抗凝血酶多肽的制备方法

专利名称：抗凝血酶多肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及已从水蛭Hirudinaria manillensis分离出的具有抗凝血酶活性的多肽的制备方法。
最普通的抗凝剂肽可能要数水蛭素一类。最初由医用水蛭(Hirudo medicinalis)中分离出的水蛭素是人们非常熟悉且经过充分鉴定的凝血酶的多肽类抑制剂(1，2)。更具体地说，它是通过离子反应结合凝血酶，从而防止血纤维蛋白原裂解为血纤维蛋白，并进而防止血纤维蛋白凝块的形成。在动物研究中已证实水蛭素能有效地预防静脉血栓形成、血管旁路闭塞以及凝血酶诱导的弥漫性血管内凝血。另外，水蛭素显示出低毒性，很少或没有抗原性，且其从循环中清除的时间极短。
已从另一种水蛭，水蛭Hirudinaria manillensis中分离出具有抗血活性的多肽(EP-A-0347376和WO90105143)。该水蛭被认为是比医用水蛭更为有利，因此可合成其氨基酸序列不同于水蛭素和其它已知的水蛭素变体之氨基酸序列的抗凝剂肽。
本发明人已对自Hirudinaria manillensis的一种制剂进行了分析，发现了三种新的具有抗凝血酶活性的多肽。因此，本发明提供了包括如下氨基酸序列的多肽及其药用的盐
(i)P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met20 25 30Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa;
65(ii)P2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa;或(iii)P3Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly;
35 40
氨基酸残基是按三联密码子表示的(Eur·J·Biochem.138，9-37，1984)。残基Yaa代表Asp或Tyr，Zaa为-OH、-NH2或Gly-OH。盐可以是酸加成盐。它们可以是与氢卤酸(如盐酸)、硫酸、磷酸或焦磷酸等无机酸形成的盐，也可以是与苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙酸、乳酸、棕榈酸、硬脂酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸或柠檬酸等有机酸形成的盐。多肽也含有游离羧基，因此可以作为钠盐、钙盐、钾盐、镁盐、铵盐或与生理上可耐受的有机含氮碱形成的盐的形式存在。多肽也可以是内盐形式的。
因此，本发明的多肽主要由氨基酸序列(ⅰ)至(ⅲ)组成。从Hirudinaria manillensis分离出的天然多肽具有氨基酸序列(ⅰ)或(ⅱ)(其中Yaa为Asp，Zaa为-OH)或具有部分氨基酸序列(ⅲ)。可对本发明的多肽进行分离和纯化以用作抗凝血酶剂。
所产生的多肽前面可按有全部或部分前导序列。相对于获得多肽的细胞来说，该前导序列可以是天然或外源前导序列。该前导序列能够指导多肽从细胞中分泌。本发明的两种天然多肽在表达时带有后来被切掉的前导序列。因此，可呈现该前导序列的全部或一部分，该序列为Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Glu Ala。
本发明的天然多肽或其盐可通过自Hirudinaria manillensis水蛭的组织或分泌物中分离所说的多肽或其药用盐而制得。更具体地说，可按照WO90/05143中所述方法制备并对所得制剂进行高压液相层析而得到本发明的多肽。
也可按如下方法制备本发明的多肽或其盐(a)提供宿主，在适于在宿主内表达该多肽的条件下用含有编码该多肽之DNA序列的表达载体转化之，(b)分离如此获得的所说多肽或其药用盐。
该方法基本上是基本获得编码希望表达的多肽的核苷酸序列并在重组生物体内表达之。培养经过遗传修饰的生物体即可产生显示出全部生物学活性的所需产物。因此，本发明还提供了-一种包含了编码本发明多肽之DNA序列的表达载体;
-一种被本发明的相容性表达载体转化了的宿主;
-一个编码本发明多肽的DNA序列。
本发明的多肽能够在其中表达的宿主是通过用本发明的相容性表达载体转化宿主而制得的。可按如下方法制备表达载体(a)化学合成编码本发明多肽的DNA序列;
(b)将该DNA插入表达载体。
还可按如下方法制备表达载体(a)从Hirudinaria manillensis水蛭的mRNA产生和分离编码本发明多肽的cDNA;
(b)将分离的cDNA插入表达载体。
然后通过在适于多肽表达的条件下提供被转化宿主而制得本发明的多肽。当使用真核宿主时，可获得被糖基化的多肽。可分离多肽本身或其药用的盐。按照这一方法，可获得纯的本发明多肽或其盐。
可通过在任一端或两端同时延长氨基酸的方式对本发明的多肽进行修饰。当然，由该延长序列组成的多肽必须仍然显示出抗凝血酶活性。例如，可在任一末端或两端提供一长达30个氨基酸残基的短序列。
可对本发明的多肽进行一种或多种转译后修饰，如硫酸化、羧基酰胺化、酰化或多肽链的化学改变。例如，可用肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM酶)对其羧基末端具有甘氨酸残基的多肽进行酶促酰胺化。
为了以DNA重组技术产生抗凝血酶多肽，制备了编码本发明多肽的基因。DNA编码序列一般不包括内含子。分离和纯化该DNA序列。将该基因插入到能够促使重组产物产生的表达载体中。该DNA序列可以是cDNA序列，也可以是合成的DNA序列。合成基因通常是通过用化学方法合成完全对应于所需基因的寡核苷酸，然后对这些寡核苷酸进行装配而制得的。
因此，可从六个化学合成的寡核苷酸构建基因，每一寡核苷酸均代表双链DNA基因之一条链的大约三分之一。将这些寡核苷酸连接并退火即得到所需的基因。根据需要，可通过定点诱变对该基因序列进行修饰，使一个或多个密码子发生改变。为了有助于随后的操作，通常在基因的每一末端构建限制性酶切位点。
也可提供一种还编码上面所述的前导序列的DNA序列。该前导序列能够指导多肽自表达它的细胞中分泌。编码前导肽的序列通常被融合至编码多肽之DNA序列的5端。
当需要在细菌宿主(如大肠杆菌)中进行表达时，前导肽可以是Omp A前导肽。当在昆虫细胞中进行表达时，前导肽可以是水泡性口腔炎病毒G蛋白(VSVG蛋白)。编码Omp A和VSV G蛋白前导序列的合适DNA序列为
