备的4批二联疫苗与单独的猪瘟e2亚单位疫苗和单独的猪圆环病毒2型亚单位疫苗都能在4℃存放一年以上，这能够满足疫苗在规模化生产中的应用，能克服背景介绍中提及的二联亚单位疫苗可能存在的稳定性较差的问题。

本发明提供了一种能同时预防猪瘟和猪圆环二联亚单位疫苗，该疫苗具备免疫原性强、安全性好、不存在免疫干扰、不会导致病毒变异的生物安全隐患、能够从根本上净化猪瘟病毒和猪圆环病毒2型等优点；通过该疫苗进行免疫接种，可有效预防和保护猪免受猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的感染，能够达到“一针两防”的效果，省时、省力、节约成本，能克服目前规模化猪场存在的多针次、多剂量、多种疾病免疫程序难以合理安排的问题、也能避免分开包装和使用时混合的麻烦；同时，本发明制备的猪瘟、猪圆环二联亚单位疫苗至少能够在4℃储存一年以上，能够满足产业化应用。

与现有技术相比，本发明首次明确提出了一种猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明的疫苗具有免疫原性强、安全性好、不存在免疫干扰、不会导致病毒变易的生物安全隐患、能够从根本上净化猪瘟病毒和猪圆环病毒2型等优点；且通过该疫苗进行免疫接种，可有效预防和保护猪免受猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的感染，能够达到“一针两防”的效果，省时、省力、节约成本，能克服目前规模化猪场存在的多针次、多剂量、多种疾病免疫程序难以合理安排的问题、也能避免分开包装和使用时混合的麻烦。

附图说明

图1a表示idexx猪瘟抗体检测试剂盒检测结果。

图1b表示韩国金诺猪圆环抗体检测试剂盒检测结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明试剂均是市售产品。

montanidegel01pr佐剂购自法国赛比克公司。

实施例1：猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒2型cap蛋白的制备

1.1猪瘟病毒e2蛋白制备：参照申请号为200810178235.4或200310103408.3或200810150304.0或201310300549.8或200810178235.4或201610625392.x或201510187995.1的发明专利中猪瘟e2蛋白的制备方法或者其他专利或文献中的制备方法制备猪瘟e2蛋白，可根据实际需要制备全长的猪瘟e2蛋白或截短的猪瘟e2蛋白。

1.2猪圆环病毒2型cap蛋白制备：参照申请号为201310050003.1或201210270504.6或201110100331.9或201110053536.6或201010618223.6的发明专利中猪圆环病毒2型cap蛋白的制备方法或其他专利或文献中的制备方法制备猪圆环病毒2型cap蛋白，可根据实际需要制备全长的猪圆环病毒2型cap蛋白或截短的猪圆环病毒2型cap蛋白。

实施例2：猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗的制备(以制备1ml/头份，共220g为例说明)

所用制备疫苗的耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。

1.montanidegel01pr(佐剂)准备：根据抗原液和佐剂质量比为10:1，称取佐剂质量为20g(约20ml)置于预先准备好的试剂瓶中，封口，待用。

2.根据抗原液和佐剂质量比为10:1，抗原液总质量为200g(约200ml)。根据猪瘟病毒e2蛋白浓度和猪圆环病毒2型cap蛋白浓度以及疫苗中各蛋白的含量，计算e2蛋白和cap蛋白取用的体积；用pbs缓冲液或其他缓冲液将抗原液总质量补充至200g(约200ml)，混匀，待用。其中，猪瘟病毒e2(csfv-e2)蛋白和猪圆环病毒cap(pcv2-cap)蛋白的浓度均为0.5mg/ml，疫苗中猪瘟病毒e2蛋白和猪圆环病毒cap蛋白含量分别为30μg/头份(1ml/头份)和60μg/头份(1ml/头份)，。具体配置如下表1所示：

表1

3.搅拌：将准备好的抗原液置于预先准备好的烧杯(根据制备量选择大小合适的烧杯，如制备220ml选择500ml的烧杯即可)中，调整好搅拌机的高度和速度，再将准备好的佐剂加大抗原液中，继续搅拌20-30min。一般根据制备体积选择搅拌速度和搅拌时间，如制备220ml疫苗，一般选择500rpm/min搅拌20min即可。

4.分装：稳定好的疫苗根据需要分装并写上标签。

实施例3：猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗免疫实验

3.1疫苗制备：按照实施例1和2的方法制备蛋白和疫苗，具体疫苗信息见下表2所示：

表2

3.2免疫实验：筛选28-35日龄仔猪35头(csfv和pcv2抗原抗体阴性)，随机分成7组，每组5头，一组作为空白对照组，其他6组分别免疫疫苗1至疫苗6。空白对照组每次肌肉注射1ml生理盐水，另外6组免疫组每次肌肉注射1ml相应的疫苗，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和二免后21天采集血清，检测抗体效价。

实验结果如图1a所示，idexx猪瘟抗体检测试剂盒检测结果显示：免疫猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗(疫苗2)的猪瘟抗体效价在二免前较单独免疫猪瘟病毒e2蛋白亚单位疫苗(疫苗5)的猪瘟抗体阻断率较高，约高5％-10％，但在二免后两组免疫组阻断率基本保持一致，平均阻断率均高于80％；不同剂量的猪瘟e2蛋白制备的疫苗，在二免前阻断率有差异，疫苗中猪瘟e2蛋白含量越高，阻断率相对要高，但在二免后阻断率基本一致，均高于80％。

实验结果如图1b所示，韩国金诺猪圆环抗体检测试剂盒检测结果显示：免疫猪瘟-猪圆环二联亚单位疫苗(疫苗2)的猪圆环抗体效价在二免前较单独免疫猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗(疫苗6)的猪圆环抗体效价较高，s/p值约高0.1-0.2，但在二免后两组免疫组s/p值基本保持一致，平均s/p值均高于1.5；不同剂量的猪圆环病毒2型cap蛋白制备的疫苗，在二免前s/p值有差异，疫苗中猪圆环病毒2型cap蛋白含量越高，s/p值相对要高，但在二免后s/p值基本一致，平均s/p值均高于1.5。

图1a和图1b的结果显示，疫苗1和疫苗2的猪瘟抗体效价和圆环抗体效价基本一致。因此无论是猪瘟e2蛋白还是猪圆环病毒2型cap蛋白，表达全长蛋白制备的疫苗与表达截短的蛋白制备的疫苗在免疫原性方面相当。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方法。