抗edta的s100a12c复合物(erac)的制作方法

专利名称：抗edta的s100a12c复合物(erac)的制作方法
抗 EDTA 的 S100A12C 复合物(ERAC)本申请是2007年10月19日提交的美国临时申请No. 60/999，653的正式申请，在 此将其全部纳入作为参考。将该申请或本申请中引用的所有专利和非专利参考文献也全部都纳入作为参考。 发明领域本发明涉及在人生物材料中发现的可用于诊断和其他目的的新型蛋白复合物。
背景技术：
人类白血细胞含有许多不同的蛋白质，这些蛋白质对他们的生理功能是很重要 的，例如微生物、肿瘤细胞或异物的杀灭或清除；死组织的退化和消除；补充更多白细胞至 病变的位点；炎症的上调或下调。在白细胞，如中性粒细胞或单核细胞的活化期间，它们会 吞噬(吞食)外来细胞或物质，并将效应蛋白释放到组织和体液。结果，会在体液或分泌 物，如血液、脑脊髓液、滑液、牙龈液、鼻和支气管分泌物、唾液、尿液或粪便中发现白细胞产 生的蛋白质的浓度增大。化验来自这些材料中的白细胞的物质是许多不同患者群体中常规 诊断程序的一部分。除了显示病状确实存在之外，某些标记的水平升高可能特异性针对某 些疾病和病理过程的类型。属于蛋白质SlOO家族的蛋白质已经对该特定领域作出贡献。具体地，钙卫蛋白是 S100A8和S100A9的异源三聚体，已经被广泛应用(Johne B & al. Mol Pathol. 1997 Jun ； 50(3) :113-23)。近年来，对S100A12(以下缩写为A12)也报道了一些引人注意的发现。例 如，在患有炎性肠病(Foell D &al.，Gut 2003 ；52 :847_853)和风湿性关节炎(Foell D & al.，Arthritis &Rheumatism 2004 ；50 1286-1295)的患者血清中以及在患有炎性肠病的 患者的粪便样品中(Kaiser T & al.，2007，Gut. 2007 Aug 3)会发现这种蛋白的浓度增加。发明概述在本发明的一个方面，提供了一种用于检测样品中ERAC存在的试剂盒(成套试 剂)，其中该样品的二价金属离子已被除去，所述试剂盒包括i)固体载体，ii)与该固体载体结合的第一目标物，当与该固体载体接触的样品中存在ERAC 时，所述目标物能够直接检测ERACJPiii)至少一种标记(物)。在本发明的一种实施方式中，该试剂盒进一步包括载体分子，优选地为聚合物载 体分子。本发明的聚合物载体分子优选地包括反应官能团，其数量为约5至约5，000微摩 尔每克聚合物载体。在另一种实施方式中，本发明的例如包含葡聚糖链的聚合物载体分子，包括小于 约400种标记物，优选地为视觉可检测的目标物或荧光可检测的标记物的形式，如小于380 种标记物，如小于360种标记物，如小于340种标记物，如小于320种标记物，如小于300种 标记物，如小于280种标记物，如小于260种标记物，如小于240种标记物，如小于220种标 记物，如小于200种标记物，如小于180种标记物，如小于160种标记物，如小于140种标记物，如小于120种标记物，如小于100种标记物，如小于80种标记物，如小于70种标记物， 如小于60种标记物，如小于50种标记物，如小于40种标记物，如小于30种标记物，如小于 25种标记物，如小于20种标记物，如小于15种标记物，如小于12种标记物，如小于10种标 记物，如小于8种标记物，如小于4种标记物，如小于3种标记物，如小于2种标记物。聚合的葡聚糖链的分子量可以是约500，OOODa，但约100，OOODa至约900，OOODa的 分子量也可以使用。在一种实施方式中，每条葡聚糖链包括约2，700个葡萄糖单位，其中20-22%被活 化，优选地用二乙烯磺酰基激活，然而如本文以下详细描述，也可使用其他连接基团。合适的聚合物载体可以是带有以下官能团的聚合物载体，例如0_(例如去质子酚羟基，如多肽或蛋白质的酪氨酸残基中的去质子芳香族羟基)S_(例如芳香环或脂肪族基团上的去质子巯基，如多肽或蛋白质的半胱氨酸残基 中的去质子巯基)，OH(例如糖环上的脂肪族羟基，如寡糖或多糖中的葡萄糖或其他单糖环；或多元 醇中的醇羟基，如聚乙二醇；或多肽或蛋白质的某些氨基酸残基中的羟基，如丝氨酸或苏氨 酸)，SH(例如多肽或蛋白质的半胱氨酸残基中的巯基)，伯胺基(例如，在多肽或蛋白 质的赖氨酸或鸟氨酸残基中；或某些多糖或其衍生物(如壳聚糖)的氨基替代的糖环中) 或仲胺基(例如，在多糖或蛋白质的组氨酸残基中)。因此，在本发明上下文中，分子种类中讨论的官能团通常也是亲核功能，例如上述 类型之一的亲核功能。在一种实施方式中，每个葡聚糖链中约600个连接基团(moiety)的约一半，优选 但不限于二乙烯磺酸基，与目标物和标记物反应。例如目标物为抗体，如优选地为抗-ERAC 单克隆抗体，标记物为本发明的说明书中以下描述的标记，并且这规定每个葡聚糖链小于 约400种标记物。然而，很明显的是，这600个连接基团的约一半以上都可能与标记物反应， 因此标记物的数目可能高于约400。本发明的单个聚合物载体分子中的标记物和目标物的数目影响根据本发明可以 检测的ERAC的最小量。在一种实施方式中，通过本发明的试剂盒或方法可检测的ERAC的最小量为小于 1000纳克每毫升样品，如小于900纳克每毫升，如小于800纳克每毫升，如小于700纳克每 毫升，如小于600纳克每毫升，如小于500纳克每毫升，如小于400纳克每毫升，如小于300 纳克每毫升，如小于200纳克每毫升，如小于100纳克每毫升，如小于95纳克每毫升，如小 于90纳克每毫升，如小于85纳克每毫升，如小于70纳克每毫升，如小于75纳克每毫升，如 小于70纳克每毫升，如小于65纳克每毫升，如小于60纳克每毫升，如小于55纳克每毫升， 如小于50纳克每毫升，如小于45纳克每毫升，如小于40纳克每毫升，如小于35纳克每毫 升，如小于30纳克每毫升，如小于25纳克每毫升，如小于20纳克每毫升，如小于15纳克每 毫升，如小于10纳克每毫升，如小于5纳克每毫升，如小于1纳克每毫升，如小于0. 5纳克 每毫升，如小于0. 1纳克每毫升，如小于0. 05纳克每毫升，如小于0. 01纳克每毫升，如小于 0. 005纳克每毫升，如小于0. 001纳克每毫升样品。在另一方面，提供一种制备本发明的试剂盒的方法，所述方法包括步骤
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i)提供固体载体，ii)将标记的第一目标物添加到所述固体载体的结合区，当与该固体载体接触的 样品中存在ERAC时，所述目标物能够直接检测ERAC，并且iii)将非标记的第一目标物添加到所述固体载体的测试区。在另一方面，提供本发明的试剂盒在用于检测或定量样品中的ERAC的用途。在进一步方面，提供一种用于检测ERAC的方法，包括步骤i)提供样品，ii)从所述样品中除去二价金属离子，由此减少或消除样品中游离二价金属离子 的量，iii)提供标记的第一标记物，其能够直接检测所述样品中存在的ERAC，iv)使所述处理的样品与所述标记的第一目标物接触，并且ν)检测与所述标记的第一目标物结合的ERAC的存在。在本发明的一种实施方式中，用于检测ERAC的方法产生阳性或阴性结果。可预先 确定ERAC检测的较低临界水平，以便为该方法的阳性结果设定下限。在本发明的一种实施方式中，检测的ERAC具有的分子量基本上与包括相同数目 单体单位的天然S100A12低聚体的分子量一致。在另一种实施方式中，当与包括相同数目 单体单位的天然S100A12低聚体比较时，检测的ERAC具有异常的分子量。通过本发明的 试剂盒或方法检测的ERAC的分子重量，与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体 相比可能小于50%，或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比小于60 %， 或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比小于70 %，或者与包括相同数 目单体单位的天然S100A12低聚体相比小于80 %，或者与包括相同数目单体单位的天然 S100A12低聚体相比小于90%，或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比 至少为110%，或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比至少为120%， 或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比至少为130%，或者与包括相同 数目单体单位的天然S100A12低聚体相比至少为140 %，或者与包括相同数目单体单位的 天然S100A12低聚体相比至少为150 %，或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低 聚体相比至少为200 %，或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比至少为 250%，或者与包括相同数目单体单位的天然S100A12低聚体相比至少为500%。用本发明的试剂盒或方法检测的ERAC可以是包括2个单体单位的二聚体，包括3 个单体单位的三聚体，包括4个单体单位的四聚体低聚体，包括5个单体单位的五聚体低聚 体，包括6个单体单位的六聚体低聚体，包括7个单体单位的七聚体低聚体，包括8个单体 单位的八聚体低聚体，包括9个单体单位的九聚体低聚体，包括10个单体单位的十聚体低 聚体。检测的ERAC可包括许多单体单位，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20个，或20个以上的单体单位。用本发明的试剂盒或方法检测的ERAC的分子量可在500-21 OOkDa范围内，例 如 500-1000kDa 或 750_1500kDa，或 1000-2100kDa,例如在 500_700kDa 范围内，如在 550-600kDa范围内，如在600_650kDa范围内，例如在650_700kDa范围内，或者例如在 700-900kDa 范围内，如在 700_750kDa 范围，如在 750_800kDa 范围内，如在 800_850kDa 范围内，如在850-900kDa范围内，或者例如在900—1 IOOkDa范围内，如在900_950kDa范
13围内，如在950-1000kDa范围内，如在1000_1050kDa范围内，如在1050-1 IOOkDa范围 内，或者例如在1100-1300kDa范围，如在1100_1150kDa范围内，如1150_1200kDa范围 内，如1200-1250kDa范围内，如1250_1300kDa范围内，或者例如在1300_1500kDa范围 内，如1300-1350kDa范围内，如在1350_1400kDa范围内，如1400_1450kDa范围内，如在 1450-1500kDa范围内，或者例如在1500_1700kDa范围内，如在1500_1550kDa范围内，如 在1550-1600kDa范围内，如在1600_1650kDa范围内，如在1650_1700kDa范围内，或者 例如在1700-1900kDa范围内，如在1700_1750kDa范围内，如在1750_1800kDa范围内， 如在1800-1850kDa范围内，如在1850_1900kDa范围内，或者例如在1900_2100kDa范围 内，如在1900-1950kDa范围内，如1950_2000kDa范围内，如在2000_2050kDa范围内，如 2050-2100kDa 范围内。在另一个方面，提供一种用于定量样品中存在的ERAC的量的方法，所述方法包括 步骤i)提供本发明的试剂盒，ii)提供样品，iii)使所述样品与所述试剂盒接触，iv)检测所述样品中ERAC的存在，以及ν)定量在所述样品中检测的ERAC的量。在另一个方面，提供一种用于定量样品中存在的ERAC的量的方法，所述方法包括 步骤i)执行本发明用于检测ERAC的方法，和ii)定量与所述标记的第一目标物结合的ERAC的量。在另一个方面，提供一种用于分析样品或个体的方法，所述方法包括步骤i)根据本发明检测样品中ERAC的存在，或根据本发明定量样品中ERAC的量，和
ii)定性地或定量地检测所述样品中至少一个其他免疫标记的存在。优选地，所述其他免疫标记是蛋白质SlOO家族中的一员。更优选地，所述其他 免疫标记选自蛋白质 S100AU S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、 S100A9、S100A10、S100A11、S100A13、S100A14、S100A15 和 S100A16。优选地，所述其他免疫标记是钙卫蛋白。对SlOO蛋白家族的成员已有进一步描述，例如在Heizmann Cff, Ackermann GE, Galichet A "‘Pathologies involving the SlOO proteins and RAGE，，，Subcell Biochem. 2007 ；45 93-138 禾口 Marenholz I，Heizmann Cff, Fritz G :“S100proteins in mouse and man :from evolution to function and pathology(including anupdate of the nomenclature) Biochem Biophys Res Commun,2004 Octl ；322(4) :1111_22 中。在另一个方面，提供一种用于监测样品中ERAC的存在的方法，所述方法包括步 骤i)根据本发明检测体液样品中ERAC的存在，或者根据本发明定量样品中ERAC的 量，和ii)可选地，以预定的时间间隔，重复步骤(i)。ERAC的监测优选地是以定期间隔进行，例如每隔几秒、几分、几小时、几周或几个月、或几年。优选地监测是每年进行，如一年2次、如一年3次、如一年4次、如一年5次、如 一年6次、如一年7次、如一年8次、如一年9次、如一年10次、如一年11次、如一年12次， 例如每月进行，如每月2次、每月3次、每月4次，例如每周进行，如每周2次、如每周3次、 如每周4次、如每周5次、如每周6次、如每周7次，如每天进行，如每天2次、如每天3次、 如每天4次、如每天5次、如每天6次、如每天7次、如每天8次、如每天9次、如每天10次、 如每天11次、如每天12次、如每天13次、如每天14次、如每天15次、如每天16次、如每天 17次、如每天18次、如每天19次、如每天20次、如每天21次、如每天22次、如每天23次、 如每天24次，如每小时进行，如每小时2次、如每小时3次、如每小时4次、如每小时5次、 如每小时6次、如每小时7次、如每小时8次、如每小时9次、如每小时10次，如每分钟，如 每30秒。监测可以由非医学培训或非医学资格的人执行，可选择地在离开医院的地方，例 如在人们自己的家里或在任何其他地方。本发明的优点在于，本发明的方法，包括本发明的 监测不需要通过医学培训或有医学资格的人员协助即可进行。本发明的进一步的优点在 于，本发明的方法，例如本发明的监测，可以在任意地点进行，例如医院以外的地方。在另一方面，提供一种用于诊断临床情况的方法，所述方法包括步骤i)根据本发明检测样品中ERAC的存在，或者根据本发明定量样品中ERAC的量，或 者根据本发明分析，或根据本发明监测ERAC的存在，和ii)诊断所述临床情况。在另一方面，提供一种用于预测个体中临床情况的后果或发展或复发或缓解或进 展的方法，所述方法包括步骤i)根据本发明检测样品中ERAC的存在，或者根据本发明定量样品中ERAC的量，或 者根据本发明分析，或根据本发明监测ERAC的存在，和ii)确定所述个体的预测情况。在另一方面，提供一种用于治疗临床情况的方法，所述方法包括步骤i)在需要的个体中，减少所述个体的体液中存在的ERAC的量。在另一方面，提供一种用于治疗临床情况的方法，所述方法包括步骤i)在需要的个体中，施予能够与ERAC竞争结合到受体的化合物。优选地，所述受体是ERAC与之结合的受体，更优选地，所述受体是高级糖基化终 产物(RAGE)受体。在另一方面，提供一种用于治疗临床情况的方法，所述方法包括步骤i)根据本发明监测ERAC的存在，和ii)根据本发明治疗该临床情况。在另一方面，提供一种用于治疗临床情况的方法，所述方法包括步骤i)进行与ERAC相关的临床情况的诊断，和ii)根据本发明治疗所述临床情况。在另一方面，提供一种用于治疗临床情况的方法，所述方法包括步骤iii)根据本发明进行病情的预测，和iv)根据本发明治疗该临床情况。在另一方面，本发明提供一种治疗方法，其中所述方法与所述临床情况的治疗相
