治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物的制作方法
【专利说明】治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物
[0001] 本申请是2007年3月8日递交的申请号为200780016834.X，发明名称为"治疗视 觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物"的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本专利申请要求2006年3月8日递交的美国临时专利申请系列号60/780905号 和2006年9月29日递交的美国临时专利申请系列号60/848274号的优先权，上述专利通 过引证在此全部并入本文。 发明领域
[0004] 本发明通常涉及核酸领域，更特别地为可以结合补体系统的蛋白质的适体，用于 补体-相关眼，心，炎症，哮喘，和自身免疫失调，缺血再灌注损伤和/或其他C5介导的补体 活性相关的疾病或失调的治疗和诊断。优选实施方案中，本发明更特定涉及治疗和诊断眼 部失调的方法和材料，包括但不局限于，治疗和诊断C5介导的失调如C5介导的眼部失调。 本发明进一步涉及施用可以结合包括C5蛋白的补体系统蛋白的适体的材料和方法。
[0005] 发明背景
[0006] 定义的适体是一种分离的核酸分子，其通过不同于Watson-Crick碱基对的交互 作用以高特异性和亲和性结合一些目标，如ー种蛋白质。虽然适体是核酸分子，在适体和其 他核酸分子如基因和mRNA之间仍有基本的不同。后者中，核酸结构通过其线性碱基序列编 码信息，该序列对于信息存储功能是重要的。与之相反的，适体的功能，其基干与目标分子 的特定结合，不依赖于保守的线性碱基序列，而更关注特定的二級/和三级结构。适体是 非-编码序列。适体的任何潜在编码能力完全是巧合，并在合体与其同源目标的结合中是 无作用的。这样，结合相同目标，甚至目标上的相同位点的适体，可以具有相同的碱基序列， 更多情况下是不同的。
[0007] 适体也与自然产生的结合特定蛋白质的核酸序列不同。这些后者序列是整合在生 物体基因组中的自然发生的序列，其与涉及自然核酸的转录，翻译和转运的蛋白质的特定 亚基结合，例如，核酸结合蛋白。另ー方面，适体是短小的，分离的，非自然产生的核酸分子。 虽然适体具有与结合核酸的蛋白结合的特征，许多情况下这些适体具有较少的或没有与可 被自然核酸结合蛋白识别的序列一致的序列。更重要的，适体事实上可以结合任何蛋白质 (不仅仅是核酸结合蛋白）以及包括小分子，碳水化合物，多肽等的任何针对的目标。对于 大多数目标，甚至蛋白质，并不存在其结合的自然产生的核酸序列；对于那些具有此序列的 目标，例如，核酸结合蛋白，这些序列与适体不同，与高亲和カ适体相比，其在自然状态的结 合亲和カ相对较低。
[0008] 适体，与噬菌体显示或抗体所产生的多肽类似，可以特异结合选定的目标并调整 目标活性或结合力，例如，通过结合适体可以阻抑其目标功能的能力。在抗体存在吋，特定 结合目标的功能特性是ー种固有特性。在抗体存在时，虽然技术人员可以不知道一种适体 对于ー个目标的精确结构特性，技术人员知道在缺失精确结构定义的情况下怎样鉴定，制 备和使用这些分子。
[0009] 适体也与小分子治疗剂类似，其単一结构的改变，似乎非常微小，也可以极大影响 (数个级别或量级）适体的结合和/或其他活性。另ー方面，一些结构改变将少有或没有效 果。这些结果来自于适体结构的二級/三级的重要性。换而言之，适体是ー种具有固定构 造的三维结构，提供与其给定目标结合的化学结合力。因此：（1) ー些区域或特定序列对于 (a)结合目标的特定点，和/或（b)定位分子与目标的结合的序列是必需的；（2) -些区域 或特定序列具有变异范围，例如，核苷X必须是嘧啶，或核苷Y必须是嘌呤，或核苷X和Y必 须互补；和（3) -些区域或特定序列可以是任意的，其可以是充分的间隔元素，例如，其可 以使任何给定长度的核苷链或甚至非-核苷间隔，如PEG分子。
[0010] 任意寡核苷酸序列集合的体外选择试验发现，产生的适体针对超过130种蛋白 质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋白，和受体。典型的适体为10_15kDa大小（20-45 个核苷），以微毫摩尔至亚-微毫摩尔亲和カ结合其目标，并区分紧密相关的目标（例如，适 体可以典型地不与来自同一基因家族的蛋白质结合）。一系列的结构研究已经显示适体可 以使用相同的集合交互型（例如，氢键，静电互补，疏水作用，空间排阻）驱动抗体-抗原复 合物的亲和カ和特异性。
[0011] 适体具有许多期望的用于治疗和诊断的特性，包括高特异性和亲和力，生物功效， 和良好的药代动力学特性。此外，其提供了优于抗体和其他蛋白生物制剂的特定竞争优勢， 例如：
[0012] 1)速度和控制。适体完全由体外方法制备，可以进行提前量的快速准备，包括治疗 提前量。体外选择使得适体的特异性和亲和カ是高度受控的并制备引导，包括针对毒素和 非-免疫原目标的引导。
[0013] 2)毒性和免疫原性。适体作为ー种类型，具有显著的治疗可接受毒性并缺少免疫 原性。然而许多单克隆抗体的效果可被其抗体自身的免疫反应限制，而激发适体的抗体是 非常困难的，主要因为适体不能通过MHC被T-细胞表达，而免疫应答通常被驯化为对核酸 片段无识别。
[0014] 3)给药。许多目前提供的抗体治疗剂通过静脉灌输给药（通常超过2-4小吋），而 适体可以通过皮下注射给药（适体通过皮下给药的生物利用率在猴子试验研究中> 80% (Tucker等，J.ChromatographyB.732:203_212，1999))。此区别主要由于治疗性mAbs相 当低的可溶性从而需要的体积较大。具有良好溶解性（> 150mg/mL)和相对更低的分子量 (适体：10-50kDa;抗体：150kDa)，适体的周使用剂量可以以小于0. 5mL的体积注射输送。 此外，另ー个适体-基础的治疗或预防优点为，适体的较小体积可以使其滲透入紧缩构想 区域，而抗体或抗体片段无法滲透入。
[0015] 4)可度量性和价格。治疗适体是化学合成的因此可以容易地根据生产需求度量。 而对生产的度量的困难性限制了ー些生物制剂的实用性，并且高-通量蛋白质制备设备的 费用也是巨大的，而ー个高-通量寡核苷酸合成系统的产量至少为IOOkg/年，并且只需要 相对适度的初始投资。目前千克级的适体合成的费用估计为500美元/克，与高度优化的 抗体具有可比性。研究过程中的不断进步可以预计在5年内费用将降低至低于100美元/ 克。
[0016] 5)稳定性。治疗性适体是化学稳健的。其在暴露于各种因子如热和变性剂时能固 有地保持活性，并且以冻干粉末在室温下能保存相当长时间（>1年）。相反，抗体必须冰 冻保存。
[0017] 补体系统。补体系统包括ー组至少为20-30胞质和膜蛋白，其在受调控的级联系 统中共同作用以攻击细胞外的病原体形式（例如，细菌）。补体系统包括三个不同的酶活性 级联，经典，凝集素和选择性路径（图1)，其集合了C5的活性并产生已知为膜攻击途径的 非-酶途径。
[0018] 第一种酶活性级联，其已知为经典途径，包括几种成分，Cl,C4,C2,C3和C5(以途 径中的顺序排列）。随着第一种补体成分（Cl)通过免疫和非-免疫活性因子而结合和激 活，补体系统的经典途径的开始发生。Cl包括ー个Clq，Clr和Cls的钙-依赖复合物，并 且通过结合Clq成分而激活。Clq包括六个相同的亚基，并且每个亚基包括三条链（A，B和 C链）。每个链具有一个连接胶原质-类似物尾部的球状头部。抗原-抗体复合物对于Clq 的结合和激活发生在Clq的头部区域。大量的非-抗体Clq激活物质，包括蛋白质，脂质和 核酸，通过胶原-类似颈部区域的独特位点结合和激活Clq。通过Clq的补体激活剂的分子 识别引发了构象改变，刺激酶原Clr自身激活，其反过来促进Cls的蛋白水解。Cs随后催化 补体成分C4和C2的活性，形成具C3转化酶功能的C4bC2a复合物。
[0019] 第二个已知为凝集素途径酶活化级联，除了MBL/MASP-2复合物取代Cl之外，都与 第一个类似。甘露聚糖-結合凝集素（MBL)直接识别细菌表面的含有甘露糖的多糖，并在结 构和功能上与Cl的成分Clq同源。MBL与激活剂的结合引导了MBL-相关蛋白酶2 (MASP-2) 的活性。MASP-2,反过来以Cls功能同源的方式激活C4和C2,引导C3转化酶的形成。
[0020] 第三种酶活性级联，已知为选择性途径，是ー种快速的，抗体-不依赖的补体系统 激活和方法途径。选择性途径包括几种成分，C3,因子B，和因子D(以途径中的顺序排列）。 选择性途径的激活发生于C3b，ー种C3的水解裂解形式，与活性表面如细菌的结合时。因子 B随后与C3b结合，并被因子D切割形成C3转化酶C3bBb。当产生和沉积额外的C3b时发 生C3转化酶活性的放大。阳性调节蛋白备解素（P)的结合进一步促进放大反应，其提高活 化转化酶的降解稳定性，使半衰期从1-2分钟延长至18分钟。
[0021] 这样，所有三个途径都产生裂解因子C3为C3a和C3b的C3转化酶。这时，C3转 化酶