Omp A前导序列ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT 42TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC 63VSV G蛋白前导序列ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG 42AAT TGC 48可提供编码一融合蛋白的DNA序列，该融合蛋白能够被切断而释放出本发明的多肽。可使用编码载体多肽序列的DNA序列，该载体多肽序列则通过可断裂的连接键与本发明多肽的N末端相融合。可断裂的连接键可以是能被溴化氰裂解的连接键。
为了表达多肽而构建了一表达载体，它包括编码多肽的DNA序列且在加至合适的宿主中时能够表达该多肽。还提供了合适的转录和转译控制成分，包括DNA序列的启动子、转录终止位点以及转译起始和终止密码子。DNA序列是以正确读码的形式提供，以保证多肽在与载体相容的宿主中被表达。
表达载体通常包括一复制起点，并根据需要还包含一选择标记基因，如抗生素抗性基因。启动子是被可操纵地连接至编码多肽的DNA序列上的。表达载体可以是核粒。在这种情况下，最好是将选自Ptrp和Plcc/lac的启动子可操纵地连接到DNA序列上。表达载体也可以是病毒。该病毒可以是重组杆状病毒，其中将多角体启动子被可操纵地连接到编码多肽的DNA序列上。
可以任何方便的方式制备能够表达多肽的表达载体。可将编码多肽的DNA片段插入到表达载体(如核粒载体)的合适限制性酶切位点中。重组杆状病毒可按以下方法制备(ⅰ)在多角体启动子下游的限制性位点将编码多肽的基因克隆到杆状病毒转移载体中;
(ⅱ)用步骤(ⅰ)的重组转移载体和完整的野生型杆状病毒DNA共转染易受杆状病毒感染的昆虫细胞。
同源重组发生后产生重组杆状病毒，它携带了位于多角体启动子下游的多肽基因。杆状病毒转移载体可在多角体ATG起始密码子的下游具有一独特的克隆位点。由所产生的重组杆状病毒随后表达的产物将是一种融合蛋白质，其中多角体蛋白的N-末端部分被融合到多肽的N-末端上。如上所述，可在融合连接处提供可断裂的连接键。
步骤(ⅱ)中所用的昆虫细胞通常为草地粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞。野生型杆状病毒通常为苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)。
将编码多肽的表达载体提供给合适的宿主，用多肽基因转化细胞。在适于使多肽在其中表达的条件下提供转化的宿主。例如，对转化细胞进行培养以保证发生表达。可使用任何相容性宿主一载体系统。
转化的宿主既可以是原核宿主，也可以是真核宿主。可使用细菌或酵母宿主，如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)。可使用革兰氏阳性细菌。优选的细菌宿主是大肠杆菌B型菌株。也可使用昆虫细胞，在这种情况下杆状病毒表达系统比较合适。昆虫细胞通常是草地粘虫细胞。另外还可以转化哺乳动物细胞系的细胞。可提供产生多肽的转基因动物，如除人之外的哺乳动物。
被表达的多肽可被分离和纯化。可得到具有任一前面所述的氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的多肽，所有这些序列均由转译起始密码子编码的Met残基引导。或者如上所述，可获得一融合蛋白质，它包括与载体序列相融合的本发明多肽的氨基酸序列即上述的序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)。当在融合蛋白质的氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)与载体序列之间提供一合适的连接键时，可通过用合适的试剂裂解连接键而释放出具有氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的多肽。
本发明的多肽或其可药用的盐也可按如下方法制备(a)用化学方法合成所说的多肽，(b)分离由此获得的多肽或其药用盐。
因此，可通过化学合成的方法按照所需多肽序列的顺序由单个氨基酸和/或两个或多个氨基酸预成的肽组构该多肽。可以使用固相或液相方法。可根据需要将所产生的多肽转化为其药用盐。
在固相合成法中，所需多肽的氨基酸序列是从结合至不溶性树脂上的C-末端氨基酸逐步组构成的。当所需的多肽产生后，将其从树脂上裂解下来。当使用液相合成法时，可同样从C-末端氨基酸开始组构所需的多肽。该氨基酸的羧基始终被合适的保护基所保护，并在合成结束时除去保护基。
无论是使用固相还是液相技术，加到反应系统中的每一个氨基酸通常具有被保护的氨基以及活化的羧基。侧链官能团也被保护。在合成过程中的每一步骤之后均除去氨基保护基团。而侧链官能团则通常是在合成结束后再除去。
可将多肽转化为药用盐。可用有机或无机酸将其转化为酸加成盐。合适的酸包括乙酸、琥珀酸和盐酸。另外也可将肽转化为羧酸盐如铵盐或碱金属盐如钠盐或钾盐。
可将多肽或其药用盐与药用的载体或其赋形剂一起用于药用组合物中。该配方通常是通过静脉注射使用(在这种情况下载体通常是具有相当纯度的无菌盐水或水)。本发明的多肽是一种抗凝血酶，适用于治疗主要是人类的血栓形成性疾病，如血液凝固。因此，该多肽可在血液透折、血液分离以及体外血液循环中用于治疗和预防血栓形成和血栓栓塞(包括预防手术后的血栓形成)、用于急性休克治疗(例如治疗脓毒性或多创伤性休克)以及用于治疗消耗性凝血病。在另一实施方案中，可将本发明的多肽或其盐与纤维蛋白溶酶原激活剂(如组织纤维蛋白溶酶原激活剂)一起使用。
所用的剂量主要取决于具体的服用方式以及治疗或预防的目的。个体剂量的大小以及给药的方法可根据对个体疾病的具体情况的判断而定。为此目的所需之测定相关血液因子的方法是本领域熟练技术人员所熟知的，一般在注射情况下，治疗有效量的本发明化合物的剂量范围为每公斤体重约0.005-0.1mg，优选每公斤体重约0.01-0.05mg。给药是通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射的方式进行。相应地，根据给药的方式不同，以单个剂量形式用于胃肠道外给药的药用组合物每份剂量含有约0.4-7.5mg的本发明化合物。除活性成分外，药物组合物还含有为维持PH值在3.5-7之间所需缓冲液(如磷酸盐缓冲液)以及用于调节等渗性所需的氯化钠、甘露醇或山梨醇。这些组合物可以是冷冻干燥形式溶解形式的，含有抗菌活性防腐剂如0.2-0.3%4-羟基苯甲酸甲酯或乙酯的溶液可能更为有利。