15结合，包括施予抗炎剂。本发明的临床情况可以是慢性或急性炎症性情况，自身免疫疾病， 癌症，肾脏疾病或机能失常，心血管疾病或感染。临床情况可选自传染性疾病放射菌病、腺病毒感染、炭疽病、细菌性痢疾、肉毒梭 菌中毒、由B. melitensis和B. suis引起的布鲁氏杆菌病(班氏病)、念珠菌症、蜂窝组织 炎、软性下疳、霍乱、球孢子菌病、急性无热结膜炎、膀胱炎、皮肤真菌病、细菌性心内膜炎、 会厌炎、丹毒、类丹毒、肠胃炎、生殖器疱疹、腺病(Glandulae)、淋病、肝炎、病毒性肝炎、组 织胞浆菌病、脓疱病、疟疾、单核白血球增多症、流行性感冒、军团病、细螺旋体病、莱姆病、 类鼻疽病、髓膜炎、诺卡菌病、星形诺卡氏菌、非淋菌性尿道炎、品他病、肺炎球菌肺疾病、脊 髓灰质炎、原发性肺部感染、伪膜性肠炎、与抗生素有关的产后败血症、狂犬病、回归热、风 湿热、洛基山斑疹热、风疹、麻疹、葡萄球菌性烫伤样皮肤综合症、链球菌性咽炎(链球菌性 喉炎)、梅毒、破伤风、中毒性休克综合症、弓形体病、肺结核、兔热病、伤寒症、斑疹伤寒症、 阴道炎、水痘、疣、百日咳、印度痘(雅司病)和黄热病。临床情况可选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性咽炎、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、 移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、炎性肠病、炎性肌病、盆腔炎性疾病、子痫前症、 再灌注损伤、风湿性关节炎、干燥症、移植排异和脉管炎。临床情况可选自动脉瘤、心绞痛、动脉粥样硬化、脑溢血、脑血管疾病、充血性心力 衰竭、冠状动脉疾病、高血压、心肌梗死、稳定型心绞痛、中风和不稳定型心绞痛。在本发明的一个方面，临床情况可优选地为风湿性关节炎。在另一方面，临床情况 可优选地为干燥症。在再一方面，临床症状可优选地为子痫前症。在另一方面，提供了一种计算机可读介质，包括对实施本发明的定量方法的说明 书。在另一方面，提供一种适用于实施本发明的定量方法的自动化系统，包括联合i)能够包括多个数字图像的数据库，ii)软件模块，用于从数字图像中分析多个像素，iii)控制模块，包括对实施本发明定量ERAC的方法的指令。在另一方面，提供一种可加载到计算机内存中的软件程序，所述程序包括对实施 本发明定量ERAC的方法的指令。在另一种实施方式中，本发明包括在不测量天然S100A12的情况下对ERAC的测 量。在一种实施方式中，本发明仅针对ERAC的检测，因此本发明不包括天然S100A12低聚 物的检测，当用EDTA处理时，天然S100A12低聚物分解。本发明公开了一种包括多个S100A12单体或低聚体的多肽复合物，其中S100A12 的单体具有的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示TKLEEHLEGIVNIFHQYSVR KGHFDTLSKGELKQLLTKELANTIKNIKDKAVIDEIFQGL DANQDEQVDFQEFISLVAIALKAAHYHTHKE,或者与SEQ ID NO 1基本相同。本发明还针对用于制备或使用本发明的多肽复合物的方法。定义本文各处使用的术语“一”、“一个”或“该”是指一个或多个，即至少一个。
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抗体本文使用的术语“抗体”意思是分离的或重组的结合剂，其包括必要的可变 区序列，以特异性地结合抗原表位。因此，抗体是显示所需要的生物活性的任意形式的抗体 或其片段，例如，结合特定的目标抗原。抗体可以来源于多个物种。例如，抗体包括啮齿类动 物(例如小鼠和大鼠)，兔，羊，骆驼和人类抗体。抗体还可以包括嵌合抗体，其接合了一个 物种的可变区与另一物种的恒定区。类似地，抗体可以是人源化的，该抗体通过重组DNA技 术构建以产生免疫球蛋白，其使来自一种物种的人框架区与另一物种的免疫球蛋白的互补 决定区(CDR)相结合。该抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以分为同型物(IgA、IgG、 IgM、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2)。抗体在另一种实施方式中，术语“抗体”指完整抗体或与完整抗体竞争抗原结合 的抗体的片段。在某些实施方式中，抗体片段通过重组DNA技术而产生。在某些实施方式 中，抗体片段通过完整抗体的酶或化学裂解而产生。示范性的抗体片段包括但不限于Fab、 Fab'、F(ab' )2、Fv和scFv。示范性的抗体片段还包括但不限于域抗体，纳米抗体，微型 抗体((SCFV-Ch3)2)，巨型抗体((SCFV-CH2-Ch3) 2)，双体(scFv的非共价二聚体)。抗体片段抗体片段是抗体的一部分，如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab等。不管 结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的相同抗原结合。例如，抗_(本发明的多肽)单克 隆抗体片段结合本发明的多肽的表位。术语“抗体片段”还包括与特异性抗原结合的合成 的或基因工程的多肽，如轻链可变区构成的多肽。“Fv”片段是由重链和轻链可变区构成的 重组单链多肽分子，其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接，并且最小识 别单位由模拟高可变区的氨基酸残基构成。生物荧光本文使用的生物荧光是由于化学反应过程中化学能转化为光能，产生 的活有机物的光的产生和发射。化学发光本文使用的化学发光是化学反应产生的未发射热的光(冷光)发射。嵌合抗体“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其包括来源于啮齿类动物抗体的可变域 和互补决定区，而该抗体分子的余下部分来源于人抗体。发色团本文使用的发色团是可见的有色分子的一部分，由于一个波长范围的光 吸收，由此产生了颜色。推而广之，该术语可适用于分子的Uv或ir吸收部分。共价结合本文使用的术语共价结合是描述化学结合的形式，其特征是共享原子 之间的电子对。当原子共享电子时，原子之间形成的吸引-排斥稳定性被称作共价结合。诊断通过评估来识别或确定疾病或损伤的性质和原因的行为或过程。可检测的标记可检测的标记是一种分子或原子，其可以与抗体基团(moiety)偶 联以产生对诊断有用的分子。可检测的标记的实例包括螯合剂，光活性剂，放射性同位素， 荧光剂，顺磁离子或其他标记基团。发射荧光本文使用的术语“发射荧光”是指当被另一波长的光激发时，具有发射 一定波长的光的能力。荧色物本文使用的“荧色物”是用荧光标记物来标记例如蛋白时，作为染料使用 的任意荧光化合物。荧光团本文使用的“荧光团”是引起分子发出荧光的分子的组成部分。人源化抗体“人源化抗体”是重组蛋白，其中鼠科动物单克隆抗体的互补决定区 已经从鼠科动物免疫球蛋白的重和轻可变链转移到人可变域。
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标记物本文的标记物是与标记分子互换使用。本文描述的标记物是一种可识别 的物质，其在分析中是可检测出的并且可连接到分子上产生标记分子。然后可研究该标记 分子的行为。标记本文的标记是指将标记物连接到分子上。单克隆抗体本文使用的单克隆抗体是相同的抗体，因为它们是由一种类型的免 疫细胞产生，并且都是单一亲本细胞的克隆体。单价抗体本发明的抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域众 所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链与修饰的重链的重组表达。该重链通常在 Fc区的任意点上被截断，以防止重链交联。或者，可将相关的半胱氨酸残基用另一种氨基酸 残基替代或者将其删除，以防止交联。体外方法还适用于制备单价抗体。消化抗体以产生 其片段，尤其是Fab片段，可利用本领域已知的常规技术来完成。低聚体低聚体是由有限数量的重复结构单位构成的化合物，即通常2-20个单 体，通过共价化学键连接。例如，低聚体可由通过一个或多个共价化学键连接的两个单体构 成。肽或蛋白质由至少两个氨基酸组成的任意分子。肽通常指高至约30个氨基酸的 较小分子，而蛋白质指包含更多氨基酸的较大分子。多克隆抗体本文使用的多克隆抗体是来源于不同B细胞系的抗体。它们是针对 特异性抗原分泌的免疫球蛋白分子的混合物，每个识别不同的表位。聚合物本文使用的聚合物定义为由任意数量的重复结构单位或单体，通过共价 化学键连接而成的化合物。多肽多肽是由不同α -氨基酸以确定的顺序连接形成的短分子家族。一个氨基 酸残基与下一个之间的连接物是酰胺键，而有时称为肽键。较长的肽称作蛋白质或多肽。预测病情术语“预测病情”通常指个体的临床情况期间的预测，例如对患者治疗 的看法。优选地，预测病情可旨在确定个体中可能或可能出现的临床情况的后果或进展或 发展或复发或缓解。放射性放射性衰变是不稳定的原子核通过以粒子或电磁波的形式放射射线，而 损失能量的过程。样品本说明书全文中，“样品”一词与“样本”一词可交换使用。标准标准是用已知浓度的待检测物质，对样品一次或多次测量结果进行说明。该 标准可以是标准曲线的形式。标准曲线是对不同的已知浓度的待检测物质的多次测量。标 准曲线通常表示为曲线图或图解或图表。在横向流动装置上，标准可以是许多点或带或线 或区域的形式，包含与标记的目标物结合的、不同已知浓度的待检测物质。例如，该标准可 以是多个线的形式，包括与标记的第一目标物相结合的不同已知浓度的ERAC。例如，该标准 可用于将未知浓度的样品的测量值与显示的不同标准线进行比较，从而确定样品中所测物 质的近似浓度。本发明的标准，如标准曲线，还可以是数字或数字可读的形式，例如条码或 晶片的形式。例如，标准或标准曲线可作为条码出现在本发明的试剂盒上。处理处理可以几种不同的方式执行，包括治疗，改善和预防。治疗处理通常目的 在于治疗在处理的个体中已经存在的临床情况，如疾病或感染。改善处理通常是指为了改 善个体中已有的临床情况的处理。预防处理通常旨在预防一种临床情况。


图 1 显示 Pharamcia，Sweden 的 High Load Superdex-75 柱上的 GPC 实验的结果。 柱子尺寸为1.6x60cm。缓冲液是tris-缓冲盐水，2mM氯化钙，pH 8.0。样品是0.3ml正常 人血清。流速为lml/min。图 2 显示 Pharamcia，Sweden 的 High Load Superdex-75 柱上的 GPC 实验结果。 柱子尺寸为1. 6x60cm。缓冲液是带有5mM EDTA的tris-缓冲盐水。样品是0. 3ml正常人 血清。流速为lml/min。图 3 显示 Pharamcia，Sweden 的 High Load Superdex-75 柱上的 GPC 实验结果。 柱子尺寸为1. 6x60cm。缓冲液是带有5mM EDTA的tris-缓冲盐水，pH 8. 0。样品是0. 3ml 风湿性关节炎患者血清。流速为lml/min。图4显示以分阶氯化钠梯度进行的DEAE阴离子交换色谱实验的结果。样品为 0. 3ml人风湿性关节炎患者血清。柱子为DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow (Pharmacia, Sweden)， 尺寸12x18mm。缓冲液为25匪巴比妥钠，pH8. 8。样品是0. 3ml风湿性关节炎患者血清，含 有一些ERAC，但大多数为正常S100A12。用200mM氯化钠稀释的S100A12代表ERAC。图5显示S100A12 ELISA的典型标准曲线，X-轴为浓度，Y"轴为光密度(OD)。S 6图6为显示本发明试剂盒的一种实施方式的图片，是横向流动装置的形式。所有 四个横向流动装置适用于测量样品中的ERAC。应用于四个不同的横向流动装置的样品如下 表所示。
非EDTA处理的ERAC阳性样品非EDTA处理的ERAC阴性样品EDTA处理的ERAC的阳性样品EDTA处理的ERAC的阴性样品正如图6中可以看到的，当样品用EDTA处理时，只有包含ERAC的样品(ERAC阳 性样品)产生阳性测试结果，即在测试区(“T”)有清楚的线条。在所有情况下，对照区 (“C”)都是阳性的，当使用带有对照区的横向流动装置时始终如此。横向流动装置的应用 区可以被看作朝向测试区右边的圆形开口。这是将样品加到该装置的地方。S 7图7显示样品中ERAC定量测量的图表。例如，上述ERAC横向流动测试的测试线 的染色强度可以通过光度测量仪器来确定。图7显示扫描LFT测试条时的典型扫描曲线。 如同所示的那样，不管蛋白质的浓度如何(0至500ng/ml)，对照线产生相同大小的峰，而测 试线的大小随着样品中ERAC浓度的增大而增大。S 8图8显示对ERAC浓度在50至2000ng/ml之间的样品进行测试并使用扫描仪读数 时，获得的标准曲线。S 9图9显示本发明横向流动装置的扫描仪器读数和视觉模拟读数之间的相互关系。 χ轴上绘制扫描仪读数，Y轴上绘制视觉模拟读数。
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发明详细说明为了研究患有风湿性关节炎或肠辐射损伤的患者，开展了对人A12的酶免疫测定 (ELISA)。通过分析来自健康个体的样品来确定正常范围。发现分析结果强烈依赖于样品 中钙的浓度；实际上几乎没有A12，如果有，A12可以在正常血浆中检测到，因为结合钙的化 学物如EDTA或柠檬酸盐被用于防止血液结块。由于已经显示A12在钙存在时能够形成二 聚体和低聚体，因此决定通过在添加或不添加EDTA的情况下检测样品，在凝胶渗透色谱柱 上检查血清中的这种复合物。这种方法可以根据分子量分离蛋白分子。可以证实，在来自 健康个体的样品中，如果色谱缓冲液包含钙，例如2mM氯化钙，则A12作为单体或低聚体存 在，分子量高至约800kDa。相反，如果色谱缓冲液包含EDTA，例如2g/L，则A12作为单体洗 脱，对应约IOkDa的分子量。非常惊奇地发现，即使添加了 EDTA，一些患者和小部分看上去 健康的定期献血者的血清中仍含有高分子量的A12。因此，这种物质被称作“ERAC”，它是抗 EDTA 的 A12 复合物(EDTA Resistant A12 Complex)的缩写。本发明关注的事实是，人类中白细胞衍生的蛋白质S100A12可以高分子量的形式 出现在血清中，对应500kDa或更高的分子量，其在EDTA存在的情况下抗拒分解为单体。已 经在约50%的患风湿性关节炎的患者中发现了 ERAC。相反，150名在Norwayjergen大学 医院的血库定期献血者中只有2名存在ERAC。尽管看上去很健康，这两名献血者的血清A12 浓度为约13微克每升，是参考上限的十倍。本发明针对白细胞衍生的蛋白S100A12(A12)的高分子量形式在患风湿性关节炎 或类似疾病的患者中为高比例，约50 %，在健康成人中为小比例，约1. 5 %。在对新建立的A12酶免疫测定(ELISA)及其在不同患者组中的用途进行评估期 间，发现该分析结果依赖于钙的存在或缺乏。血浆中的A12水平，典型地来自EDTA抗凝的 血液，是非常低或者检测不到的。据推测，所用的抗体与A12上的单一抗原表位反应，使得 ELISA中的阳性反应需要在两个或多个A12单体中，即在A12 二聚体、低聚体或聚合体的存 在下，形成络合物。因为发现了 ELISA读数随钙的浓度成比例地增大，所以想测试是否该 分析水平与二聚体/低聚体的较高比例相关。为此，在凝胶渗透色谱(GPC)柱High Load Superdex-75 (Pharmacia, Sweden)上运行血清样品，该柱子用含有2mM氯化钙的tris缓冲 盐水(pH 8. 0)平衡。图1显示在正常血清中，在对应10至约500kDa分子量的至少六个部分检测A12。 相反，如果缓冲液不含钙，而是含有5mM EDTA,则A12以单一部分洗脱，对应IOkDa的分子 量，即类似单体。这在图2中示出。特点是，该部分在ELISA中未发生反应，除非添加氯化 钙以克服EDTA的结合能力。有一次，风湿性关节炎(RA)患者的血清用含有EDTA的缓冲液 处理，并且无意中在进行ELISA前没有在这部分添加钙。令人意外的是，在早期的部分中发 现强的反应性，即对应的分子量比以前看到的更大；该发现从来没有被发表过。开始认为这 是一种假象，但通过许多重复实验证实了该模式，见图3。因此得出的结论是，一些血清样 品包含A12的高分子量的物质；与其他A12复合物(二聚体，低聚体/多聚体)相比，它在 EDTA存在下不分解。随后，将许多RA患者和一些健康对照者的血清在GPC柱上运行以检查ERAC。发现 13名RA患者中的9名以及两位患有干燥症的患者中的1名有ERAC。如图4所示，ERAC可 以和不同量的单体A12—起存在。从患者的记录中明显看出，ERAC确实与关节外病变，典
