一种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒方法及获得的制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血浆制品领域，具体涉及ー种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒方 法及获得的制剂。
【背景技术】
[0002] 凝血酶原复合物（ProthrombinComplexConcentrate，PCC)，它含有凝血因子IX、II、x、及少量其他血浆蛋白。主要用于预防和治疗因凝血因子ii、w、ix及X缺乏导致的出 血，如乙型血友病、严重肝病及弥散性血管内凝血（DIC)等，还可用于逆转抗凝剂（如香豆 素类、茚满二酮等）诱导的出血，对已产生凝血因子W抑制性抗体的甲型血友病患者也有 作用。
[0003] 凝血酶原复合物是多种凝血因子组成的复合物，是ー种特殊的血液制品。由于 血液制品来源于人血浆，通常由多人份血浆混合后经特定分离纯化技术制备而成，理论上 经血液传播的疾病也可经血液制品传播，目前，常见的血液制剂携带并传播的病毒主要有 HBV、HCV、HIV和HTLV-1、CMV、EBV、HAV、细小病毒等。
[0004] 为了提高血液制品的安全性，根据相关指导原则要求，血液制品生产エ艺要具有 一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法，同时，全球 公认的有效的灭活病毒效果应该达到4.Olog以上，我国监管部门也严格要求干热处理工 艺灭活猪细小病毒PPV达到4.Olog以上。
[0005] 血液制品病毒灭活方法分为物理灭活方法和化学灭活方法，物理灭活方法通常有 巴氏消毒法、干热法、Y射线辐照法、短波紫外线法，化学方法通常有有机溶剤/去污剂（s/ D)处理法、低pH值孵放法、辛酸灭活法、光化学法。化学灭活方法仅对脂包膜病毒有较好的 效果，而对非脂包膜病毒的效果微乎其微，且化学灭活方法中需要添加ー种或多种生化试 齐U，其长期安全性还须验证。（宋清爽等，"血液制品病毒灭活及去除エ艺进展"，生物技木通 讯，2012年04期）。大多数生物制品大都采用真空冷冻干燥的方法制成终制品，干热灭活 法是较为可行的終端灭活方式。
[0006] 目前，干热灭活通常采用80°C处理72小时，或KKTC处理30分钟的エ艺。其中， 80°C处理72小时的干热灭活エ艺，成本高，各种凝血因子活性损失大；尽管KKTC处理30 分钟的干热灭活エ艺，成本虽低，但事实上病毒灭活效果却不佳，特别是难以有效灭活细小 病毒（如PPV)，Kim等报道100°C水浴30min处理，仅使PPV(猪细小病毒）的滴度下降了 I. 901og。项庆军等在"最終干热处理对凝血因子浓缩剂中非包膜病毒的作用"中报道，采 用90°CIOhr的干热灭活エ艺，对CPV(犬细小病毒）灭活仅2.Ilog(国外医学.预防.诊 断.治疗用生物制品分册，1995年06期）。
[0007] 另外，因凝血酶原复合物不稳定，分离纯化时，需在最終配制时加入保护剂，使产 品能耐受冻干及干热处理。目前，为了保证凝血酶原复合物的最終效价，需要同时加入多 种干热保护剂，成本也较高。若采用单一千热保护剂，则保护效果不佳，难以保证凝血酶原 复合物的效价，如，公开号=1524578的专利申请公开了ー种在凝血酶原复合物溶液中加入 精氨酸等作为干热保护剂的方法，其中，精氨酸的加入量可以为〇. 1%~5%，优选为0. 5% 和1%，且必须联合使用甘氨酸和或蔗糖，但是，申请人实际应用时，发现其对凝血酶原复合 物的保护效果并不理想，尤其是在同甘氨酸和或蔗糖配伍时，干热处理后制品颜色变黄，复 溶外观差，有蛋白絮状物析出，可见异物不合格，而且人凝血因子的活性回收率不高，尤其 是因子II、VII回收率不理想。申请人试验还发现采用80°C处理72h的方式，人凝血因子 IX的活性损失高达约20%，这ー结果与王益寿等研究结果一致（中国输血杂志1998年第 11卷第4期P195,人凝血酶原复合物的病毒灭活与验证）。所以，公开文献采用80°C处理 72h的方式难以保证本发明产品的效价回收率，而采用KKTC处理30min不能保证耐热非脂 包膜病毒（如PPV)的安全性（SantagostinoE.etal.，"TransmissionofParvovirus B19byCoagulationFactorConcentratesexposedto100DegreesしHeatAfter Lyophilization，，'Transfusion37 (5)，517 - 522(May1997)。