局部应用的组合物可以是水溶液、洗剂、凝胶、油性溶液、悬浮液或含脂(尤其是乳化的)软膏。水溶液形式的组合物可通过例如将本发明的活性成分或其药用盐溶于PH为4-6.5的含水缓冲溶液中而制得，并可根据需要加入其它活性成分，如消炎剂和/或聚合粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮)和/或防腐剂。10ml溶液或10g凝胶中活性成分的浓度约为0.1-1.5mg，优选0.25-1.0mg。
适于局部给药的油性组合物是通过例如将本发明的活性成分或其药用盐悬浮于油中而制得的，并可根据需要加入胀溶剂(如硬脂酸铝)和/或HLB值(“亲水-系脂平衡”)低于10的表面活性剂，这类表面活性剂有甘油单硬脂酸酯、脱水山梨醇单目桂酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯或脱水山梨醇单油酸酯。含脂软膏是通过例如将本发明的活性成分或其盐悬浮于可分散的脂肪基质中制得的，并可根据需要加入HLB值低于10的表面活性剂。乳化软膏是通过将本发明的活性成分或其盐在柔软的可分散脂肪基质中进行研磨并加入HLB低于10的表面活性剂而制得的。适于局部应用的所有这些剂型的组合物也可含有防腐剂。10g基质中活性成分的浓度约为0.1-1.5mg，优选0.25-1.0mg。
除了上面所述的组合物以及与其类似而打算在人体或哺乳动物体内直接作医药应用的药用组合物外，本发明还涉及在人体外或哺乳动物体外作医药应用的药用组合物和制剂。这类组合物和制剂主要是被用作血液的抗凝添加剂，而这种血液则正在经受体外循环或处理(例如在人工肾中的体外循环或透析)、贮存或更换(例如血液分离)。这类制剂(如原液或以单一剂量形式存在的不同制剂)在组成上与前面所述的注射制剂相似。但是，活性成分的量或浓度则更为有利地取决于所要处理的血液量，或更准确地说，是取决于其凝血酶的含量。在这一方面应当牢记即使在相对大量的情况下，能够完全灭活约5倍重量凝血酶的本发明活性成分(游离形式)在生理上也是无害的，且即使在高浓度的情况下也能够快速地从循环血液中清除出去，因此即使在输血过程中也没有过量的危险。根据其具体用途，合适的剂量为每升血液约0.01-1.0mg活性成分，但仍可在无危险的情况下超过这一上限。
以下的实施例将举例说明本发明。
在附图中

图1是显示实施例1中HPLC分析结果的层析图。P1至P3代表得自实施例1制品的三个不同的峰，FT表示流出部分，4-AB表示4-氨基苯甲脒。
图2显示得自实施例2(b)胰蛋白酶消化的PE-P1(A)和PE-P2(B)的洗脱曲线。
图3显示编码对应于峰2(P2)之蛋白质的大部分的6个寡核苷酸的核苷酸序列，其中第61位的氨基酸残基为Asp，多肽链最后一个氨基酸残基为Asn64。用黑体字显示的序列代表BalⅠ位点，它已被用于进一步的构建。该图的下半部分显示了6个寡核苷酸的装配模式。为了便于以后的操作而加进了HindⅢ和Pst位点。
图4显示中间体质粒M13-P2的构建方案，它是所用其它P2构建的BalⅠ-Bam H I DNA片段的来源。
图5以图解方式显示新的重组M13(即OMP-P2)的构建，它携带与Omp A前导肽相连的完整P2基因。前导肽序列以黑体表示，而BalⅠ平端和HindⅢ粘性末端则以下划线表示。
图6以图解方式显示pFC-P2的构建，该质粒是用于在大肠杆菌中生产P2蛋白。
图7显示用于在大肠杆菌中生产p2的质粒pOMPA-p2的整体结构。我们使用了常规的基因操作技术来制备这一新质粒，其中p2基因处在杂合启动子PlPP/lac的转录控制之下。即使在这种情况下，OmpA前导肽仍能驱使p2向大肠杆菌周质中分泌。
图8显示用于从昆虫细胞中分泌p2的合成寡核苷酸的核苷酸序列及其装配。以黑体字母表示的序列代表VSVG蛋白前导肽。
图9显示新的重组M13即VSV-P2的构建，其中完整的p2基因与VSVG蛋白前导肽相连。
图10以图解方式显示用作向杆状病毒基因组转移的转移载体的pAC-p2的构建，pACYM1是广泛地用作向病毒转够的异源序列的受体的起始质粒。
图11显示编码p2链起始部分的合成寡核苷酸的核苷酸序列及其装配。编码额外的甲硫氨酸残基的ATG密码子以黑体表示。
图12以图解方式显示pAcFT1的构建，它被用于细胞内的表达。
图13显示新的转移质粒pAcFT1-p2，它携带了与多角体的前18个氨基酸相连的完整p2序列。该质粒已被用于向杆状病毒基因组转移异源序列。
图14图解显示扩增3′末端的RACE方法。在该图中，“＊＊＊TTTT……”代表dT17连接子引物。在每一步骤中附图简化为仅说明如何利用前一步骤中所形成的新产物。
图15显示扩增5′末端的RACE方法。该图中“＊＊＊TTTT…”和“＊＊＊”分别代表dT17连接子引物和连接子引物。其中每一步骤均简化为仅说明如何利用前一步骤所形成的新产物。
实施例1按照下面a)和b)中所述的方法，由WO90/05143所述的Hirudinaria manillensis水蛭制备抗凝血酶制剂。
a)丙酮萃取将乙醇干燥过的水蛭头部(2920g)切成小块，并用40∶60丙酮/水混合液(7.51)处理。于室温下搅拌均匀后，将该混合物以2700rmp的转速离心15分钟。取出上清液，将沉淀物再悬浮于40∶60丙酮∶水的混合液中，搅拌30分钟后将混合物以2700rpm的转速离心15分钟。将上清液与前次的上清液合并，并用冰醋酸(体积8.5升)酸化至PH4.5。该混合物以2700rpm离心15分钟，取出上清液后通过加入30%氨水将溶液的PH调节至6.0。于35℃旋转蒸发后浓缩溶液的PH降至1.8;离心除去沉淀的污染物，使用9倍过量的丙酮从混合物中沉淀出抗凝血酶粗品，将混合物离心，将沉淀物重新悬浮于丙酮中，并再次离心。然后将沉淀物冻干。
b)离子交换纯化将抗凝血酶粗品重新溶于水中，对10mM乙酸铵缓冲液(PH4.0)透析，并加至在同一缓冲液中预平衡过的羧甲基琼脂糖柱(CM Sepharose，Pharmacia，2.6×30cm)上。用100ml起始缓冲液洗柱后，用20mM乙酸铵(PH4.5)洗脱抗凝血酶活性部分，收集并合并之(1.3l)。为了进一步纯化，将合并的部分在Minitan装置(Millipore)中浓缩至0.5l;浓缩溶液用NaOH中和后加至在20mM Tris-Hcl(PH7.0)中平衡过的Q琼脂糖柱上。用起始缓冲液中的0-1M线性梯度Nacl对结合物质进行洗脱。合并含有抗凝血酶活性的部分，通过在Superdex S-200柱上用20mM Tris-Hcl(PH7.5)以4ml/分钟的流速洗脱而将其浓缩并脱盐。自凝胶过滤所获得的活性合并物用Minitan装置浓缩，并用弱阴离子交换层析(DEAE FPLC)法进一步纯化之。将活性材料上pnotein pak DEAE-5pW柱(Watcrs)，并用20mM Tris-Hcl(PH6.5)中的0-1M Nacl线性梯度以1.0ml/min的流速洗脱。合并活性部分，鉴定蛋白质含量及其活性(此活性800ATU/mg)，并在Spedvac浓缩器(Savant)中冷冻干燥。
为了得到均质多肽，接着将由此获得的部分纯化的材料(此活性800ATu/mg)按照下面c)和d)中所述的方法再进行两次附加的层析纯化c)凝血酶-琼脂糖按照Lundblad(＊)所述的方法进一步纯化市售的牛凝血酶(Sigma)。然后将其按照制选考推荐的方法吸附到活化的Sepharose CL 6B柱(Pharncacia)上。用50mM Tris-Hcl(PH8.3)平衡该柱(1.7mL)，并用得自DEAE-FPLC的冻干材料(在缓冲液中重新溶解)上柱。先用起始缓冲液，接着用含有3.0M Nacl的该缓冲液、最后用起始缓冲液三次洗柱，(每一种洗液均三倍于柱体积)。流速为0.3ml/分钟，用25mMHcl中的10ml0.1M4-氨基苯甲脒洗脱结合的材料。合并活性部分，并在PD-10柱(Pharmacia)上在50mM Tris-Hcl(PH8.3)中交换缓冲液。
将用起始缓冲液洗柱洗脱的并仍具有抗凝血酶活性的未结合材料质上柱，直至所有的活性均被结合并层析分离之。
(＊)Lundtlad，R、L.，1971，Biochemistry，102501-2506。
d)RP-HPLC在c4vydac柱(4.6×250mm.5μ)经逆相高压层析(RP-HPLC)对亲和层析后获得的物质进行最后的纯化。用20mM磷酸钠(PH7.5)作为第一洗脱液，然后改用50%的乙腈水溶液作洗脱液。于室温下在45分钟内用5-55%洗脱液B的线性梯度以1.0ml/分钟的流速洗脱抗凝血酶多肽。所得的层析图示于图1中。
手工收集蛋白质峰(220nm处检测)，真空浓缩后在同样条件下再次层析。
在C4HPLC之后对纯的抗凝血酶多肽进行蛋白质含量、氨基酸组成、N-末端序列、C-末端序列检测并通过体外试验(ATU/NIH试验和“凝血酶时间”试验)鉴定其活性。发现三个蛋白质峰均具有抗凝血酶活性。
对胰蛋白酶和V8蛋白酶消化所获得的肽进行N-末端序列分析，可测定出图1中被标为P1和P2的多肽的全部氨基酸序列。其序列在上面的(ⅰ)和(ⅱ)中给出。另一种多肽(P3)的部分氨基酸序列在上面的(ⅲ)中给出。
实施例2对吡啶乙基化(PE)的P1和P2进行胰蛋白酶消化并作出其肽图谱a)还原/烷基化合并在凝血酶-琼脂糖上经亲和层析纯化的活性部分(实施例1c)，并将PD-10柱上的缓冲液换成10mM Tris-Hcl(PH8.3)。将活性合并物(约50μg)在Speed-Vac离心机(Savant)上浓缩，然后在氮气环境中用100μl在6M盐酸胍/50mM Tris-Hcl(PH8.5)中的1%硫基乙醇溶液于暗处室温下处理2小时。再加入4μl4-乙烯基-吡啶(纯净的)，并将混合物于同样条件下再次保温2小时。4首先在c4Vydac柱(4.6×250mm，5μm)上通过RP-HPLC从反应混合物中回收吡啶乙基化的多肽，其中用在0.1%TFA中的5-65%乙腈线性梯度以1.0ml/分钟的流速洗脱90分钟。在这些条件下，抗凝血酶多肽混合物各组分离较差，因此必须在实例1d所述的条件下使用磷酸钠/乙腈洗脱系统在同一柱上再次层析。
b)对PE-P1和PE-P2进行胰蛋白酶消化和给制其肽图谱。
在0.2M磷酸钠存在下，用TPCK处理的胰蛋白酶(Sigma)在200μl1%碳酸氢铵(PH8.0)中的溶液消化己纯化的PE-P1和PE-P2(分别为10和20μg)。按酶与底物的比率为1∶20(W/W)的量加入胰蛋白酶，于37℃保温4小时。然后通过在Savant中冷冻干燥终止消化。
在μBondapak c18柱(3.9×300mm，10μ Waters)或C4-Vydac柱(4.6×250mm，5um)上分离经胰蛋白酶消化所获得的肽，其中用线性梯度为5-65%的乙腈的0.1%TFA溶液的1.0ml/分钟的流速洗脱60分钟(图2)。手工收集洗脱峰，在Savant中浓缩，然后在477A型脉冲液相序列分析仪(Applied Biosystems)上进行氨基酸分析和N-末端序列分析。
对胰蛋白酶消化的PE-P1(A)和PE-P2(B)进行C4-HPLC肽序列分析所得的结果如下片段 氨基酸序列A 1-13 VSYTDCTESGQNY14-26 CLCVGGNLCGGGK27-36 HCEMDGSGNK37-47 CVDGEGTPKPK37-47(＊) CVDGEGX*PKPK48-64 SQTEGDFEEIPDEDILNB 1-13 VSYTDCTESGQNY14-26 CLCVGSNVCGEGK27-47 NCQLSSSGNQCVHGEGX*PKPK48-64 SQTEGDFEEIPDEDILN
(＊)X为通过氨基酸序列分析未测出的残基;x经氨基酸分析确定为T。
因此，P1和P2的完整氨基酸序列为P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys LeuCys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu MetAsp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro LysPro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp GluAsp Ile Leu AsnP2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys LeuCys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln LeuSer Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro LysPro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp GluAsp Ile Leu Asn实施例3P2基因的化学合成基于大肠杆菌所优选的密码子5，设计核苷酸编码序列。而且，在非常靠近合成基因5′末端处加进-BalⅠ限制位点以便将该序列插入到不同的表达载体中，用实际上相同的合成基因在细菌和昆虫细胞中表达重组P2蛋白。在使用昆虫细胞的情况下，所使用的方法将以分泌产物或细胞质产物的形式产生蛋白质P2。