20型地与动脉硬化性疾病相关。令人大为惊奇的是，还在两名健康的献血者中发现了 ERAC，这 可能暗示着亚临床病理。所有ERAC阳性个体都在血清中有高的A12水平。在经过筋疲力 尽的长跑之后，来自两名个体的样品没有显示ERAC，即使A12水平是上线参考水平的50-80倍。ERAC的特征还在于其与弱阴离子交换材料的结合；当来自GPC的ERAC部分应用 到以25mM巴比妥钠缓冲液pH 8. 8平衡的DEAE-琼脂糖凝胶FF柱上时，ERAC将与阴离子 交换剂结合，并可以用200mM氯化钠洗脱，见图5。众所周知，A12能够诱发炎症，并且由于该蛋白质是从在炎症部位的中性粒细胞如 RA患者的关节释放出来，可以假设，像ERAC这样的大复合物可能仍然留在组织中，并诱发 或维持炎症。人们普遍接受的是，粥样硬化症，该引起如冠心病的发病过程，是一种炎性疾病。 而且，ERAC可能发挥致病的作用。在看似健康的个体中发现ERAC可能是亚临床粥样硬化 症的标志，该发现可能在就此引入早期预防措施中是有益的。与A12密切相关的钙卫蛋白(S100A8和S100A9的异源三聚体)的高分子量复合 物的大量累积引起“钙卫蛋白综合症”(参考文件6和7)，特点是包括关节炎等多器官病 状。一种引人注意的假设是，与ERAC有关的这种综合症以及疾病可能是某些种类的朊病毒 病。通过对朊病毒使用体外复制技术(参考文献8)，有可能测试出是否加入的正常A12会 与ERAC结合。如果ERAC能够诱导或维持慢性炎症，则治疗手段可针对消除或灭活ERAC。对ERAC的分析可能对研究和临床目的都是有益的；例如在新药试验阶段，ERAC可 用于监测涉及A12的病理过程，以监测疾病活动和对治疗的反应。ERAC分析可基于这种发 现，即在EDTA存在下，在ELISA以及在其他可能的免疫测定中，仅ERAC产生阳性信号。ERAC 禾口 SEQ ID NO 1 的变体序列同源性的百分比可通过常规方法确定。例如，见Altschul et al. , Bull. Math. Bio. 48 603(1986)禾口 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl.Acad. Sci.USA89 10915(1992)。简言之，将两个氨基酸序列对齐，利用空位开放罚分10，空位延伸罚分1，以 及Henikoff和Henikoff的“BL0SUM62”得分矩阵(ibid.)来优化比对得分。然后同源性 百分比计算如下([相同匹配的总数]/ [较长序列的长度+为比对这两个序列而引入该较 长序列中的空位数])x(lOO)。本领域的技术人员可以理解，许多已建立的算法可以用来比对两个氨基酸序列。 Pearson和Lipman的“FASTA”相似性检索算法是合适的蛋白质比对方法，用于检查本文公 开的氨基酸序列与推定的或变体的氨基酸序列共有的同源性水平。Pearson和Lipman在 Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 85 2444(1988)和 Pearson，Meth. Enzymo1. 183 63(1990)中 描述了该FASTA算法。简言之，FASTA首先通过识别查询序列(如SEQ ID NO 1)和测试序列共有的区域 来描述序列相似性，该区域具有最高的同源性密度(如果ktup变量是1)或者同源对(如 果ktup = 2)，不考虑保守氨基酸替代、插入或缺失。然后，利用氨基酸替代矩阵，通过比较 所有成对的氨基酸的相似性，重新记分带有高密度同源性的十个区，并且这些区的末端被 “修饰”以包含仅对最高评分做出贡献的那些残基。如果几个区的分数高于“临界”值(通
21过预先确定的公式，基于序列的长度和ktup值计算得到)，然后检查该修饰的起始区，以确 定是否这些区可以连接以形成近似的缺口对齐。最后，利用Needleman-Wunsch-Sellers算 法的修饰，比对这两个氨基酸序列的最高评分区(Needleman and Wunsch，J. Mol. Biol. 48 444(1970) ；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26 :787 (1974))，该算法允许氨基酸插入和缺失。 FASTA分析的优选参数是ktup = 1，空位开放罚分=10，空位延伸罚分=1，以及替代矩阵 = BL0SUM62。通过修改得分矩阵文件(〃 SMATRIX“)，可将这些参数引入FASTA程序，如 Pearson, Meth. Enzymo 1. 183 63(1990)的附录 2 中所解释的那样。本发明还针对与SEQ ID NO 1的氨基酸序列相比，有一个或多个保守氨基酸替代 的变体多肽以及编码有一个或多个氨基酸替代的多肽的多核苷酸。SEQ ID NO :1的变体包 括序列例如，其中烷基氨基酸替代烷基氨基酸，其中芳香族氨基酸替代芳香族氨基酸，其 中含硫氨基酸替代含硫氨基酸，其中含羟基氨基酸替代含羟基氨基酸，其中酸性氨基酸替 代酸性氨基酸，其中碱性氨基酸替代碱性氨基酸，或者其中二盐基一元羧基氨基酸替代二 盐基一元羧基氨基酸。在常见的氨基酸中，例如“保守的氨基酸替代”也可以通过以下各组中的氨基酸之 间的替代来解释(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和 色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6) 赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BL0SUM62表是蛋白质序列片段的约2000局部多重比对得到的氨基酸替代矩阵， 代表500多组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoffand Henikoff，Proc. Nat‘ 1 Acad. Sci. USA 89:10915(1992))。相应地，BL0SUM62替代频率可用于限定可引入本发明氨基酸 序列的保守氨基酸替代。虽然可能仅基于化学性质来设计氨基酸替代(如上所讨论)，“保 守氨基酸替代”的说法优选地指大于-1的BL0SUM62值表示的替代。例如，如果替代是以 0、1、2、或3的BL0SUM62值为特征，则氨基酸替代是保守的。根据该系统，优选的保守氨基 酸替代的特征是至少为1(如1、2或3)的BL0SUM62值，而更优选的保守氨基酸替代的特征 是至少为2 (如2或3)的BL0SUM62值。具体的SEQ ID NO 1的变体特征是，例如当氨基酸序列中的变化是由于一个或多 个保守氨基酸替代引起，则该变体与SEQ ID NO :1有至少70%，至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或大于95%的序列同源性。优选地，本发明的多肽至少70%与SEQ ID NO: 1相同，例如至少75%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%。特异性地针对本发明多肽的抗体的生产ERAC抗体或其片段，可用本发明的ERAC从天然源中分离获得。尤其有用的抗体与 ERAC “特异性地结合”。ERAC及其片段在下文中统称为本发明的多肽。如果抗体表现出以下两个性质中的至少一个，则抗体被认为是特异性结合(1) 抗体以结合活性的阈值水平与本发明的多肽结合，和(2)抗体与多肽没有明显地交叉反 应，该多肽与本文以下限定的本发明的多肽相关。至于第一个特征，如果抗体与多肽、肽或表位结合的，结合亲和度(Ka)为IO6M4或 更高，则抗体为特异性结合，优选ΙΟ、—1或更高，更优选IO8M-1或更高，最优选ΚΑΤ1或更高。 该抗体的结合亲和力可以被本领域的普通技术人员很容易地测定，例如通过Scatchard分 析(Scatchard, Ann. NYAcad. Sci. 51 =660(1949)) 至于第二个特征，例如，如果在标准的Westernblot分析中，抗体检测到本发明的多肽，但没有检测到以相似或相同量加入的已知 多肽，则抗体没有与相关的多肽分子显著地交叉反应。本发明的抗体可以利用承载抗原表位的肽或多肽来生产。本发明的承载抗原表位 的肽和多肽优选地包含SEQ ID NO 1中的至少四个，或15至约30个之间的氨基酸的序列， 或其片段。然而，包括大部分SEQ ID NO :1的肽或多肽，如包含30至50个氨基酸的序列， 或达到及包含本发明多肽(SEQ IDNO :1及其变体)的整个氨基酸序列的任意长度，也都用 于诱导与本发明的多肽相结合的抗体。人们希望的是，选择承载表位的肽，以提供在水溶液 中的大的溶解性(即该序列包括相对亲水的残基，而优选地避免疏水的残基被)。而且，还 可能需要包含脯氨酸残基的氨基酸序列用于抗体生产。例如，本发明的多肽的潜在抗原位点可利用Jameson-Wolf方法来识别(Jameson and Wolf, CABIOS 4 :181，(1988))，正如用 LASERGENE 的 PROTEAN 程序(version 3. 14)处 理一样(DNASTAR;Madison，Wis.)。这个分析中使用缺省参数。Jameson-Wolf方法可通过将蛋白结构预测的六个主要子程序相结合，预测潜在 的抗原决定簇。简言之，首先将Hopp-Woods方法，Hopp et al.，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 78:3824(1981)用于识别代表最大的局部亲水性区域的氨基酸序列(参数7个残基 平均)。在第二步，利用 Emini ‘ s 方法，Emini etal.，J. Virology 55 836 (1985)，计算表 面概率(参数表面判定阈值(0. 6) = 1)。第三，利用Karplus-Schultz方法，Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72 :212 (1985)，预测主链灵活性(参数灵活性阈值(0. 2) =1)。在分析的第四和第五步中，将二级结构预测应用到该数据中，利用Chou-Fasman方 法预测蛋白质结构和蛋白质构象的原则(Chou，“ Predictionof Protein Structural Classes from Amino Acid Composition, " , Fasman (ed.),第 549-586 页(Plenum Press 1990)，禾口 Garnier-Robson，Garnier et al. ，J. Mol. Biol. 120 97 (1978)) (Chou-Fasman 参 数构象表=64种蛋白质；α区阈值=103 ； β区阈值=105 ；Garnier-Robson参数α和 β决定常数=0)。在第六个子程序中，将弹性参数和亲水性/溶解可接触性因素结合起来 以确定表面轮廓值，指定为“抗原指数”。最后，将峰值扩大功能应用于该抗原指数，其通过 增加各个峰值的20、40、60或80%扩展了主要表面峰，以说明相对于内部区域而言，来自表 面区域的移动性的额外自由能。然而，该计算并不适用于任何驻留在螺旋区的主要峰，因为 螺旋区往往不太灵活。ERAC的多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的方法制备，例如Green etal. , “ Production of Polyclonal Antisera, “ Immunochemical Protocols(Manson, ed.),第 1 至 5 页(Humana Press 1992),禾口 Williams et al. , " Expression of foreignproteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonalantibodies," DNA Cloning 2 !Expression Systems,2nd Edition,Glover et al. (eds.)，第15页(Oxford University Press 1995)。通过使用佐剂可以增加多肽的免 疫原性，如明矾(氢氧化铝)或Freimd' s完全或不完全佐剂。用于免疫的多肽还包括融 合多肽，例如，ERAC或其部分与免疫球蛋白多肽，或者与麦芽糖结合蛋白的融合。该多肽免 疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样”，则该部分可有利地接合或连 接到大分子载体上(钥孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清清蛋白(BSA)或破伤风类毒素)，用于免 疫。多克隆抗体典型地出现在动物，如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或 绵羊中，特异性针对本发明多肽的抗体也可能来源于非人灵长类动物抗体。例如，用于在 狒狒中培养对诊断和治疗有用的抗体的通用技术可以在Goldenberg等人的国际专利公开 No. WO 91/11465，和 Losman etal. , Int. J. Cancer 46:310(1990)中找到。或者，可以生成特异性针对本发明多肽的单克隆抗体。特异性抗原的鼠 类单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法来获得(例如，见Kohler etal.， Nature 256:495(1975), Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1,第 2. 5. 1-2. 6. 7 页(John Wiley & Sons 1991) [ “ Coligan “ ] ；Picksley et al. ， “ Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E.coli, " inDNA Cloning 2 :Expression Systems,2nd Edition,Glover et al. (eds·), 第 93 页(Oxford University Press 1995))。