[0008] 改进凝血酶原复合物干热处理工艺，以确保灭活病毒效果达标，而且要保证理化 性质合格（特别是复溶外观，可见异物）和生物学活性（尤其是FIX和FII、FVII、FXI活性 回收率）、以及维持有效期内的稳定性是十分必要和迫切的。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种新的高效灭活凝血酶原复合物中细小病毒PPV的方法及获得 高度稳定的凝血酶原复合物制剂的制备方法，以及该方法制得的凝血酶原复合物制剂。
[0010] 申请人通过试验惊讶地发现，采用本发明80°C处理4h，再在KKTC处理30~ 60min的干热灭活方式，可以有效保证产品的外观和效价回收率，其中，80°C处理4h，再在 100°C处理30min的方式，效价回收率最高（97. 8% )，而80°C处理4h，再在KKTC处理60min 的方式，不仅有充分效保证凝血因子IX的效价回收率（97. 0 % )，还因灭活时间更长，确保 了耐热细小病毒（如PPV)可灭活大于41og以上，生产的产品安全性更高。本发明所制备 得到的人凝血酶原复合物具有良好的稳定性：2~8°C保存期长达36个月，按中国药典全检 合格。
[0011] 另外，本发明灭活方法较传统80°c72小时干热灭活方法，时间缩短90%以上。
[0012] 本发明凝血酶原复合物制剂的病毒灭活エ艺，步骤如下：取凝血酶原复合物制剂 冻干品，干热处理，其中，干热处理的方法是80°C处理2-10h，再在100°C处理30-60min。
[0013] 优选地，所述干热处理的方法是80°C处理4h，再在KKTC处理30~60min。
[0014] 进ー步优选地，所述干热处理的方法是80°C处理4h，再在100°C处理60min。
[0015] 本发明凝血酶原复合物制剂制备方法，它包括如下步骤：
[0016] (1)取血浆，分离纯化得到含凝血酶原复合物的溶液；
[0017] ⑵在步骤⑴所得溶液中，加入溶液2~4% (w/v)的精氨酸或其盐类，分装、冻 干，按照前述方法干热处理，即可。
[0018] 步骤（1)中，所述分离纯化方法为：用凝胶吸附血浆，洗脱，将洗脱液超滤，病毒灭 活，二次凝胶吸附，洗脱，即可。
[0019] 步骤（1)中，所述含凝血酶原复合物的溶液中，人凝血因子IX的活性不低于IOIU/ ml,人凝血因子II的活性不低于101U/ml、人凝血因子X的活性不低于101U/ml,人凝血因 子VII的活性不低于5IU/ml。
[0020] 步骤⑵中，所述精氨酸或其盐类的加入量为溶液的2. 4~4% (w/v)，进ー步优 选地为2. 4~2. 5 %，再进ー步优选为2. 4 %。
[0021] 所述精氨酸的盐类为盐酸精氨酸。
[0022] 本发明还提供了前述方法制备得到的凝血酶原复合物制剂。
[0023] 采用本发明病毒灭活方法，可以有效灭活耐热细小病毒，安全性高；同时，本发明 方法制得的凝血酶原复合物制剂稳定性好，2~8°C36个月全检合格，第II、W、IX、X凝血 因子无显著损失，且维持良好比例；本发明灭活方法较传统80°C72小时干热灭活方法，时 间缩短90%以上，生产成本显著降低。
[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0025] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进ー步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0026] 图1是制备本发明凝血酶复合物制剂的示意图。
【具体实施方式】
[0027] 实验材料：枸櫞酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸、