一种猪圆环病毒2型灭活疫苗水性佐剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明主要涉及猪用疫苗领域。具体涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的水性佐 剂及应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综 合征（PMWS)的主要病原，该疾病主要特征是免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭。此病主要发 生在6-15周龄的断奶仔猪，病猪主要表现在生长发育不良、呼吸困难、贫血、腹泻、衰弱、淋 巴结肿大、增重迟缓、黄疸等临床症状，并且还能够使感染仔猪的免疫功能受到损害，导致 机体免疫力下降，从而引发继发性感染，加重病情的发生。主要病理特征是淋巴组织中淋巴 细胞缺失、炎性粒细胞浸润等。此外，PCV2还与母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、猪皮炎 肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征等病症相关。近几年来，我国猪群也大量爆发PMWS，随 着PMWS大量流行，也给我国养猪业造成十分严重后果。疫苗免疫室控制PCV2感染引起相 关疾病的重要手段。而在疫苗的研制中，病毒抗原含量与佐剂类型对免疫效果影响很大。
[0003] 当前我国兽用疫苗主要以油佐剂为主，即以非离子表面活性剂（TweenS(KSpanSO) 作为剂型稳定剂和抗原在高剪切力作用下制备油包水剂型疫苗。该疫苗的黏度大，注射困 难，副反应大，且难于吸收，易对动物胴体品质造成不良影响。近年来，国内外也成功制备出 水包油包水疫苗和水包油疫苗。这些佐剂主要是通过不同的表面活性剂和适当的比例制备 而成。但是由于这些佐剂不太稳定而且价格昂贵，使得国内疫苗厂家难以推广使用。
[0004] 在选择合适佐剂时必须考虑多种因素。佐剂应该以最有效方式使抗原的释出和吸 收速率缓慢，且对宿主的毒性、变应原性、刺激性及其它不想要的副作用。为了使人满意， 佐剂应为非杀灭病毒性、可生物降解性、可持续产生高水平的免疫力、能够刺激交叉保护作 用、可与多种抗原相互兼容、在多种物种中均有效、且对宿主无毒无副作用（如：无注射部 位反应）。其它期望的佐剂特征为可微量给药、剂量节省、具有优良的货架稳定性、可承受干 燥、可制成不含油、可作为固体或液体存在、容易简单制备、工艺简单且其制造并不昂贵。最 后，高度期望能够根据疫苗接种方案的需要而将佐剂配置成诱导体液免疫应答或细胞免疫 应答或二者兼有。然而，可符合上述条件的佐剂数量有限。
[0005] 从南美洲皂树（Quillaja saponaria)树皮提取的皂苷作为佐剂已有一段时间。 (Lacai11e-Dubois,M and Wagner H. (A review of the biological and pharmacological activities of saponins。）当前许多兽用疫苗佐剂包含QuilA，QuilA来自南美洲智利阜 荚树（Quillaja saponaria molina)树皮的阜苷馏分。将QuilA进一步分馏则产生次馏分， 包括 QS-7、QS-17、QS-18 及 QS-21 (美国专利 No :5057540)。
[0006] 为了克服Quil A的溶血及杀病毒性质，现已将其与胆固醇和磷脂组合而形成称为 免疫刺激性复合物（ISCOM)或ISCOM基质（ISC0MATRIX)的特殊结构。（Ozel M.，et al.; J. Ultrastruc. and Molec. Struc. Re 102, 240-248 (1989)。当与抗原组合时，ISCOM 通常会 诱导Thl细胞毒性T细胞应答。然而，尽管大幅减弱Quil A的溶血性质，但Quil A与胆固 醇组合并不会完全消除此类性质。ISCOM的另一限制为蛋白质抗原必须具有足够大的疏水 结构域来与ISCOM交互作用，从而被并入ISCOM中。高度亲水的蛋白质无法被并入ISCOM 中。因此，ISCOM可以在受试者体内产生自体免疫应答。
[0007] 二甲基双十八烷基溴化铵（以下称"DDA"）和拉韦定。DDA为亲脂性季铵化合物 (胺），其带有结合正电荷季铵分子的二个18碳烷基链及二个甲基基团，分子量为631。其 作为佐剂的用途由Gall (Immunol. V. 11，p. 369,1966)发现。据报导，DDA可刺激强烈的经 细胞介导的免疫应答，亦显示出可诱导体液免疫应答。许多论文已发表，证明DDA作为蛋白 质抗原、半抗原（hapten)、肿瘤、病毒、原生动物及细菌的佐剂的效力。（Korsholm，K S.，et al.，Immunology，vol. 121，pp.216-226,2007)〇
[0008] Montanide GEL 01 (购于法国SEPPIC公司）是一种高度稳定的聚合物（聚丙稀酸 酯）凝胶颗粒分散体。储存效果以及多聚合物吸收所带来的缓释特性，改善了固有的免疫 应答系统。
[0009] 优选的聚合物是由糖或多元醇的多链烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。 这些聚合物是以聚羧乙烯聚合物（carbomer)的名称为人们所熟识。这些聚合物通常是 由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的。其中，可以提到Carb〇P〇?l 974p、Carb〇Pd? 934p、 CiirbopoIS, 97 Ip〇