简言之，单克隆抗体可以通过以下方法获得用包含基因产品的组合物注射小鼠， 通过抽取血清样品证实抗体产品的存在，摘除脾脏以获得B-淋巴细胞，将该B淋巴细胞与 骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆体，培养产生 抗原抗体的该克隆体，并从杂交瘤培养物中分离该抗体。另外，特异性针对本发明多肽的抗体可来源于人单克隆抗体。人单克隆抗体获取 自转基因小鼠，该小鼠被工程设计，以产生应答抗原激发的特异性人抗体。在这项技术中， 将人重链和轻链基因座的元件引入小鼠品系中，该品系来源于包含靶向断裂的内源性重链 和轻链基因座的胚胎干细胞系。转基因小鼠可以合成特异性针对人抗原的人抗体，并且该 小鼠可以用于生产人类分泌抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法已有描述， 例如 Green et al. , Nature Genet. 7 13 (1994), Lonberg et al. , Nature 368:856(1994) 禾口 Taylor et al.，Int. Immun. 6 579 (1994)。单克隆抗体可以通过不同的完善技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这些分离技 术包括蛋白-A琼脂糖凝胶的亲和色谱法，体积排阻色谱法，和离子交换色谱法(例如，见 Coligan，第 2. 7. 1-2. 7. 12 页和第 2. 9. 1 至 2. 9. 3 页；Baines et al.，“ Purification of Immunoglobulin G(IgG)，“ Methods in MolecularBiology，Vol. 10，第 79-104 页(The Humana Press, Inc.1992))。对于具体的用途来说，可能需要制备特异性针对本发明多肽的抗体片段。这种抗 体片段可以通过，例如抗体的蛋白酶水解获得。抗体片段可以通过常规方法由胃蛋白酶或 木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，可以通过用胃蛋白酶进行抗体的酶裂解以提供 表示F(ab'片段来生产抗体片段。该片段可以进一步用巯基还原剂裂解，以生 产3.5S Fab'单价片段。可选择地，该裂解反应可以用双硫键裂解产生的硫氢基的保护基 来进行。作为替代方案，使用胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个F。片 段。这些方法已有描述，例如Goldenberg，美国专利No. 4，331，647 ；Nisonoffet al.，Arch Biochem. Biophys. 89 230(1960) ；Porter, Biochem. J. 73 119(1959) ；Edelman et al.以 及 Coligan, both in Methods in Enzymology Vol. 1, (AcademicPress 1967)。裂解抗体的其他方法也可使用，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步 裂解片段，或者其他酶、化学或基因技术，只要该片段与完整抗体识别的抗原相结合。例如，Fv片段包括￥11和八链的结合。该结合可以是非共价的，正如Inbar et al.,
24Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 69 =2659(1972)所述。或者，不同的链可以通过分子间二硫键 连接或通过化学物质如戊二醛连接(例如，见Sandhu，Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992))。Fv片段可包括V1^Pt链，它们由肽接头连接。这些单链抗原结合蛋白(scFv) 可以通过构建包含由寡核苷酸连接的编码V1^nt域的DNA序列的结构基因来制备。将 该结构基因插入表达载体，接着将其引入宿主细胞，如E.coli。该重组宿主细胞合成单 一的多肽链，用连接肽桥接这两个V域。用于生产scFvs的方法已有描述，例如Whitlow et al. , Methods :A Companionto Methods in Enzymology 2 :97 (1991)(又见，Bird et al.，Science 242 :423 (1988)，Ladner 等，美国专利 No. 4，946，778，Pack et al.，Bio/ Technology 11 :1271 (1993)和 Sandhu，上文)。例如，scFV可以通过在体外将淋巴细胞暴露于多肽中，并在噬菌体或类似载体中 选择抗体展示库(例如，通过使用固定的或标记的蛋白质或肽)来获得。编码有潜在多肽 结合域的多肽的基因可以通过筛选展示在噬菌体(噬菌体展示)或细菌，如E. coli上的 随机肽库来获得。编码该多肽的核苷酸序列可以以多种方式获得，例如通过随机突变和随 机多核苷酸合成。这些随机肽展示库可用于筛选与已知目标相互作用的肽，该目标可以是 蛋白质或多肽，例如配体或受体，生物的或合成的巨大分子，或有机或无机物。用于创建和 筛选这些随机肽展示库的技术是本领域已知的(Ladner et al. ,U. S.专利No. 5，223，409， Ladner et al.，U. S 专利 No. 4，946，778，Ladner et al.，U. S.专利 No. 5，403，484， Ladner et al. ,U. S.专利 No. 5，571，698,禾口 Kay et al. ,Phage Display ofPeptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996))，并且随机肽展示库和用于筛选这些库的试剂盒都 是商业可得的，例如购自 CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.)，Invitrogen Inc. (San Diego, Calif. ),New England Biolabs, Inc. (Beverly,Mass.)禾口Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway，N. J.)。随机肽展示库可利用本文公开的序列筛选，以识 别相结合的蛋白质。抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(OTR)的肽。⑶R肽(“最小识别单 位”)可以通过构建编码感兴趣的抗体的⑶R的基因来获得。例如，这些基因可利用聚合 酶链反应制备，以从抗体生成细胞的RNA合成可变区(例如，见Larrick et al. ,Methods A Companion to Methods inEnzymology 2:106(1991), Courtenay-Luck, " Genetic Manipulation of MonocIonalAntibodies, " in Monoclonal Antibodies Production, Engineering and ClinicalAppIication, Ritter et al. (eds.),第 166 页(Cambridge University Press 1995),禾口 Ward et al. , " Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, " in MonoclonalAntibodies Principles and Applications,Birch et al.，(eds.)，第 137 页(ffiley-Liss, Inc. 1995))。或者，特异性针对本发明多肽的抗体可来源于“人源化”单克隆抗体。人源化 单克隆抗体可以通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补决定区转 入人可变区来生产。然后典型的人抗体的残基在小鼠对应物的框架区内被取代。应用 来源于人源化单克隆抗体的抗体组分排除了潜在的与小鼠恒定区的免疫原性有关的问 题。用于克隆小鼠免疫球蛋白可变域的通用技术已有描述，例如Orlandi et al. , Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 86:3833(1989)。用于生产人源化单克隆抗体的技术已有描述，例 如 Jones et al. , Nature 321 522(1986), Carter et al. , Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA
2589 4285(1992),Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 437 (1992),Singer et al.，J. Immun. 150 2844(1993), Sudhir(ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press,Inc.1995)， Kelley, " EngineeringTherapeutic Antibodies, " in Protein Engineering Principles and Practice, Clelandet al. (eds.)，第 399—434 页(John Wiley & Sons， Inc. 1996)，以及 Queen et al.，U. S.专利 No. 5，693，762 (1997)。通过使用标准技术，利用特异性针对本发明多肽的抗体或抗体片段免疫动物， 可以制备多克隆抗独特型抗体。例如，见Green et al.，“ Production ofPolyclonal Antisera, “ ,Methods In Molecular Biology ImmunochemicalProtocols,Manson(ed.), 第1-12页(Humana Press 1992)。又见Coligan，第241-247页。或者，单克隆抗独特型抗 体可以利用特异性针对本发明多肽的抗体或抗体片段作为免疫源，用如上所述的技术来制 备。作为另一种选择，利用上述技术可以制备人源化抗独特型抗体或非人灵长类动物抗独 特型抗体。用于生产抗独特型抗体的方法已有描述，例如Irie, U. S.专利No. 5，208，146， Greene, et. al. , U. S.专利 No. 5, 637, 677,禾口 Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77 1875(1996)。ERA C以及用于检测ERAC的试剂盒和方法S10012是一种主要发现于中性粒细胞和单核细胞中的钙结合蛋白。该蛋白具有细 胞内和细胞外功能，特别是通过与受体RAGE (高级糖化终产物受体)结合来诱导炎症，该受 体可以在如内皮细胞上发现。关于S100A12的一种假设是，S100A12是与受体相互作用的 六分子的实体。然而，该假设可能通过本发明人最新发现另一种更大的复合物(ERAC)被延 伸，该复合物可能是在风湿性关节炎(RA)患者中发现的一种病理复合物。与ERAC (抗EDTA的S100A12复合物)相关的发现表明ERAC是在凝胶渗透色谱的 高分子量部分(典型地100-400kDa)中发现的。EARC的一个重要特征是，在EDTA存在下， 它不分解为S100A12单体。假设一些物质(内源性，外源性)会影响ERAC分解成较小分子 量的复合物。动脉粥样硬化症的药物治疗可降低缺血性疾病的风险。该假设认为ERAC与 内源性细胞受体结合，诱导一种病态的，持续的前炎症信号。用可分解ERAC的药物处理，可 能缩短病态的被延长的与受体结合的持续时间。这一方面，可能的药物可以是抗炎药物，如 乙酰水杨酸和他汀类。另一种机制可能是RAGE拮抗剂，与TNF-α拮抗剂的机制类似，通过 该机制，药物可能阻碍假设的与受体的病理性结合。在一种实施方式中，本发明提供一种用于检测样本或样品中的ERAC的方法，其中 所述样本，可选地经处理除去不需要的成分，与包含目标物的试剂盒接触，该目标物优选地 是抗ERAC的抗体。在使用抗体的情况下，该接触结果是形成了带有ERAC抗原的免疫复合 物。将试剂盒与样本分离，所述分离的试剂盒与包含本发明的聚合物载体分子的移动 固相接触，该载体分子上已经结合了预先确定的目标物，如抗体。该抗体导致本发明所述 的聚合物载体分子与所述免疫复合物结合；随后将该试剂盒与所述移动固相分离；检测本 发明的与所述试剂盒结合的聚合物载体载体分子的存在，由此检测或确定所述样本中ERAC 的存在。此外，本发明提供了一种ERAC检测试剂盒，其包括独立的成分(a)固体载体，其 上结合了目标物，优选地为一抗体，该抗体可与ERAC特征的抗原形成免疫复合物；和(b)由
26本发明分散的聚合物载体分子组成的移动固相，其上结合了所述目标物或不同的目标物， 优选地为ERAC特征的抗体。在一种实施方式中，将可能包括ERAC的样本暴露于试剂盒，该试剂盒在至少一个 位置用目标物包被，该目标物将与ERAC的抗原形成复合物。在一种实施方式中，将试剂盒与样本分离，例如将样本从试剂盒上洗掉，然后将该 分离的试剂盒与本发明的分散聚合物载体分子的移动固相接触，该流动固相包括相同或不 同的目标物，优选抗体。如果在试剂盒的固体载体上形成ERAC的免疫复合物，本发明的聚 合物载体分子将与这些复合物结合。然后除去移动固相上的本发明未结合的聚合物载体分子，例如通过洗涤。再检查 试剂盒，以确定与试剂盒结合的本发明聚合物载体分子的存在。在某些情况下，这些可能是 视觉检测，例如本发明的聚合物载体分子最初已被着色或染色。也可采用显微镜检查。针 对本发明的聚合物载体分子，应用示踪剂或标记物使其他检测方法的使用成为可能，如下 文详细描述。通过这种方式，本发明结合的聚合物载体分子的存在或者不存在，使检测ERAC的 存在或不存在成为可能，本发明结合的聚合物载体的量的评估使确定样本中ERAC的量成 为可能，例如通过与标准结果或标准曲线进行对比，该标准结果或标准曲线是通过分析含 有已知浓度的ERAC样本来获得。本发明中使用的试剂盒可以多种形式或者结构使用。固相具有一位点，在此目标 物，优选抗体，可以结合或联合；并且用所述目标物，优选抗体形成的所述固相，能够使样本 与本发明方法中使用的其他物质相接触。优选的样本是本本文中描述的体液样本。试剂盒是操作简单以便样本和其他试剂容易接触的最佳方式。为此，该试剂盒可 形成试纸，注射器，试管或容器的至少一部分。样本或其他试剂可以吸入或喷出注射器，从而流经试管，或沉积在一容器上，如试 管形状的容器。在这种装置中，该试剂盒可以形成该装置的全部或其一部分。其中，在注射 器、试管或容器的情况下，形成试剂盒的这些部分至少暴露在该装置的内部，以允许与样本 和试剂接触。目标物，优选抗体，优选地是集中在所述试剂盒的固体载体的位置，从而暴露 于样本中。试剂盒的一种更优选的形式是试纸。在这种试纸中，进一步优选的是，试剂盒应该 被包含在至少一个末端，并且结合在所述试剂盒的固体载体上的目标物，优选抗体，应该集 中在试纸的该末端。然而，该试剂盒可以包括整个试纸；目标物优选抗体，集中在一端或者 在一个以上的位点。该试纸可以完全由试剂盒形成，在它的一端已经结合一层目标物，优选抗体。在另 一种实施方式中，该试纸具有一试剂盒，其一端与主体部分相连。目标物(优选抗体)的涂 层结合在该试剂盒上。在另一种实施方式中，该试剂盒完全形成一管状容器，其内部可以放 置样本。目标物(优选抗体)的涂层位于靠近容器的底部，并集中在一个或多个位点。所述试剂盒的固体载体由任意材料组成，其上可以有效地结合需要的目标物，优 选抗体。为了与抗体蛋白共价结合，固体载体材料可以选择包含功能性的羧基表面，并使用 水溶性碳二亚胺作为结合试剂。优选的材料是丙烯酸树脂，其具有羧基化表面，能够与需要 的目标物物(优选抗体)通过共轭作用结合。对于带有氨基表面基团的材料，可以通过与琥珀酸酐反应制备活性的羧基中间体。各种不同的无机载体，典型地比如玻璃，也可被制备 用于与目标物(优选抗体)的共价结合。能够与目标物，优选抗体，结合的固体载体材料选自不会对该方法步骤引起严重 干扰的材料。固体载体材料可以选自如下材料Whatman GF/DWhatman F147-11Whatman GF/AVAWhatman 147-02Whatman GF/DFAWhatman F147-09Whatman F075-17*Millipore Rapid Q24*Millipore Rapid Q27Ahlstrom A142Millipore Hi-Flow PlusMillipore Hi-Flow PlusMillipore Hi-Flow PlusMillipore Hi-Flow PlusMillipore Hi-Flow PlusSartorius Unisart CN40Sartorius Unisart CN90Sartorius Unisart CN200*组织样本中非特异性凝集物的存在，尤其是那些与免疫球蛋白结合的非特异性凝 集物，会通过引起本发明的可移动聚合物载体分子与试剂盒的结合而产生错误，即使在没 有ERAC的情况下也是如此。在分析期间重复洗涤会减少非特异性结合，但是为避免这种不 想要的结合，可能有必要除去该非特异性凝集物。例如，简单的聚苯乙烯乳胶表面可以被动 的除去某些凝集物，但涂有IgG的表面提供更好的亲和力。针对ERAC的单克隆抗体可以提供一致的并且可重复的结合。通过恰当地提供特 异性抗体，目前的直接结合免疫分析，与在放射免疫分析中实行的竞争性结合免疫分析相 比，是一种可靠并且非常快的程序，因为竞争结合分析中所需要的运动平衡的孵育时间目 前已不需要。根据本发明的方法，抗体目标物，无论是来自抗血清的常用Ig片段还是来自单克 隆抗体，都分别与试剂盒的固体载体结合，并且可选地与移动固相，即本发明所称的聚合物 载体分子结合。试剂盒的功能是用于从游离抗原中处理和分离结合物，但本发明的移动聚合物载 体分子的功能是用于检测形成的免疫复合物。抗体蛋白和各种固相材料之间的结合技术已 经得到良好的发展(例如，见W. J. Dreyer，U. S.专利No. 3，853，987)。本发明方法的一种实施方式中，由此产生的免疫复合物是一个多层“夹心物”，包 括