所有质粒DNA的操作均按Maniatis等人所述的方法进行。
用自动DNA合成仪(Applyied Biosystems)制备6个合成的互补寡核苷酸，其序列示于图3中。在酶促磷酸化之后，使用DNA连接酶装配这6个寡核苷酸，并将所产生的双链序列插入到M13噬菌体载体mp18中，得到图4所示的质粒M13-P2。为了使P2基因能够插入M13载体，在合成的寡核苷酸中也加进了HindⅢ和PstⅠ位点。通过对单链噬菌体DNA进行序列分析(Sanger法)证实其具有正确的核苷酸序列。
重组质粒M13-P2为实施例中所用的所有表达载体提供了P2基因来源。
实施例4在大肠杆菌细胞中表达并从中分泌P2蛋白为了使重组产物向周质分泌，有必要合成前蛋白质形式的P2分子。更具体地说，负责有效分泌的称为“前导肽”的氨基酸序列必须出现在P2的NH2末端8，9。而这一额外序列则在分泌过程中在体内被特定的大肠杆菌前导肽酶切除，产生正确的成熟序列10。
文献中叙述过多种分泌系统11，12。我们选择了基于以前公开的大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)之分泌信号的系统。因此，我们设计了两个编码OnpA前导肽的附加互补寡核苷酸，它们的前面是已知负责促使RNA、有效转译的OmpA Shine-Dalgarno序列14。
如图5所示，其序列中也包括了编码前10个氨基酸的P2基因的起始部分。BalⅠ位点的存在使得该合成片段能够与P2编码序列的其余部分相连，而上游HindⅢ位点的存在则使得它能够与M13载体相连。因此，可将合成的HindⅢ-BalⅠ片段与M13-P2的BalⅠ-BamHⅠ片段相连并插入至M13mp18中，从而得到新的质粒OMP-P2。图5也图解显示了该新质粒的构建。
可从OMP-P2中切掉作为Hind Ⅲ-Ban HⅠ片段的P2基因，该片段编码OmpA Shine-Dalgarno和前导肽以及其后的P2编码序列。现在该限制片段准备插入到合适的表达载体中。从理论上讲，可使用多种表达系统以在细菌中高水平地生产异源蛋白质。我们的实验室过去曾成功地使用过基于Ptrp启动子的表达系统14。即使在使用选择的启动子的情况下，给定多肽的表达水平同样是不可预测的。
图6所示的质粒PFC33已在文献中提到14。它携带了氨苄青霉素抗性基因和细菌启动子Ptrp，该启动子驱使前脱脂蛋白A1的表达。在用HindⅢ和BamHⅠ消化pFC33之后，分离出携带抗生素抗性基因和启动子的Hind ⅢBanHⅠ大片段，并将其连接到得自编码P2基因之OMP-P2的Hind Ⅲ Ban H Ⅰ片段上。其构建的具体步骤示于图6中。我们分离出新质粒pFC-P2，它是在大肠杆菌中生产P2的最终质粒。
本发明的目的之一是利用B型大肠杆菌来表达和向周质中分泌P2以及本发明的其它抗凝血酶多肽。事实上我们已发现，将质粒pFC-P2插入大肠杆菌B型菌株中能够高水平地产生P2。令人感兴趣的是，使用不同型的大肠杆菌菌株并不能同样有效地表达，因此似乎宿主菌株的类型是成功生产水蛭素的关键。
可得到几个B型大肠杆菌菌株并将其用于生产P2。优选的菌株是ATCC12407，ATCC11303，NCTC10537。下面是一个用质粒pFC-P2转化菌株NDTC10537并在随后培养该转化株的实例。
利用Mandel和Higa15的氯化钙法制备NCTC10537菌株的感受态细胞。用2μl质粒DNA(浓度约为5μg/ml)转化约200μl浓度为1×109细胞/ml的这些细胞的制剂。在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上筛选转化株。用木牙鉴将两个较小的菌落在含有相同抗生素的L-琼脂上划线(每条线约1cm长)。于37℃保温12小时后，通过将划线部分接种至10mlLB培养基(含有浓度为150μg/ml的氨苄青霉素)中并于37℃保温连夜而试验P2蛋白的产生。第二天将培养物按1∶100稀释至M9培养基(含有相同浓度的氨苄青霉素)中，并于37℃保温6小时。
将20ml该培养物于4℃以12000×g的转速离心10分钟。将细菌沉淀物重新悬浮于2ml33mM Tris-Hcl(pH8)中，然后加入等体积的第二溶液(33mMEDTA，40%蔗糖)，将整个混合物在温和振荡的条件下于37℃保温10分钟。离心后将有通透性的细胞重新悬浮于2ml冷水中并在冰中放置10分钟。离心分离所得到的上清液，此即代表了细菌细胞的周质部分。
利用基于凝血酶对合成底物S-223816切割能力之抑制作用的生色检测法，我们已在产生P2的细胞的周质部分中检测到抗凝血酶活性，但未在对照的周质部分中检测到这一活性。
利用类似的方法，我们也为P2构建出新的表达/分泌质粒，其中的PlPP/lac启动子17代替了Ptrp启动子。这一被称为pCMP-P2的不同质粒示于图7中。将该质粒插入B型大肠杆菌菌株中之后也得到了高水平的活性P2。我们使用了GHrayb等人17所述的质粒pIN-Ⅲ-OmpA3来作为构建pOMP-P2的起始质粒。有关培养以及用异丙基-β-D-硫代吡喃丰乳糖苷(IPTG)诱导表达的条件如以前所述17。
实施例5在昆虫细胞中表达并从中分泌蛋白质P2为了从重组的昆虫细胞中分泌出蛋白质p2，我们将p2编码序列与能够被这些细胞有效识别的前导肽相连接。我们使用了水泡性口腔炎病毒(VSV)G蛋白18的前导肽。与上文所述者相似，已制备出后面接有p2基因起始部分的编码VSVG蛋白前导肽的合成DNA序列，图8给出了其核苷酸序列，在此情况下，我们也提供了利于将其连接到P2基因的其余部分以及表达载体上的限制性位点(Hiad Ⅲ，BamH Ⅰ和BalⅠ)。
将合成的Hind Ⅲ-BalⅠ片段连接到得自M13-P2且携带P2基因的纯化Bal Ⅰ-BamH Ⅰ片段上，并插入到已预先用Hind Ⅲ和BamHⅠ切割的M13mp18中。产生新质粒VSV-P2的这一构建过程示于图9中。我们已从VSV-P2中切掉BamHⅠ-BamHⅠDNA片段，该片段携带已融合到VSV前导肽中的P2基因，然后将其插入至载体pAcYM119中(如图10所示)。所产生的质粒被称作pAc-p2。
为了在昆虫细胞中表达，必须将VSV-P2编码序列转移到位于多角体启动子转录控制之下的杆状病毒基因组中。为此，我们用野生型杆状病毒DNA和转移载体pAc-P2对昆虫细胞进行了共转染。对于昆虫细胞，我们选择草地粘虫细胞作为宿主细胞。详细实验过程如下利用经过改进的Summers等20所述的方法，用感染性AcNPVDNA以及代表单个重组转移载体的质粒DNA的混合物转染草地粘虫细胞。将1μg病毒DNA与25-100μg质粒DNA混合，并在20mMHEPES缓冲液(PH7.5)、1mM正磷酸氢二钠、5mM氯化钾、140mM氯化钠和10mM葡萄糖(总体积1ml)存在下用终浓度为0.125M的氯化钠沉淀之。