[0010] 左旋咪唑是一种广谱驱虫药，是第一个被发现具有免疫调节作用的化学合成物， 具有广泛的免疫调节活性，在畜牧业中广泛应用。左旋咪唑能使抗胸腺依赖性和抗胸腺非 依赖性抗原的抗体滴度明显升高。其免疫调节活性机理有三方面：一是具有拟胆碱能活性 (与咪唑基团有关）；二是能诱导机体产生各种淋巴因子，三是其代谢产物具有清除自由基 功能。
[0011] 在本发明佐剂组合物之前并无佐剂组合物拥有理想期望特征。我们一直在努力寻 求用于猪圆环病毒2型灭活疫苗中，可克服常规佐剂缺陷的新佐剂组合物。特别地，高度期 望本发明佐剂组合物，可在动物中经细胞介导的细胞免疫应答及体液免疫应答，但无常规 佐剂的副作用和配制困难等优点。本申请制备的佐剂组合物用于猪圆环病毒2型灭活疫 苗。该疫苗的应用可以有效减少猪圆环病毒2型发病率，或减缓由猪圆环病毒感染引起的 猪断奶后多系统衰竭综合征。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种水性佐剂组合物，该佐剂组合物包含聚合物、聚羧 乙烯聚合物、皂苷、固醇、季铵化合物及左旋咪唑。本发明的佐剂组合物优选配方为： Montanide GEL 01，Carbopol 974p，Quil A，胆固醇，二甲基双十八烷基溴化铵（DDA)及左 旋咪唑。
[0013] 本发明的另一个目的在于提供一种水性佐剂组合物在制备猪圆环病毒2型灭活 疫苗中的应用。利用该佐剂组合物能够显著提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的体液免疫应答 和细胞免疫应答，不但可以在14天就产生较高抗体水平，而且可激发机体产生长达150天 的高效保护力。该佐剂组合物制备疫苗时不需要大型乳化设备，疫苗制备工艺稳定、疫苗免 疫后副反应小等优点。
[0014] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0015] 一种水性佐剂组合物，其配方包含：
【主权项】
1. 一种水性佐剂组合物，该佐剂组合物包含聚合物、聚羧乙烯聚合物、皂苷、固醇、季 铵化合物及左旋咪唑。
2. 根据权利要求1所述的水性佐剂组合物，其配方包含： 组分 体积 Montanide GEL 01 0.2-20 Carbopol 974p 10-50 Quil A 0.1-10 胆固醇 0. 1-10 二甲基双十八烷基溴化铵（DDA) 0. 1-10 左旋咪唑 1-20 ; 所述Carbopol 974p的浓度为lOmg/ml;QuilA的浓度为60mg/ml;胆固醇的浓度为 30mg/ml;二甲基双十八烷基溴化铵的浓度为20mg/ml;左旋咪唑的浓度为20mg/ml。
3. 根据权利要求2所述的水性佐剂组合物： 组分 体积 Montanide GEL Ol 1-10 Carbopol 974p 15-30 Quil A1-5 胆固醇 1-5 二甲基双十八烷基溴化铵（DDA) 1-5 左旋咪唑 5-10。
4.根据权利要求2所述的水性佐剂组合物： 组分 体积 Montanide GEL 8 Carbopol 974p 11 Quil A 3 胆固醇 3 二甲基双十八烷基溴化铵（DDA) 3 左旋咪唑 7。
5.利用权利要求2所述的水性佐剂组合物制备疫苗的制备方法，包括： a)利用PH7. 2的PBS缓冲液，调整灭活病毒液病毒含量，制备病毒原液； b)将Carbopol 974p加入步骤a的组合物中充分混勾； c)将Montanide GEL Ol加入步骤b的组合物中充分混匀； d) 将二甲基双十八烷基溴化铵（DDA)加入步骤c的组合物中充分混匀； e)将QuilA加入步骤d的组合物中充分混匀； f) 将胆固醇加入步骤e的组合物中充分混匀； g) 将左旋咪唑加入步骤f的组合物中充分混匀； h) 将混合均匀的制剂，最后通过均质机处理，即得； 其中： 组分 体积 MontanideGEL01 0.2-20 Carbopol974p 10-50 QuilA 0.1-10 胆固醇 0. 1-10 二甲基双十八烷基溴化铵（DDA) 0. 1-10 左旋咪唑 1-20 ; 所述的Carbopol974p的浓度为lOmg/ml ;Quil A的浓度为60mg/ml ;胆固醇的浓度为30mg/ml ;二甲基双十八烷基溴化铵（DDA)的浓度为20mg/ml ;左旋咪唑的浓度为20mg/ml。
6. 权利要求1所述的水性佐剂组合物在制备猪圆环病毒灭活疫苗中的应用。
7. 权利要求1所述的水性佐剂组合物在制备猪圆环病毒2型灭活疫苗中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，所述的猪圆环病毒2型为猪圆环病毒2型-WH株，CCTCC NO:V201333。
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的水性佐剂及应用，本发明的佐剂组合物能够显著提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果，而且可激发机体产生长达150天的高效保护力。同时疫苗的配制工艺稳定，以及因疫苗免疫后引起的副反应小等均具有独特优势。该佐剂组合物制备工艺简单，不需要大型设备，成本低廉，且便于疫苗的规模化生产。
【IPC分类】A61K39-39, A61K39-12, A61P31-20
【公开号】CN104771754
【申请号】CN201510153978
【发明人】陈波, 周明光, 徐高原, 方雨林, 郝根喜, 曾爱星, 陈章表, 金建云
【申请人】武汉科前生物股份有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月2日