HF07504 HF09004 HF12004 HF13504 HF18004
28
固体载体+目标物(优选标记的抗体)+ERAC+目标物(优选抗体)。然而，共价结合所需要的抗体的量可能比被动吸附到塑料如聚氯乙烯上的量少几 千倍，并且使用这种高度特异性的目标物(优选抗体)的经济情况会受到抑制。—种保留共价结合的一些强度以及目标物(优选抗体)的特异性的替代结合方式 是用第一抗体桥接该目标物与该固相，该第一抗体是一种针对目标抗体的Fc部分的抗物 种抗体。也就是说，一种廉价的第一抗体最初可与固相连接共价结合，并且该结合的第一 抗体吸引目标抗体的物种特异性的Fc部分，留下对于ERAC抗原保持不变的目标抗体的功 能表位。在检测一个物种的情况下，用这种第一抗物种抗体桥接，本发明的免疫分析产生如 下结合的“夹心物”固体载体+抗物种抗体+标记的目标抗体+ERAC+目标抗体+抗物种抗体。在本发明的直接结合分析法中，固体载体和目标物(优选抗体)之间的结合，以及 可选择的本发明的聚合物载体分子和目标物(优选抗体)之间的结合，被提前制备；并且在 上述直接结合分析法之前，作为前处理，可将样品中的非特异性凝集成分除去或失活。微流系统本发明的试剂盒也可用在微系统中，如WO 98/10267中描述的微流系统，Torsana Biosensor A/S, Denmark正在销售这一种系统。微流系统的技术背后的原理是，通过控制至少两个引导流的流速，样品流可以被 精确定位在目标表面。通过控制引导流和样品流之间的流比，样品流可以集中在几毫米的宽度。该样品 流携带分子与表面相互作用。该系统的固定通道与含有未知样品的液体流在y_维相互作用。在能发生反应的地方，产生数以千计的独特的交叉点。非常狭窄的液流中不存在湍流，这一事实导致扩散，扩散是扰动样品流的聚焦的 唯一现象。事实上，这种技术允许在平面上对液流进行精确的定位。以这种方式，有可能以 几毫米的精确度定位材料。微流系统允许控制非常狭窄的液体流，该液体流携带着与芯片表面相互作用的材 料(DNA、蛋白、细胞)。该微流系统能够使反应物流停止流动，目前，标记的目标物的流以及随后以一个 或几个样品进行测试产生一种带有数千个交叉点的编排组合，化学反应在此发生并被检 测。整个程序是在封闭的流体系统中进行，在样品-反应物应用，固定和检测化学物质的选 择，以及列阵布局方面提供了灵活性。尤其是当使用该试剂盒测试多个免疫标记时，如提供免疫标记的概况或自身抗体 的概况时，本发明适当地包括在微系统中使用试剂盒。除微系统之外，本发明的试剂盒也可形成常规宏观系统例如横向流动装置的一部 分。横向流动装置本发明的试剂盒优选地可以是横向流动装置的形式(LFD)。横向流动装置，也称为 横向流动测试或横向流动免疫色谱分析，是一种用于检测样品(基质)中目标分析物的存在或缺乏或数量的简单装置，例如，目标分析物为蛋白或肽或蛋白复合物或肽复合物或核 酸。最常见的横向流动装置是用于医疗诊断，或者用于家庭测试，定点照护，或者供实验室 使用。常常制造成试纸的样式，横向流动测试是一种免疫分析的形式，其中测试样品经毛细 作用沿固体载体流动。在将样品加到该试纸后，通常遇到标记试剂，该标记试剂与样品混合 并运送给底物，与用目标物(如抗体)预处理过的线或区相会。根据样品中存在的分析物， 该标记的目标物可以在测试线或区结合。横向流动测试可以操作用于竞争性分析或夹心分 析。本发明的LFD可包括被外壳包裹的固体载体，如硬质塑料外壳。该外壳可优选具 有至少一个用于将样品加到固体载体的开口或孔，(一般称为“样品应用孔”)，以及一个用 于观察或读取测试结果，并可选地观察固体载体上包含的任意标准品的开口或孔或透明部 分(一般称为“测试结果观察孔”)。在本发明的一种实施方式中，LFD的固体载体包括一个加样品的应用区，典型地穿 过外壳的上述样品应用孔。当用于固体载体时，由于毛细作用力，该样品流过固体载体。下 文中，术语“上流”和“下流”是指样品在固体载体中的流向。典型地，应用区位于固体载体 的一个末端，使得样品基本上只在一个方向流动。该固体载体进一步包括结合区，位于所述 应用区的下游，或者与所述应用区重叠。该固体载体进一步包括位于所述结合区下游的测 试区。该固体载体进一步包括位于所述测试区下游的对照区。当LFD被建立用于夹心式分析时，结合区包括能够与ERAC结合的标记目标物。测 试区包括能够与ERAC结合的非标记目标物。以这种方式，样品中的ERAC将从应用区流至 结合区。在结合区，样品中的ERAC将会被标记目标物结合，如标记单克隆抗ERAC抗体。然 后，与标记目标物结合的ERAC将移动至测试区，在测试区与非标记目标物结合。这样，当样 品包含ERAC时，标记目标物会终止在测试区(阳性结果)。如果样品中不含ERAC，则不会 有标记目标物终止在测试区(阴性结果)。当LFD被建立用于竞争型分析时，结合区将包括与标记ERAC结合的目标物。样品 中的ERAC将与目标物竞争性结合，从而与标记ERAC竞争。然后，与标记目标物结合的标记 或非标记ERAC将流动到测试区，其在测试区与非标记目标物结合。样品中含有的ERAC越 多，则最终在测试区的标记物越少。换句话说，完全不含ERAC的样品将产生充分标记的测 试区，而带有非常多的ERAC的样品，在测试区将产生极少的标记或无标记。如果LFD包括对照区，用于证明样品穿过固体载体，从应用区穿过结合区和测试 区并走得更远，则结合区将包括对照蛋白以及能够与所述对照蛋白结合的标记目标物。然 后，该对照区将包括能够与对照蛋白结合的非标记目标物。以这种方式，如果样品加到LFD， 它将穿过载体，从应用区穿过结合区和测试区，至少到达对照区。与对照蛋白结合的标记目 标物将和样品一起被拖动，并以与对照区的目标物结合而告终。以这种方式，如果样品已经 运行穿过载体，则对照区将被标记。LFD中用于与ERAC结合的目标物可优选地为抗体，如能够识别包括ERAC在内的 S100A12 二聚体和低聚体的单克隆抗体。然而，该抗体并不识别S100A12单聚体，该单体是 在二价金属离子螯合剂如EDTA的存在下，即不含钙离子时，由S200A12 二聚体和低聚体分 解产生。优选地，该抗体是特异性结合ERAC的抗体。在一种实施方式中，该抗体是特异性 结合ERAC的抗体，并且同时不与天然S100A12低聚体结合。
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试剂盒的一种实施方式可优选地包括-用于加样可能包含ERAC的体液样品的区域，所述区域包含至少一个能够与所述 ERAC结合的可移动的标记目标物，所述加样(应用)区在液体中接触，-用于测试与所述目标物结合的ERAC的存在、量或浓度的区域，所述区域进一步 包括一目标物，该目标物用于至少将所述体液样品中包含的大部分ERAC固定在所述测试 区上，并且可选择地-阳性对照区域，产生阳性对照，确认至少部分所述体液样品从所述应用区转移到 所述检测区。至少一个标记目标物包含在样品应用区，或可选地包含在隔开的结合区，优选地 包含一种抗体，该抗体包含至少一个标记、标签、连接头或标志，使其能至少检测所述标记 目标物的存在，并且更优选地还使其能定量地检测与ERAC结合的所述抗体和/或所述标记 目标物。测试区的目标物也优选为一种抗体，但是该抗体不包括任何标签，标记或标志。因 此有可能将一定量的可检测的报告物固定在测试区，该报告物准确地反应体液样品中存在 的标记的量。优选地，使用的至少一个标签、标记或标志允许通过如电磁辐射或可见色彩的 产生进行视觉检测，还允许通过如发射的电磁辐射进行定量。应该理解，可移动的目标物包括这样一种目标物，当被加到包括固体载体的横向 流动装置时，它能够在例如固体或半固体表面上方、内部或穿过该表面移动。本发明这一方面的一种实施方式中，提供一种用于检测体液样品中存在的ERAC 的分析装置，所述装置包括_ 一中空外壳，具有体液样品应用孔和测试结果观察孔，-一在所述中空外壳内的吸水性体液样品接收部件，，用于接收加到所述样品应用 孔的所述体液样品，-一包括干燥多孔载体如硝化纤维素的测试条，其在所述外壳内并从所述吸水性 体液样品接收部件延伸至所述测试结果观察孔并超出该孔，所述干燥多孔载体具有可通过 所述观察孔观察到的测试结果区，-至少一个所述吸水性体液样品接收部件以及所述包含从所述测试结果区向上游 的可检测目标物的测试条，该可检测的目标物能够特异性结合ERAC，以形成第一复合物，-所述目标物包括至少一个微粒标记，如染料溶胶，金属溶胶或有色乳胶粒子，并 且可选择地包括至少一个可荧光检测的标记，所述标记被所述体液样释放成可移动的形式。其中所述标记在所述测试条中的移动可以变得容易，以有效减少所述测试条和所 述标记之间的相互作用的量，通过用含有多糖的材料从所述测试结果区向上游，涂覆至少 部分所述测试条，或者在含有多糖的材料的存在下，从所述测试区向上游，干燥所述部分测 试条上的所述标记，和其中在所述测试结果区，所述干燥多孔载体包括一种用于结合所述第一复合物的 工具，所述工具用于结合固定在所述测试结果区中的非标记目标物，和其中所述体液样品从所述吸水性样品接收部件迁移进入或穿过干燥多孔载体，通 过所述干燥多孔载体的毛细作用将所述第一复合物传送至所述测试区，在这里，所述结合
31元件结合所述第一复合物从而形成第二复合物，并确定所述第二复合物的存在、量或浓度， 通过所述测试结果观察孔可以观察到该复合物。在另一种实施方式中，提供一种用于检测体液样品中ERAC的分析装置，所述装置 包括固体载体，该固体载体的测试区上包括至少一种可检测的目标物，所述至少一种可检 测的目标物能够结合ERAC，所述目标物进一步包括脂质体或微胶囊，该脂质体或微胶囊包 含可见的粒子染色化合物，并且可选择地包含荧光可检测标记。在另一种实施方式中，提供一种分析装置，包括-一包括预定量的目标物的样品应用区，该目标物包括能够与沉积在上面的ERAC 结合的抗体，所述区域在液体中能够连通-一包括可移动的目标物的反应区，该目标物包括能够与所述指示剂结合的抗体， 所述目标物进一步包括至少一种视觉可检测的粒子和/或至少一种荧光可检测的粒子，和-一包括目标物的检测区，该目标物包括能够与所述指示剂结合的抗体，其中，将所述包括ERAC的体液样品加到所述样品应用区。阈限量的指示剂与所述 抗体结合，从而防止与反应区存在的抗体结合。其中所述体液样品中仍未结合的ERAC从样品应用区经过，穿过所述反应区，在反 应区它与所述可移动的目标物结合，该可移动的目标物包括i)能够结合所述指示剂的抗 体，和ii)至少一种视觉可检测的粒子和/或至少一种荧光可检测的粒子，和其中与可移动的目标物结合的ERAC被携带与检测区接触，在检测区ERAC与所述 目标物结合，该目标物包括能够结合ERAC的抗体，和其中所述ERAC的结合导致所述可移动的目标物固定不动，该目标物进一步包括 i)能够结合ERAC的抗体，和ii)至少一种视觉可检测的粒子和/或至少一种荧光可检测的 粒子。本发明使用目标物，标记物，以及更普遍的分子物种。本发明中的术语“分子物 种”用来表示，如作为标记或标志的分子或离子物种(如酶、或发荧光或冷光的物种)；或者 作为目标物的分子，即能够与一种或多种目标分子、基团、受体或表位(这种目标物的实例 是半抗原或半抗原结合物，抗原，抗体，核苷酸序列和激素)进行选择性或特异性结合的分 子。在一种具体实施方式
中，本发明涉及同时或相继使用第一目标物和第二目标物中的任 意一种或两种，包括多克隆和单克隆抗体，它们可以分别是i)相同的或不同的，和ii)特异 性针对ERAC特有的抗原决定簇的相同或不同表位。本发明的分子物种可以在许多不同类型的物质中找到，例如蛋白质，如铁蛋白， 藻红蛋白，藻蓝蛋白或藻胆素；酶，如辣根过氧物酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖苷 酶或脲酶；毒素；药物；染料；荧光剂，冷光剂，磷光剂或其他发光物质；金属螯合物质，如亚 氨基二乙酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或去铁敏B ；放射性同位素标 记的物质；或重原子标记的物质。许多分子物种都能作为本发明的结合物中的标记物。标记的另外的实例就列在本 文下方。i)荧光物质，选自如荧光黄(相配地为异硫氰酸荧光素、FITC)、氨基荧光素、1-萘 酚、2-萘酚、曙红、曙红、桑色素、邻苯二胺、罗丹明和8-苯胺-1-萘磺酸。ii)相关的放射性同位素，可选自，如H(即氚，3H)、碳(如14C)、磷(如32P)、硫