在35mm组织培养皿中将DNA悬液接种到106个草地粘虫细胞的单层上，于室温下1小时吸附到细胞上。然后更换1ml培养基。于28℃保温3天后，收获上清液，并用于在草地粘虫细胞单层中产生噬斑。根据用光学显微镜检测时无多角体存在而鉴定出含有重组病毒的噬斑，自这些噬斑中回收病毒，进一步纯化噬斑后将其用于生产多角体阴性病毒原种。
利用上述方法可分离出一种重组杆状病毒，其基因组中携带了处于多角体启动子和VSVG蛋白前导肽控制之下的P2基因。我们利用这一病毒按照已知方法20感染草地粘虫，复感染数为10。然后按照已公开的方法20，在10%胎牛血清存在下以旋转培养中或单层方式培养感染的细胞。在这两种情况下，利用S-2238生色检测法在感染细胞的培养物上清液中均检测到抗凝血酶活性。
实施例6在昆虫细胞的胞质中表达蛋白质P2也可在草地粘虫细胞的细胞质中产生和积累蛋白质P2。由于这一方法利用了作为非分泌性病毒蛋白质的多角体的表达信号，因此一般具有较好的异源蛋白质产率。
我们用以获得大量重组蛋白质P2的方法是基于一融合多肽的表达，其中多角体的前18个氨基酸与P2的64个氨基酸相连。多角体NH2末端的存在使得表达能高水平进行21。另外，我们在多角体部分与P2序列之间加进了一个甲硫氨酸残基，它使得在用CNBr处理杂合蛋白时能够释放出P2部分。
与前述方法相似，我们制备了一个能够使Bal Ⅰ-BamH Ⅰ片段(得自M13-P2)与合适的转移载体相连的合适DNA片段。图11所示的该新的合成片段也包括了便于继后操作的BamHⅠ和BalⅠ位点。
已获得一种不同的转移载体pAcFT1，它携带了编码多角体前18个氨基酸的核苷酸序列(图12)。简单地说，pAcYM119的EcoRV-BamHⅠ片段已被含有自核苷酸-92至核苷酸+55之间的多角体基因序列的合成寡核苷酸所取代。该序列之后有一个方便的BamHⅠ位点，并可按照图13所示的方案将其用于插入完整的P2编码序列。通过这一构建过程，我们得到了一个新的质粒pAcFT1-P2，用它将杂合基因转移到杆状病毒基因组中。
按照实施例5所述的方法得到重组杆状病毒。按照常规方法20感染草地粘虫细胞。培养感染的昆虫细胞导致融合蛋白在细胞质中的积累。该杂合蛋白是重组蛋白P2的来源。可按文献中公开的几种方法用CNBr切割该杂合蛋白22，23。应用Olson等23所述的方法可得到正确的P2多肽序列。该分子显示出抗凝血酶活性。
实施例7为了获得P2蛋白的Tyr61变体，用下列寡核苷酸取代上面实施例3中所述及图3中所示的寡核苷酸5和6
oligo 5-Tyr5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAATACATCCTGAACTAGTAACTGCA 3'oligo 6-Tyr5'-GTTACTAGTTCAGGATGTATTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'在寡核苷酸5-Tyr中，下面划线的TAC三联密码子编码酪氨酸，它取代了原来存在的编码天冬氨酸的GAC三联密码子。寡核苷酸6-Tyr已被相应地校正以在两条链之间获得完全的互补性。在昆虫细胞或大肠杆菌中表达和/或分泌变体的继后步骤与实施例4-6中所述者相同。
实施例8为了得到P2蛋白的甘氨酸加长衍生物，用下示寡核苷酸序列取代上面实施例3中所述且示于图3中的寡核苷酸5和6寡核苷酸5-Gly5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAAC-GGTTAGTAACTGCA 3'寡核苷酸6-Gly5' GTTACTAACCGTTCAGGATGTCTTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'在寡核苷酸5-Gly中，下面划线且编码甘氨酸的三联密码子GGT被插入终止密码子之前。为了在两条链之间获得完全的互补性，对寡核苷酸6-Gly进行了相应的校正。以后的在昆虫细胞或大肠杆菌中表达和/或分泌Gly加长衍生物的步骤与实施例4-6中所述者相同。
实施例9P1和P2的cDNA克隆(a)按照Cathala等人的方法24，由水蛭Hirudinaria manillensis头制备出总RNA。
(b)按如下方法完成逆转录反应在冰上分别装入10μg得自水蛭头的总RNA、1μgdT17连接子引物、8μl5mMdnTP混合物、8μlAMV缓冲液(5x)，并加水至40μl，混合后将所得混合物于65℃加热2分钟，然后在冰上淬火。加入10单位核糖核酸酶(RNAsin)(Promega)和20单位的AMV逆转录酶(Bochringer Mannheim)于42℃保温2小时。然后用苯酸氯仿萃取反应混合物。並用异丙醇沉淀。
(c)然后进行聚合酶链反应(PCR)。每次PCR反应的一般程序是将下列PCR反应混合物于95℃变性5分钟5μl逆转录RNA，10μl10xPCR缓冲液(Cetus/Perkin Elmer)，16μl脱氧三磷酸核苷(dNTPs)混合物每种dNTP各125mM)2μlMgcl2(0.1M)，各25-500微微摩尔(pmole)引物。
加水至100μl;
然后加入215单位Tag聚合酶(Cetus/Perkin-Elmer)，并用80μl的矿物油敷盖。反应在Cetus/Perkin-Elmer DNA热循环器中反复进行。
循环方案为3分钟 94℃2分钟 60℃2分30秒 72℃ 循环1次1分钟 94℃2分钟 60℃3分30秒 72℃ 循环30次1分钟 94℃2分钟 60℃5分钟 72℃ 循环1次7分钟 72℃放置于 25℃残余的Tag聚合物用苯酸-氯仿灭活，并用乙醇沉淀;样品于-20℃保存。为了获得P1和P2cDNA的完整序列，进行三轮PCR扩增。下面显示了每一引物的序列。经改变个别核苷酸在寡核苷酸序列中引入简并性的位置在引物序列下示出(N表示所有四种核苷酸均可利用)。划线显示为有助于扩增产物克隆而加入的限制位点。
dT17连接子引物
5' GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'XhoI SalI连接子引物5' GAC TCG AGT CGA CAT CG 3'XhoI SalI引物3-85' ATC GAA GCT TTA TAC CGA TTG TAC NGA 3'HindIII C A C CT引物52-565' CTA AGG ATC CTT CTT CGA AGT CNC C 3'BamHI C A A引物32-375' ATC GGA ATT CAG TTC TGG AAA TCA GTG CGT 3'EcoRI引物5′Ⅰ
5' CTA AGA ATT CTT CGC AAC TTA TAT GCG TT 3'EcoRI引物5′Ⅱ5' ATC GGA ATT CTT AAT TCA ATA TAT CTT CAT 3'EcoRI第一轮扩增用500mole跨越P2氨基酸序列3-8位及56-52位残基的完全变性的引物作为PCR反应的反相引物。
cDNA3′末端的扩增(RACE方法)，参见Frohman等人的文章25根据第一轮扩增中测定的P2核苷酸序列，设计出从第32至37位残基的基因特异性引物。将该引物与dT连接子引物一起用于扩增cDNA(图14)。
cDNA5′末端的扩增(RAcE方法)，参见Frohmen等人的文章25。
参照以前描述的方法对得自水蛭头的10μg总RNA进行反转录，不同的是用1μg基因特异性引物(5′Ⅰ)取代dT17连接子引物(参见图15)。然后用异丙醇沉淀反应混合物，并按以下用量用末端脱氧核苷转移酶(TdT)使第一链cDNA产物的5′-末端多聚腺苷酸化22μlcDNA1μl6mMdATP
6μl5×TdT缓冲液(BRL)1.1μlTdT(BRL)将样品于37℃保温10分钟，然后于65℃加热16分钟。然后用蒸馏水将反应混合物稀释至500μl。
利用10pmole dT17连接子引物、25pmole连接子引物和25pmole位于第一基因特异性引物上游用于转录的第二基因特异性引物(5′Ⅱ，图15)，扩增10μl多聚腺苷酸化的产物。
d)PCR产物的分析在各引物的限制性位点处切割扩增的产物。对消化产物进行凝胶纯化，并亚克隆到已用同样的限制酶预先消化过的puc13载体中。用限制性酶切分析法鉴定携带有用插入子的质粒。按照制造商推荐的方法，用序列酶〔Seguenase(USB)〕对质粒DNA进行序列分析。如此获得的P1和P2的cDNA序列以及由之推测的氨基酸序列如下。前导序列以下面划线标示。
P1 cDNAtca aaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTTMet Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala ValTGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAACys Ile Cys Val Ser Gln Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr GluTCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGTSer Gly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys GlyGGA GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTCGly Gly Lys His Cys Glu Met Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys ValGAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GATAsp Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly AspTTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAAPhe Glu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn End
P2 cDNAaaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGCMet Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val CysATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCAIle Cys Val Ser Gln Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu SerGGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGAGly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly GluGGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CATGly Lys Asn Cys Gln Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val HisGGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTCGly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp PheGAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA cgaacgcatataagtGlu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn EndtgcgaataattctgattttaagacattcccatcgcagctatggctatttacagtatattattataaataaagaattgaacgtttacgttgattgtaReferences1)Markwardt，F.1970，Methods in Enzymology，19，p.9242)Markwardt，F.1985，Biomed.Biochim.Acta.44，p.10073)Markwardt，F.Hauptmann，J.，Nowak，G.，Klessen，C.，and Walsmann，P.1982.Thromb.Haemostasis 47，p.226.