32(如 35S)、碘(如 1311)、铋(如 212Bi)、钇(如 90Y)、锝(如 99Tc)、钯(如 109Pd)和钐 (如153Sm)的同位素。iii)相关的重金属原子，可选自，如] 11、？6、(0、附、01、211、6&、In、Ag、Au、Hg、I、 Bi、Y、La、Ce、Ei^PGd。金(Au)可与银(Ag)结合用作增强试剂，并且Au在许多情况中都 是特别有用的重原子。分子物种也可以是目标物的形式，该目标物能够与互补分子或生物源材料的互补 结构区选择性地结合或选择性地反应。例如，相关的目标物的实例是抗原；半抗原；单克隆 或多克隆抗体；基因探针；天然或合成的寡核苷酸或多核苷酸；某些天然或合成的单糖，寡 糖或多糖；外源凝集素；抗生素蛋白或抗生蛋白链菌素；生物素；生长因子；激素；受体分 子；或蛋白A或蛋白G。对于合适的抗体例子，参考本文给出的实施例。相关的激素的例子 可以选自类固醇激素(如雌激素、孕激素或可的松)，氨基酸激素(如甲状腺素)以及肽和 蛋白质激素(如加压素、蛙皮素、胃泌素或胰岛素)。在一种实施方式中，本发明可采用标准的免疫组织化学或细胞化学检测程序，或 适当修改的此类程序来检测ERAC。因此，本发明可采用任意分析识别抗原决定簇，通过是抗 原决定簇与特异性的所谓的初级抗体发生的免疫化学反应来调节，该抗体能够专门与ERAC 形式的目标抗原决定簇反应。该初级抗体优选地用合适的标记物来标记，该标记物能够直接或间接地产生可检 测的信号。该标记物优选地是酶、同位素、荧光基团或重金属，例如金。在另一种实施方式中，本发明，通过与特异性的所谓二级抗体的免疫化学反应来 进行初级抗体的检测，该二级抗体能够与初级抗体反应。在这种情况下，二级抗体优选地用 合适的标记物来标记，例如酶、同位素、荧光基团或重金属，例如金。在另一种实施方式中，本发明用所谓连接抗体作为检测ERAC的手段。该实施方式 指出，ERAC形式的目标抗原决定簇与初级抗体之间的免疫化学反应，是通过包含特异性连 接抗体的另一免疫化学反应来调节，该特异性连接抗体能够同时与初级抗体和另一抗体反 应，酶经由免疫化学反应或经由共价键等与连接到所述另一抗体。在本发明另一种实施方式中，ERAC形式的目标抗原决定簇和初级抗体之间，或初 级抗体和二级抗体之间的免疫化学反应，是通过结合除抗原和抗体以外的互补分子对进行 检测。优选的是互补对，如生物素和链霉。在该实施方式中，互补对的一员连接到初级或二 级抗体，并且通过任意合适的标记物，如酶、同位素、荧光基团或重金属如金等，与互补对的 另一员接触。当使用酶标记作为标记物时，用底物来处理本文上述的与固体载体结合的ERAC， 底物优选为显色剂。酶与底物反应，接着导致在酶的位置或周围形成有色的、不溶解的沉淀 物。显色反应的形成是样品中存在ERAC的阳性指示。当使用重金属标记物，如金时，样品优选地用试剂形式的所谓增强剂来处理，该试 剂含有如银或类似的对比指示剂。银金属优选地在金的位置或周围沉淀为黑色沉积物。当 使用荧光标记时，通常不需要显色剂。可能需要引入至少一个洗涤步骤，优选地洗涤后样品中的某些成分通过与合适的 染色剂反应被着色，从而与讨论的问题中的标记物提供的颜色形成令人满意的对比。在可 选择的最后洗涤步骤后，优选地将该样品涂上透明试剂涂层，以确保永久保存该记录以供检查用。对正讨论的标记物的检测优选同时显示ERAC形式的目标抗原决定簇的位置和 量。在酶标记的情况下，该检测可通过视觉检查、光镜检查来进行；在重金属标记的情况下， 该检测可通过光镜或电子显微镜检查；在荧光标记的情况下，可使用合适波长的照射光，通 过荧光显微镜检查；而在同位素标记的情况下，可通过放射自显影来进行。优选的是通过样 品的目视检查来检测ERAC的存在，优选地指示剂的量的检查也是如此。在尤其优选的实施方式中，目视检测是基于分界点。一种颜色超过该点，表明ERAC 的存在超过某个最小量(cut-offpoint)，而另一颜色低于该临界点，表明ERAC存在的量小 于该临界点指示的量。当使用荧光标记时，检测的ERAC的量可以与检测单位测量的荧光直 接相关。当测试能够在预先确定的时间内按如上所述检测ERAC的量时，本发明优选的统 计质量参数可归纳如下灵敏度至少80%，如至少85%，如至少90%特异性至少80%，如至少85%，如至少90%阳性预测值至少80%，如至少85%，如至少90%阴性预测值至少80%，如至少85%，如至少90%，更优选至少99. 5%。阳性和阴性预测值与用于待测试人群的临床情况的普遍性密切相关。在本文中， 优选的是，统计计算是基于对使用该测试实际可行的一类人群。这样，统计计算不但基于已 知患有临床情况的人群，而且还基于临床情况可能显示为阴性的那些个体。鉴于本发明试 剂盒的有效性和灵敏性，该试剂盒尤其适用于测试有流行性情况的人群，该情况的普及经 测试为小于100 %，如小于90 %，如小于80 %，更优选小于70 %，甚至更优选小于60 %，如约 50%。
实施例实施例1 用于评价ERAC的饩谱和酶免疫分析在凝胶渗透色谱上运行血清样品，例如1. 6x60cm规格的Pharmacia，Sweden的 High Load Superdex_75 柱，使用由 50mM tris，150mM氯化钠和 5mM ETTA，pH 8.0 组成的缓 冲液。选择流速lml/min。高分子量的蛋白比低分子量蛋白较早洗脱。用以下描述的ELISA 评估从柱中洗脱的部分中的ERAC和A12。典型地，当约68ml缓冲液通过色谱柱时，洗脱出 分子量为lOkDa的正常分子结构的A12，而仅有约55ml缓冲液通过色谱柱时，洗脱出ERAC。 正常A12和ERAC的分子量差异很大，使得各部分之间没有重叠。表示洗脱体积的通用和一 致的方式是将洗脱体积表示为样品中一种同质蛋白的部分，典型地为清蛋白。使用上述柱 子，ERAC和清蛋白的洗脱体积之间的比率为约0. 82，相反，对于正常A12来说，该比率为约 1. 32。或者，可以用离子交换色谱区分ERAC和正常A12，如图5所示。将血浆样品应用于 例如，填充有Pharmacia，Sweden公司的DEAE-S印haroseFF凝胶，用25mM的巴比妥钠缓冲 液pH 8. 8平衡的色谱柱上。通过添加75至100mM氯化钠，正常A12从柱中洗脱，而当氯化 钠浓度增加到200mM时，ERAC才被洗脱。代替阴离子交换柱，阴离子交换剂可以是薄膜，如 作为微孔的底部，以便在ERAC被结合后，其存在可以通过使用以酶、荧光或有色粒子标记
34的抗体来显示。还可使用其他类型的色谱法，例如阳离子交换或疏水性相互作用色谱或色 谱聚焦，通过选择缓冲液和媒介，使ERAC和正常A12分离。以下酶免疫分析(ELISA)可以用于评估ERAC 将微量滴定板中的孔，比如吸取300 微升溶液的96孔，用150微升兔抗-ERAC的IgG片段培养，在pH 7. 4的磷酸缓冲盐水中稀 释为例如1 500，持续至少18小时。或者，可以使用适宜浓度的抗ERAC的单克隆抗体，如 10微克每毫升。最佳的稀释剂取决于兔抗血清中抗-ERAC的滴度，以及ERAC与抗体之间的 亲和力；后者也适用于单克隆抗体。在培养期间，抗ERAC抗体将结合到孔壁上。为避免水 分挥发，孔必须用胶带覆盖。使用前，孔必须洗涤4次，每个孔每次用250微升含吐温-20 的 0. 5ml/L 的 PBS。将50微升标准品加到指定孔中，该标准品由浓度为400与6. 25ng/ml的纯ERAC在 缓冲液中组成。该缓冲液包含50mM tris，150mM氯化钠，0. 5mM氯化镁，2. 5mM氯化钾，5mM 氯化钙，10g/l牛血清清蛋白，0. 5ml/LTween-20,pH 8. 0。40微升血清样品与10微升100mM 的ETTA钾溶液混合，加到隔开的孔中。标准品与样品均为一式两份进行测试。覆盖并摇晃 微量滴定板，约lOOOrpm，在室温下进行约60分钟。随后，用上述方法洗涤孔。然后以适当 的稀释度如1 500向每个孔添加50微升碱性磷酸酶(ALP)结合的，亲和纯化的抗ERAC ； 该板再摇晃孵育60分钟。按如上方法洗涤4次后，将100微升适宜的酶底物，如对硝基苯 磷酸盐，0. lmg/ml，溶解在含有10%二乙醇胺，0. lg/1氯化镁，0. lg/1水杨乙汞，pH 9. 5的 缓冲液中。酶反应生成黄色，黄色的强度反映ERAC的浓度。通过使用针对微孔板设计的分 光光度计可进行读数。ERAC浓度使用与读取器连接或内部置入读取器的计算机来计算，或 者从手工标准曲线中计算。该标准曲线中，标准品的光密度(0D，反应颜色强度)是针对它 们的已知浓度来绘制。典型的标准曲线如图6所示。含ERAC的血清样品将产生对应ERAC浓度的光密度，其高于6. 25ng/ml标准品的 光密度，而不含ERAC的样品将产生较低的光密度。或者，ERAC浓度可以通过快速测试确定，例如通过使用基于横向流动原理的免疫 色谱法，通常简写为LTF测试。ERAC LFT测试包括如下特异性抗-ERAC抗体，该抗体通过 使用纯ERAC免疫实验动物来获得，用作为狭窄条带穿过薄膜中间，该薄膜由硝化纤维素或 类似的蛋白结合薄膜构成。抗体将不可逆地与薄膜结合，薄膜的典型尺寸是5x60mm。通过 用不相关的动物蛋白如牛清蛋白孵育，阻断薄膜上残留的蛋白结合位点。该薄膜的一个末 端连接有第二薄膜，样品应用垫，尺寸为5x5mm，其中胶体金粒子标记的抗ERAC已经被施加 和干燥。或者，该抗体可以用其他类型的有色粒子来标记，如用乳胶制成。该薄膜可以由滤 纸、玻璃纤维或类似的适宜材料组成。长薄膜的另一末端连接有吸水过滤纸的5x5mm垫。当 含有ERAC的溶液，如100微升血浆或其色谱馏分，加到样品应用垫薄膜上时，标记抗体将被 溶解并与样品中的ERAC反应；然后，抗原/抗体复合物将朝着吸水垫分散在长薄膜中，并穿 过薄膜中间与抗体的条带结合；以这种方式会横跨薄膜出现一条有色线条。在一定范围内， 线条的染色强度与ERAC的浓度成比例，并可以通过光度计来测量。图7显示了 LFT测试的 一个实例，其中测试了一个高浓度(500)和一个低浓度(31.3)的样品。利用这种NLFT测 试，可以证实ERAC在凝胶渗透色谱的高分子部分中的存在。实施例2 使用免疫方法肓接评估ERAC许多用纯ERAC免疫的兔产生针对蛋白质上单一抗体结合位点或表位的抗体。一
35些单克隆抗体也可以与单一的表位结合。许多常用的免疫分析方法如ELISA，LFT，凝集法， 比浊法或免疫沉淀反应，都要求至少两个表位存在于抗原上，如一种蛋白。当使用与单一表 位反应的抗-ERAC抗体时，会观察到阴性反应，即没有产生免疫复合物，除非S100A12以包 含至少两个A12单体的二聚体、低聚体、多聚体或杂聚体的形式存在。在正常的人血清中， A12大多作为钙依赖低聚体存在，如二聚体或六聚体，见图1，并且当使用ELISA时，它们产 生强的信号。如果将钙螯合物如EDTA加入到样品或分析缓冲液中，反应呈阴性。EDTA与钙 结合，使低聚物分解成单体，如图2所示。事实上，如果将钙加到分析缓冲液中，例如终浓度 至5mM，使得低聚体再次形成，则单体片段的存在仅可以通过ELISA显示。在含ERAC的血清 样品中，即使存在EDTA，如浓度为5mM，也会发现阳性反应。这正是命名ERAC背后的原因 抗EDTA的A12复合物。 因此，显示ERAC的存在试验，可以在EDTA存在下，用许多不同的免疫分析方法进 行，如ELISA，免疫荧光法，化学发光法，免疫流式细胞计数法，LFT，抗体涂覆的细胞或粒子 凝集法，浊度测定法或免疫沉淀反应。以适当的浓度使用EDTA，如5mM，可以防止单体A12 的反应，而某些患者的血清中存在ERAC时会产生阳性反应。实施例3 血清中的ERAC的检测选择自自大量不同患者和健康对照人群的血清样品，通过凝胶渗透色谱(GPC)检 测ERAC的存在。风湿性关节炎在一群风湿性关节炎(RA)患者(n = 129)中，17名患者(13. 2% )患有心血管疾 病(CV)。CV疾病的存在是基于患者的病史和临床评估以及审查相关验证性程序的记录。因 此，如果患者已经被心脏病学家诊断患有缺血性心脏病(即如心绞痛或心肌梗死)，通过超 声心动图确认为充血性心力衰竭，通过电脑X线断层摄影术确认为中风，或者血管造影术 确认为下肢间歇性跛行，则认为存在CV疾病。检查了基于的S100A12的高血浆浓度从该群体中选择出来的24个血浆样品。此 外还检查了几个低(正常)S100A12浓度的样品。在这24个样品的21个中发现了 ERAC。GPC检查24名患者存在ERAC的21名中存在ERAC和CVD 10名患者存在ERAC，无CVD: 11名患者其他3名无ERAC中无ERAC，但存在CVD 1名患者无ERAC和CVD 2名患者健康献血者在150名献血者中(全部推定为健康):GPC 检查 9 人存在ERAC 2 人 *无ERAC 7 人*)两者的S100A12血清浓度都在高于建议的参考区间上限的6倍范围内健康人运动
36
2名健康人跑3km，在运动后不久，S100A12的浓度暂时非常高，但是在这些样品中 没有ERAC。正常的，和先兆子痫妊娠，以及患有肾小球性肾炎的妊娠妇女在一群正常妊娠和先兆子痫妊娠的妇女中正常妊娠n = 23GPC检测 3名妊娠妇女无ERAC:3名妊娠妇女先兆子痫妇女n = 23GPC检测 4名患者存在ERAC: 1名患者无ERAC:3名患者患有肾小球性肾炎的妊娠妇女= 1无ERAC:1名患者*)2S100A12的浓度也很高(在高于建议的参考区间上限的6倍范围内)原发性干燥综合症来自142名患者GPC检查6名患者存在ERAC: 5名患者无ERAC: 1名患者实施例4 横向流动装置本发明的一种实施方式是横向流动免疫色谱测试(LFT测试)，包括由适宜蛋白结 合材料如硝化纤维素(NC)组成的薄膜条带，如0. 1mm厚，60mm长和6mm宽。抗S100A12的 抗体不可逆地结合成线，如0. 5mm厚，通过移取适宜浓度的抗体溶液，如2微克/毫升，穿过 条状物的中心部分；该部分被称为“测试区”。在距离测试区相同的距离处，如10mm，结合有 类似的抗相关蛋白，如山羊丙种球蛋白的抗体区；该区域被称为“对照区”。条带上任何残 留的蛋白结合位点通过用另一种合适的蛋白，如酪蛋白，在合适的温度下孵育合适的时间 来阻断，例如在室温下孵育1小时。在接近条带的一个末端的位置，称作样品应用区，附着 另一种合适的大小适宜的膜，例如由玻璃纤维制成，1mm厚，10mm长，6mm宽；该薄膜可以恰 当地称作“样品应用垫”。该垫在使用前应该用以有色粒子(如胶体)标记的适宜抗体以适 宜的浓度浸泡，例如1毫克/毫升；所述抗体必须是抗-S100A12和对照区中使用的蛋白的 抗体，以及与对照区的抗体相结合的适宜浓度的蛋白组成的混合物。在适宜的温度下浸泡 适宜的时间后，例如室温下浸泡1小时，将样品应用垫干燥，例如在室温下在风扇前干燥1 小时。在条带的另一末端，即样品应用垫的对面附着吸水材料的垫，例如2mm厚，6mm宽，和 10mm长，由过滤纸制成。为避免薄膜从空气中吸收水分，附带的条带应该包装在不透水蒸气 并含有干燥剂如二氧化硅的小袋中。为便于处理，条带可以置于一个带有开口的盒子中，例 如由塑料制成，开口便于加样品和检查测试区和对照区。当添加含S100A12的样品时，如血 浆或其稀释液，如体积为100微升，样品垫中的蛋白将被溶解并朝着吸水垫分散到NC条带 内。抗S100A12的标记抗体将与任意S100A12分子或含有该蛋白的复合物结合；当这种抗 体_抗原复合物到达测试区时，它们将被那里的抗体结合，并产生类似于抗体上的标记的 颜色。颜色强度会随着时间的增加而增加，并在约1小时后达到最大值。对定量分析来说，优选约10分钟的孵育时间，正如快速测试中预期的一样得到快速的结果。除测试区以外， 类似地颜色对照区也将出现在测试条带中与应用对照抗体的区域对应的位置。该区域发挥 的作用是确认样品已被应用，干燥蛋白发生溶解，以及进入NC膜的扩散也在发生。为了定 量的目的，有可能使用测试区和对照区的染色强度的比率，以补偿样品垫或NC膜中可能的变化。实施例5 使用横向流动测试检测ERAC定性测试该测试旨在显示样品中是否含有ERAC。该测试是基于使用单克隆抗体 与S100A12分子上单一的独特的表位进行反应。血清通常含有S100A12的钙依赖性低聚 体，使得至少具有两个表位可以与抗体结合，包括那些用有色粒子标记的。因此几乎所有个 体的血清都产生阳性反应，即LFT中为彩色测试线。相反，如果样品中加入适宜浓度的例如 10mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，则只有ERAC阳性样品产生阳性测试反应。阳性ERAC测试是 需要在读数时，例如在添加EDTA的10分钟后，出现一条明显的测试线。更加客观的读取可 以用读取仪器来进行。图6显示了测试ERAC阳性和ERAC阴性的血清样品时的测试模型。 箭头表明ERAC阳性和阴性反应的测试线。实施例6 定量测试上述ERAC横向流动测试的测试区的染色强度可以通过光度测量仪器来确定。图 7显示了一种扫描LFT测试条时的典型的扫描曲线。如图7所示，无论蛋白浓度如何(0至 500ng/ml)，对照区产生同样大小的峰，而测试区的大小随样品中S100A12浓度的增加而增 加。扫描可以使用不同的扫描仪器完成，包括标准的办公文档扫描仪，标准的电脑，如 Lap-Top，以及用于上述图像分析的电脑程序。或者，可以通过移动电话的相机拍摄LFT测 试的测试区的图片，并作为MMS文件发送到中央服务器计算机进行图片分析；将定量结果 可以在短时间内发送回移动电话，典型地为20秒。当测试含S100A12浓度为50到2000ng/ml S100A12的样品，并用扫描仪读数时， 得到的典型标准曲线如图8所示。ERAC的存在可通过测试区确定，对应的浓度高于根据确 定的抽样方案，样品处理和LFT程序确定的某一浓度水平。对于后者来说，抗体的类型和浓 度特别重要。或者，测试区染色强度可以通到比较一系列位于打印视觉模拟评分上的线来 确定。如果染色强度之间的差别大于约15%，则人类肉眼可以看出该差别。图9显示相同 的LFT测试条的扫描仪读数和视觉模拟读数之间的相互关系。
权利要求
用于检测样品中ERAC存在的试剂盒，其中样品中的二价金属离子已被除去，所述试剂盒包括i)一固体载体，ii)一与所述固体载体结合的第一目标物，当与该固体载体接触的样品中存在ERAC时，所述目标物能够直接检测ERAC，和iii)至少一个标记。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一目标物选自抗原；半抗原；单克隆抗体和 多克隆抗体；基因探针；天然的和合成的寡核苷酸和多核苷酸；天然的和合成的单糖、寡糖 和多糖；凝集素；亲合素和链霉亲合素；生物素；生长因子；激素；受体分子；蛋白质A ；和蛋 白质G。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述第一目标物选自单克隆抗体和多克隆抗体。
4.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述第一目标物能够特异性结合ERAC。
5.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述第一目标物是能够特异性结合 ERAC的抗体。
6.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述标记选自颜色、染料、磁性粒子、重 原子标记、金粒子、乳胶、荧光标记、发色团、荧光团、荧色物、冷光、磷光、放射性标记和酶标 记。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述标记选自马来酰亚胺化合物，bimane化合物 和卤乙酰胺化合物。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述标记选自有荧光或芳香基团的化合物，该基 团直接连接到该化合物或经共价结合连接体间接地连接到该化合物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述荧光基团选自荧光酮、罗丹明、吖啶、青色素、 硫堇、藏红、香豆素和菲啶。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述荧光基团或芳香基团可以带有取代基，并由 此增强或减弱它们的水溶性和/或被样品吸收的能力。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述荧光酮荧光基团选自CFDA-SE、CFSE、钙黄绿 素、羧基荧光素、曙红、赤藓红、荧光黄、氨基荧光素、异硫氰酸荧光素、印度黄或汞溴红。
12.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述罗丹明荧光基团选自罗丹明、磺基罗丹明 101、磺基罗丹明B或德州红。
13.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述吖啶荧光基团选自吖啶橙或吖啶黄。
14.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述青色素荧光基团选自Di0C6或SYBR绿。
15.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述菲啶荧光基团选自溴化乙啶和碘化丙啶。
16.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述芳香基团选自苯基、萘基、蒽、吖啶氟、吡 啶、嘧啶、嘌呤或吲哚。
17.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括i)与所述第一目标物结合的载体分子。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述载体分子是包括多个至少一个反应性官能 团的聚合物载体分子。
19.如权利要求17或18所述的试剂盒，其中所述载体分子选自聚合物，包括天然和合 成的多糖；同素缩合氨基酸；天然或合成的多肽和蛋白质；以及合成的有亲核官能基团的 聚合物。
20.如权利要求17-19任一项所述的试剂盒，其中所述载体分子选自聚合物，包括聚乙 烯醇、聚丙烯醇、聚乙二醇和取代聚丙烯酸酯。
21.如权利要求17-20任一项所述的试剂盒，其中所述载体分子选自葡聚糖、羧甲基葡 聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物和天然胶。
22.如权利要求17-21任一项所述的试剂盒，其中所述载体分子是葡聚糖。
23.如权利要求17-22任一项所述的试剂盒，其中所述载体分子选自羟乙基纤维素和 羟丙基纤维素。
24.如权利要求17-23任一项所述的试剂盒，其中所述载体分子被标记。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中该标记为权利要求6所述的标记。
26.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括i) 一对照蛋白，和 ) 一能够与所述对照蛋白特异性结合的第二目标物。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述第二目标物为权利要求2或3所述的物质。
28.如权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述第二目标物是能够与所述对照蛋白特 异性结合的抗体。
29.如权利要求26-28任一项所述的试剂盒，其中所述能够与所述对照蛋白特异性结 合的第二目标物的至少一部分被标记，由此构成标记的第二目标物，并且其中所述能够与 所述对照蛋白特异性结合的第二目标物的至少一部分没有被标记，由此构成非标记的第二 目标物。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述对照蛋白和所述标记的第二目标物被包含 于所述固体载体的结合区。
31.如权利要求29或30所述的试剂盒，其中所述非标记的第二目标物与所述固体载体 的对照区结合。
32.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述能够直接检测ERAC的第一目标物 的至少一部分没有被标记，由此构成非标记的第一目标物。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述非标记的第一目标物的至少一部分与所述 固体载体的测试区结合。
34.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述能够直接检测ERAC的第一目标物 的至少一部分包括至少一个所述标记，由此构成标记的第一目标物。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述固体载体在所述固体载体的结合区包括标 记的第一目标物。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中包含于所述固体载体的结合区的所述标记的第 一目标物与ERAC低聚体结合。
37.如权利要求35或36所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于施加样品的应 用区。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述应用区与所述结合区全部或部分地重叠。
39.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括i) 一标准区，包括至少一个区域包含预定量的被标记的第三目标物结合的ERAC。
40.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述第三目标物是权利要求2-5任一项所述的 目标物。
41.如前面任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒是横向流动装置或微流系统。
42.制备如前面任一项权利要求所述的试剂盒的方法，所述方法包括步骤 i)提供一固体载体， )将标记的第一目标物添加到所述固体载体的结合区，当与该固体载体接触的样品 中存在ERAC时，该标记的第一目标物能够直接检测ERAC，iii)将非标记的第一目标物添加到所述固体载体的测试区。
43.如权利要求42所述的方法，所述方法进一步包括步骤i)将对照蛋白和能够与所述对照蛋白结合的标记的第二目标物添加到所述结合区，并 且将能够结合所述对照蛋白的非标记的第二目标物添加到所述固体载体的对照区。
44.如权利要求42或43所述的方法，所述方法包括步骤i)将标准品添加到所述固体载体的标准区，其中所述标准品包含预定量的被标记的第 三目标物结合的ERAC。
45.如权利要求42-44任一项所述的方法，其中包含在所述固体载体的结合区中的所 述标记的第一目标物与ERAC结合。
46.如权利要求1-44任一项所述的试剂盒在检测或定量样品的ERAC中的用途。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述样品选自生物样品、体液样品、滑液、血液、血 清、血浆、尿液、粪便、组织、唾液、粘液、喀痰、伤口液、结膜液、鼻分泌物、咽分泌物、漱口水、 支气管冲洗水、宫颈分泌物、阴道分泌物、腹水、水疱、病灶渗出物和脑脊髓液。
48.如权利要求46或47所述的用途，其中所述样品已经用二价金属离子螯合剂处理。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述二价金属离子螯合剂是EDTA。
50.检测ERAC的方法，包括步骤 i)提供一样品， )除去所述样品中的二价金属离子，由此减少或消除样品中游离二价金属离子的量，iii)提供一标记的第一目标物，当所述样品中存在ERAC时，该第一目标物能够直接检 测 ERAC，iv)使所述处理的样品与所述标记的第一目标物接触，和 ν)检测与所述标记的第一目标物结合的ERAC的存在。
51.如权利要求50所述的方法，包括额外的步骤 iv. a)提供能够与ERAC结合的第二目标物，和 iv. a)使所述样品与所述第二目标物接触。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中步骤iii)提供的所述标记的第一目标物与 S100A12低聚体结合。
53.如权利要求50-52任一项所述的方法，其中所述样品为权利要求47-49任一项中指 定的样品。
54.如权利要求50-53任一项所述的方法，其中所述标记的第一目标物是用权利要求 6-16任一项中指定的标记物来标记的。
55.如权利要求50-54任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二目标物选自权利要 求2-5任一项所述的目标物。
56.如权利要求50-55任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二目标物与载体分子纟口口。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述载体分子是权利要求18-25任一项所述的载 体分子。
58.如权利要求50-57任一项所述的方法，其中所述方法不包括天然S100A12的检测。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述天然S100A12形成低聚体，当用二价金属离子 螯合剂处理时，该低聚体分离成单体。
60.如权利要求50-59任一项所述的方法，其中通过用二价金属离子螯合剂，如EDTA处 理所述样品除去所述二价金属离子。
61.如权利要求50-60任一项所述的方法，其中所述样品是权利要求47-49任一项所述 的样品。
62.量化样品中存在的ERAC的量的方法，所述方法包括步骤 i)提供权利要求1-41任一项所述的试剂盒， )提供样品，iii)使所述样品与所述试剂盒接触，iv)检测所述样品中ERAC的存在，和ν)量化所述样品中检测到的ERAC的量。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述样品是权利要求47-49任一项所述的样品。
64.量化样品中存在的ERAC的量的方法，所述方法包括步骤 i)执行权利要求50-61任一项所述的方法，和 )量化与所述第一目标物结合的ERAC的量。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述量化是通过与标准品进行视觉比较来进行。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述量化是通过数字图像分析来进行。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述数字图像分析包括步骤 i)获得代表与所述标记的第一目标物结合的ERAC的数字图像， )分析所述数字图像，所述分析产生一结果，其中所述结果是对与所述标记的第一目 标物结合的ERAC量的测量，iii)可选地，将所述结果与标准和/或对照品进行比较。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述数字图像是通过数码摄影或扫描获得，并且 接着被发送和/或储存到计算机系统或计算机可读介质上。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述图像是通过自动扫描或摄影程序获得， 并且接着被发送和/或储存到计算机系统或计算机可读介质上。
70.如权利要求67-69任一项所述的方法，其中步骤ii)的所述分析是通过测量所述标 记的第一抗体的标记强度来进行。
71.如权利要求70所述的方法，其中将所述标记强度与标准进行比较。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述标准是标准曲线，其中标记的不同强度反映 与标记的第一抗体结合的S100A12低聚体的不同预定量。
73.如权利要求67-72任一项所述的方法，其中所述对照表示标记的背景水平。
74.如权利要求68-73任一项所述的方法，其中所述数字图像是通过数码摄影获得，并 且接着通过多媒体传送服务(MMS)从发送机传送至计算机分析系统形式的接收机。
75.如权利要求64-74任一项所述的方法，其中所述方法的结果被自动以电子方式传 送至接收机。
76.分析样品或个体的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求50-61任一项检测样品中ERAC的存在，或根据权利要求62-75任一项 量化样品中ERAC的量，和 )定性或定量地检测所述样品中至少一个其他免疫标记的存在。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述至少一个其他免疫标记选自S100A1、S100A2、 S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、S100A13、 S100A14、S100A15 和 S100A16。
78.监测样品中ERAC的存在的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求50-61任一项检测体液样品中ERAC的存在，或根据权利要求62-75任 一项量化样品中ERAC的量，和 )可选地，以预定的时间间隔，重复步骤i)。