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1.一种制备包括如下氨基酸序列的多肽及其药用盐的方法(i)P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met20 25 30Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa；65(ii)P2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa；or(iii)P3Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly；35 40其中Yaa为Asp或Tyr，Zaa为-oH、-NH2或Gty-oH，该方法包括A)-在使多肽表达的条件下提供-宿主，该宿主被包括编码所说多肽之DNA序列的表达载体转化；和-分离由此获得的多肽或其药用盐；或B)-用化学方法合成所说的多肽；和-分离由此获得的多肽或其药用盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中方法A)中的宿主是细菌、酵母、哺乳动物细胞系、昆虫细胞系或动物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中方法A)中的宿主是B型大肠杆菌菌株或草地粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞系。
4.根据权利要求1所述的方法，其中方法B)中的多肽是以固相合成法合成的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中多肽具有权利要求1所示的任何一种氨基酸序列，且各序列前均带有Met残基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中多肽具有权利要求1所示的任何一种氨基酸序列，且前面均接有全部或部分前导肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其中多肽具有权利要求1所示的任何一种氨基酸序列，且前面接有全部或部分下示前导肽序列Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gln Ala.
8.根据权利要求1所述的方法，其中多肽为一融合蛋白，其中权利要求1所示的任一氨基酸序列与一载体序列相融合。
9.一种制备权利要求1所限定的多肽或其药用盐的方法，该多肽具有氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)，其中Yaa代表Asp，Zaa代表-OH，该方法包括从水蛭Hirudinaria manillensis的组织或分泌物中分离所说的多肽或其药用盐。
10.一种制备药用组合物的方法，其特征在于将权利要求1限定的多肽与合适的药用载体和/或稀释剂相混合。
11.一种表达载体，它包括编码权利要求1和5-8中任一项限定之多肽的DNA序列。
12.根据权利要求11所述的载体，其为质粒。
13.根据权利要求11所述的载体，其为病毒。
14.根据权利要求13所述的载体，其为病毒为重组杆状病毒，其中多角体启动子可操纵地连接到所说的DNA序列上。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的载体，其中所说的DNA序列进一步编码一前导肽，该前导肽能够指导该多肽自表达该多肽的细胞中分泌。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的载体，其中所说的DNA序列编码一种融合蛋白，它能够被切割而释放出多肽。
17.一种被权利要求11-16中任一项的相容性表达载体转化的宿主。
18.根据权利要求17的宿主，其为细菌、酵母、哺乳动物细胞系、昆虫细胞系或动物。
19.根据权利要求18的宿主，其为B型大肠杆菌菌株或草地粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞系。
20.编码权利要求1和5-8中任一项所限定的多肽的DNA序列。
21.根据权利要求20所述的DNA序列，其为合成的DNA序列。
22.根据权利要求20所述的DNA序列，其为cDNA。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的DNA序列，它进一步编码-前导肽，该前导肽能够指导所说的多肽从表达该多肽的细胞中分泌。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的DNA序列，它编码一融合蛋白，该融合蛋白能够被切割而释放所说的多肽。
25.一种制备权利要求1和5-8中任一项所限定之多肽能够在其中表达之宿主的方法，该方法包括用根据权利要求11-16中任一项的相容性表达载体转化宿主。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所说的表达载体按如下方法制备(a)用化学方法合成编码该多肽的DNA序列;(b)将该DNA序列插入表达载体。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述的表达载体按以下方法制备(a)从水蛭Hirudinaria manillensis的mRNA产生并分离编码所说多肽的cDNA;以及(b)将分离的cDNA插入表达载体中。
28.根据权利要求20所述的DNA序列，它基本上由下列序
29.根据权利要求20所述的DNA序列，它基本上要由下列序列组成
30.根据权利要求20所述的DNA序列，它基本上由下列序列组成
31.根据权利要求29或30所述的DNA序列，其中所列的序列紧接在以下序列之后
全文摘要
本发明涉及制备自水蛭Hirudinaria manillensis中分离的抗凝血酶多肽的方法。该抗凝血酶多肽可自水蛭Hirudinaria manillensis的组织或分泌物中分离，也可用重组DNA方法合成。
文档编号C07K14/145GK1066272SQ9210114
公开日1992年11月18日 申请日期1992年2月27日 优先权日1991年2月28日
发明者P·瑟米恩托斯, P·D·T·督伯特, G·尼狄, E·萨彻里 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司