79.诊断临床情况的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求50-61任一项检测样品中ERAC的存在，或根据权利要求62-75任一项 量化样品中ERAC的量，或根据权利要求76或77进行分析，或根据权利要求78进行监测， 和 )诊断所述临床情况。
80.预测个体中临床情况的后果或进展或发展或复发或缓解的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求50-61任一项检测样品中ERAC的存在，或根据权利要求62-75任一项 量化样品中ERAC的量，或根据权利要求76或77进行分析，或根据权利要求78进行监测， 和 )确定所述个体的病情预测。
81.处理临床情况的方法，所述方法包括步骤i)在需要的个体中，减少所述个体的体液中存在的ERAC的量。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述方法包括施予能够减少所述个体体液中存在 的ERAC的量的药剂。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述药剂能够使ERAC分解成S100A12单体。
84.如权利要求81所述的方法，其中所述方法包括过滤和/或透析所述个体的所述体液。
85.如权利要求81所述的方法，其中所述方法包括更换所述个体的所述体液。
86.如权利要求81-85任一项所述的方法，其中所述体液选自滑液、血液、血清、血浆、 结膜液和脑脊髓液。
87.处理临床情况的方法，所述方法包括步骤i)将能够与ERAC竞争结合受体的化合物施予需要的个体。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述化合物是天然S100A12低聚体。
89.如权利要求87或88所述的方法，其中所述受体是高级糖基化终产物(RAGE)的受体。
90.处理临床情况的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求78监测ERAC的存在，和 )根据权利要求81-85任一项处理该临床情况。
91.处理临床情况的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求79进行诊断，和 )根据权利要求81-85任一项处理该临床情况。
92.处理临床情况的方法，所述方法包括步骤i)根据权利要求80进行病情预测，和 )根据权利要求81-85任一项处理该临床情况。
93.如权利要求81-92任一项所述的方法，其中通过使用抗炎剂，将所述方法与所述临 床情况的处理相结合。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述抗炎剂选自留体抗炎剂、非留体抗炎剂、或与 发炎过程中涉及的一种或多种酶或细胞因子反应或抑制该一种或多种酶或细胞因子的物 质，优选地为抗体。
95.如权利要求79-94任一项所述的方法，其中所述临床情况选自慢性和急性炎症状 态、自身免疫疾病、癌症、肾脏疾病或机能失常、心血管疾病和感染。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述临床情况选自传染性疾病放射菌病、腺病毒 感染、炭疽病、细菌性痢疾、肉毒梭菌中毒、由B. melitensis和B. suis引起的布鲁氏杆菌 病(班氏病)、念珠菌症、蜂窝组织炎、软性下疳、霍乱、球孢子菌病、急性无热结膜炎、膀胱 炎、皮肤真菌病、细菌性心内膜炎、会厌炎、丹毒、类丹毒、肠胃炎、生殖器疱疹、腺病、淋病、 肝炎、病毒性肝炎、组织胞浆菌病、脓疱病、疟疾、单核白血球增多症、流行性感冒、军团病、 细螺旋体病、莱姆病、类鼻疽病、髓膜炎、诺卡菌病、星形诺卡氏菌病、非淋菌性尿道炎、品他 病、肺炎球菌肺疾病、脊髓灰质炎、原发性肺部感染、伪膜性肠炎、与抗生素有关的产后败血 症、狂犬病、回归热、风湿热、洛基山斑疹热、风疹、麻疹、葡萄球菌性烫伤样皮肤综合症、链 球菌性咽炎(链球菌性喉炎)、梅毒、破伤风、中毒性休克综合症、弓形体病、肺结核、兔热 病、伤寒症、斑疹伤寒症、阴道炎、水痘、疣、百日咳、印度痘(雅司病)和黄热病。
97.如权利要求95所述的方法，其中所述临床情况选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性咽 炎、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、炎性肠病、炎 性肌病、盆腔炎性疾病、子痫前症、再灌注损伤、风湿性关节炎、干燥症、移植排异和脉管炎。
98.如权利要求95所述的方法，其中所述临床情况选自动脉瘤、心绞痛、动脉粥样硬 化、脑溢血、脑血管疾病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压、心肌梗死、稳定型心绞 痛、中风和不稳定型心绞痛。
99.如权利要求95所述的方法，其中所述临床情况为风湿性关节炎。
100.如权利要求95所述的方法，其中所述临床情况为干燥症。
101.如权利要求95所述的方法，其中所述临床情况为子痫前症。
102.识别与ERAC竞争结合受体的化合物的方法，所述方法包括步骤 i)提供 ERAC， )提供ERAC与之结合的受体，iii)提供至少一种非ERAC化合物，iv)测试所述非ERAC化合物与ERAC受体的结合。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述受体是RAGE。
104.计算机可读介质，包括对实施权利要求64-75任一项所述方法的说明。
105.一种适用于实施权利要求64-75任一项所述方法的自动化系统，包括结合 i)能够包括多个数字图像的数据库， )软件模块，用于分析数字图像中的多个像素，iii)控制模块，包括对实施权利要求64-75任一项所述方法的指令。
106.可加载到计算机内存中的软件程序，所述程序包括对实施权利要求64-75任一项 所述方法的指令。
107.一种包括多个S100A12单体或低聚体的多肽复合物，其中S100A12的单体有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列TKLEEHLEGI VNIFHQYSVR KGHFDTLSKG ELKQLLTKELANTIKNIKDK AVIDEIFQGL DANQDEQVDF QEFISLVAIALKAAHYHTHK E (SEQ ID NO :1)，或者与 SEQ ID NO 1 基本相同的氨基酸序列。
108.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述复合物有至少500kDa的分子量、如 至少800kDa、如至少lOOOkDa、如至少1200kDa、如至少1400kDa、如至少1600kDa、如至少 1800kDa、如至少 2000kDa。
109.如权利要求1所述的多肽复合物，其中在存在低浓度的EDTA时，如5mM，所述复合 物的S100A12单体或低聚体不降解。
110.如权利要求1所述的多肽复合物，其中当用60mM巴比妥缓冲液，pH8. 8，以2V/cm 在琼脂糖凝胶中运行2小时时，所述复合物具有与α 2至β 2球蛋白相当的电泳迁移率。
111.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述复合物有5.5至7. 5的pi。
112.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述复合物有反应性，特征是当在像 DEAE-琼脂糖凝胶这样的弱阴离子交换材料上进行离子交换色谱时，其在约200mM钠下被 洗脱。
113.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述复合物进一步包括选自人细胞内或细 胞外的蛋白质的多肽。
114.一种药物组合物，包括权利要求107-113任一项所述的多肽复合物和药学上可接 受的载体。
115.一种抗体，或其结合片段，其特异性针对权利要求107-113任一项所述的多肽。
116.如权利要求115所述的抗体，其中所述抗体与ERAC特异性地结合。
117.如权利要求116所述的抗体，其中所述抗体不与天然S100A12低聚体结合。
118.如权利要求115所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。8
119.如权利要求115所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
120.如权利要求115所述的抗体片段，其中所述抗体片段包括选自F(ab')2、F(ab)2、 Fab'和Fab的抗体的一部分。
121.如权利要求115所述的抗体片段，其中所述抗体片段是与特异性抗原结合的合成 的或基因工程多肽。
122.如权利要求115所述的抗体片段，其中所述抗体片段选自包括轻链可变区或由轻 链可变区组成的抗体片段；包括"Fv"片段或由"Fv"片段组成的抗体片段，该"Fv"片 段由重链和轻链可变区组成；包括重组单链多肽分子或由重组单链多肽分子组成的抗体片 段，其中轻链和重链可变区通过肽连接头(“scFv蛋白")连接，以及包括最小识别单位或 由最小识别单位组成的抗体片段，该最小识别单位由模拟高变区的氨基酸残基组成。
123.如权利要求115所述的抗体，其中所述抗体是重组蛋白形式的嵌合抗体，其包含 来源于啮齿类动物的可变区和互补决定区，而该抗体分子的余下部分来源于人抗体。
124.如权利要求115所述的抗体，其中所述抗体是重组蛋白形式的人源化抗体，其中 将小鼠单克隆抗体的互补决定区从小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链转移到人可变 域。
125.如权利要求115至124任一项所述的抗体，进一步包括可检测的分子或原子形式 的标记，或者与可检测的分子或原子形式的标记相关联，该标记可以结合到抗体基团上，以 产生易于检测的基团。
126.如权利要求125所述的抗体，其中所述标记选自螯合剂、光敏剂、放射性同位素、 荧光剂和顺磁离子。
127.与权利要求116或117的抗体特异性结合的任何多肽。
128.包括权利要求107-113任一项所述的多肽复合物的宿主细胞。
129.如权利要求128所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
130.如权利要求128所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非人类宿主细胞。
131.如权利要求128所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物细胞、真菌细胞、酵 母细胞和细菌细胞。
132.包括权利要求128所述的宿主细胞的转基因动物。
133.如权利要求132所述的转基因动物，其中所述转基因动物是非人类动物。
134.一种用于检测体液样本中的权利要求107-113任一项所述的多肽复合物的试剂 盒，所述试剂盒包括a)用于获取一定量的体液样品的工具，和b)用于对分析检测所述样 本中是否存在所述多肽聚合物的说明或试剂。
135.如权利要求134所述的试剂盒，进一步包括含有EDTA或类似的钙结合物质的溶液。
136.—种检测样品中的权利要求107-113任一项所述多肽复合物的方法，所述方法包 括步骤a)提供含有权利要求107-113任一项所述的多肽复合物的样品，b)提供权利要求 115-126任一项所述的抗体，c)将该样品与该抗体接触，和d)检测所述样品中的权利要求 107-113任一项所述的多肽复合物。
137.—种从进一步包括蛋白质物质和/或生物分子的样品中纯化权利要求107-113 任一项所述的多肽复合物的方法，所述方法包括步骤根据所述多肽复合物的一个或多个物理或功能特征，从所述样品的至少一部分蛋白质物质和/或生物分子中分离权利要求 107-113任一项所述的多肽复合物；以及通过从所述样品的至少一部分蛋白质物质和/或 生物分子中分离所述多肽复合物，纯化权利要求107-113所述的多肽复合物。
138.如权利要求137所述的方法，进一步包括分离权利要求107-113所述的多肽复合 物的步骤，其中所述分离得到含有大于99% (w/w)的所述多肽的组合物。
139.—种诊断患者的心血管(CV)疾病的方法，所述方法包括步骤a)获得患者的体液 样品，b)用二价金属离子螯合剂孵育所述样品，和c)检测所述样品中的权利要求107-113 所述的多肽复合物，其中所述检测与所述患者的CV疾病呈正相关。
140.一种预测患者的心血管(CV)疾病发展的可能性的方法，所述方法包括步骤a)获 得患者的体液样品，b)用二价金属离子螯合剂孵育所述样品，和c)检测所述样品中的权利 要求107-113所述的多肽复合物，其中所述检测与所述患者的CV疾病的发生可能性呈正相 关。
141.如权利要求139和140任一项所述的方法，其中所述患者已被诊断患有风湿性关 节炎，或者正面临患风湿性关节炎的风险。
142.如权利要求139-141任一项所述的方法，进一步包括治疗所述患者以便预防和/ 或缓解和/或治疗和/或监测所述患者的CV疾病的步骤。
143.一种诊断患者的风湿性关节炎的方法，所述方法包括步骤a)获得患者的体液样 品，b)用二价金属离子螯合剂孵育所述样品，和c)检测所述样品中的权利要求107-113所 述的多肽复合物，其中所述检测与所述患者的风湿性关节炎呈正相关。
144.一种预测患者的风湿性关节炎发展的可能性的方法，所述方法包括步骤a)获得 患者的体液样品，b)用二价金属离子螯合剂孵育所述样品，和c)检测所述样品中的权利要 求107-113所述的多肽复合物，其中所述检测与所述患者的风湿性关节炎的发生可能性呈 正相关。
145.如权利要求143和144任一项所述的方法，进一步包括治疗所述患者以便预防和 /或缓解和/或治疗和/或监测所述患者的风湿性关节炎的步骤。
146.一种从有需要的患者的体液，如血液中除去权利要求107-113任一项所述多肽复 合物的方法，所述方法包括步骤检测所述患者的所述体液中的权利要求107-113任一项 所述的多肽复合物，以及从所述体液中除去权利要求107-113任一项所述的多肽复合物。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述患者患有心血管疾病。
148.如权利要求146所述的方法，其中所述患者患有风湿性关节炎。
149.一种识别权利要求107-113任一项所述的多肽复合物结合到RAGE (高级糖基化终 产物受体)的拮抗剂的方法，所述方法包括步骤a)使候选拮抗剂与权利要求107-113任 一项所述的多肽复合物接触，和b)确定所述候选拮抗剂对权利要求107-113任一项所述的 多肽复合物的结合亲和力，其中所述候选拮抗剂与权利要求107-113任一项所述多肽复合 物的高结合亲和力表明所述候选拮抗剂能够结合权利要求107-113任一项所述的多肽复 合物，并且竞争性地抑制权利要求107-113任一项所述的多肽复合物与RAGE的结合。
150.一种在宿主细胞中生产权利要求107-113所述的多肽复合物的方法，所述方法包 括步骤提供编码权利要求107-113任一项所述的多肽复合物的多核苷酸，以及在所述宿 主细胞中表达所述多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及在人生物材料中发现一种新蛋白复合物，其可用于诊断和其他目的。本发明进一步涉及与所述蛋白复合物有关的产品，方法和用途。
文档编号G01N33/564GK101903775SQ200880112227
公开日2010年12月1日 申请日期2008年10月17日 优先权日2007年10月19日
发明者安尼特·拉森, 托尔·马格内·马德兰, 约翰·G·布龙, 马格内·K·法格霍尔 申请人:Erac股份有限公司