专利名称：一种适用于转人抗凝血酶Ⅲ基因山羊的快速简便检测方法
技术领域：
本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种适用于转人抗凝血酶III基因山羊的转基因成分的快速简便检测方法。
背景技术：
转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。人抗凝血酶(MT)，也有人称为人抗凝血酶III (hATIII)，是肝脏产生的凝血系统中最重要的抗凝因子。在正常生理状态下，它可以阻止凝血的发生，维持血 液的正常流动；当血管受损时，又能限制血凝块的扩大，防止血液堵塞。(杨海.人抗凝血酶III的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究.[博士学位论文]·陕西杨凌西北科技农林大学，2009.) 2009年7月，青岛森淼生物技术有限公司与青岛森淼生物技术研究所所承担的国家863计划所生产的利用乳腺生物反应器生产的抗凝血酶III蛋白纯品研究成果通过国家级项目评估，标志着我国血液蛋白抗凝血酶III的生产将摆脱对血源的依赖(传统方式是从人体血液中提取)。鉴于转人抗凝血酶III基因山羊生产技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测人抗凝血酶III基因的方法，具有必要性和紧迫性。综合目前各国对转基因产品的检测技术，根据检测目标，可将其分为以下三个水平插入的外源基因的检测；插入外源基因的表达产物(RNA或者蛋白质)的检测；插入的外源基因对受体生物基因表达的影响(外源基因的插入对位点附近的基因的影响从而对整个生物体的代谢的影响)的研究，而其中核酸水平的检测应用更为广泛。核酸水平的检测，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。PCR检测转基因产品，通常涉及以下技术定性PCR、定量PCR、巢式PCR、多重PCR、热不对称交错PCR等。PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法，需要进行PCR扩增和电泳检测两个环节，但必须依赖PCR仪等精密仪器，检测费用高，对检测人员有较高的技术要求，无法在条件较差的基层实验室进行。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的局限性，提供适用于转人抗凝血酶III基因山羊的快速简便检测方法，利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法，能准确快速检测出转基因山羊中人抗凝血酶III基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。实现本发明的技术方案如下
(I)引物设计及合成根据人抗凝血酶III基因(hATIII)的基因(GenBank:X68793)序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP 5/ -GCATGTGGACCACCACGATCA-CCAGAGGTGCTGCAAGAG-3/ ；BIP 5/ -CGCTTCCGCATTGAGGACGG-TCGACAAGGCCCATGTCTT-3/ ；F3 5/ -GGCCAAGGTAGAGAAGGAAC-3'；B3 5/ -GGACTTTTCAGGGCTGAACA-3'；(2)环介导等温扩增反应以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人抗凝血酶III基因进行恒温扩增，其 反应体系为IM 甜菜碱，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 3mM,4. 8U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，外引物F3和Β3各O. 24 μ Μ，内引物FIP和BIP各I. 56 μ Μ，补双蒸水至25 μ 1，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于90°C反应5min，反应后立即冰浴l_2min，再加入4. 8U Bst DNA聚合酶，于59°C反应60min，80°C下反应5min后终止反应;(3)环介导恒温扩增产物分析I)琼脂糖凝胶电泳取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(浓度为40 %的甘油，O. 2%溴酚蓝，59. 8% O. 25Μ Tris-HCl)，混匀，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min,得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人抗凝血酶III基因(即含有转基因成分)，若没有阶梯型条带则判定为不含人抗凝血酶III基因。2)荧光染料染色将SYBR Green I荧光染料稀释100倍(按体积计)后作为工作液，取5μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人抗凝血酶III基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含人抗凝血酶III基因。本发明成功建立了对人抗凝血酶III基因的快速、灵敏、特异而又简单实用的检测方法。与其它传统PCR方法相比该发明有以下优点I.本发明经济实用反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，例如水浴锅即可。2.本发明的灵敏度高采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人抗凝血酶III基因，比普通的PCR的灵敏度高10倍。3.本发明的特异性强本发明采用设计了 4条引物，可识别6个特异性区域，增加了与目的基因结合的特异性。4.本发明的检出率高对5头转人抗凝血酶III基因山羊进行检测，均检测出转基因成分，检出率为100%，对15个人的DNA样品进行了 LAMP扩增，结果表示，检出率为100%。5.本发明检测简单直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。
序列表SEQ ID NO :1是扩增的人抗凝血酶III基因的部分核苷酸序列，长度为172bp。序列表SEQ ID NO :2_5分别是设计的引物序列(引物的序列编号依次为FIP ；BIP ；F3 和 B3)。图I :本发明扩增的人抗凝血酶III基因的特异片段，片段全长为172bp，线条标记部分为引物所处位置，序列中方框所示位置为限制性内切酶Eco471识别位点。图2 :PCR扩增人抗凝血酶III基因电泳图，图中M DL2000 DNA marker ;1_15 :模板为人基因组DNA ；16 :模板为非转基因山羊；17 :水。
图3 =LAMP扩增人抗凝血酶III基因电泳图，图中M DL2000 DNA marker ;1_15 模板为人基因组DNA ；16 :模板为非转基因山羊基因组DNA ；17 :水。图4 :LAMP扩增人抗凝血酶III基因可视化结果，图中1_15 :模板为人基因组DNA ；16 :模板为非转基因山羊基因组DNA; 17 :水。图5 :LAMP扩增人抗凝血酶III基因产物酶切组成图，图中方框所示部分为酶切后产物组成。图6 =LAMP扩增人抗凝血酶III基因产物酶切验证电泳图，图中M DL2000 DNAmarker ；1 :酶切后的LAMP扩增产物。图7 pMD18T-hATIII的结构图，图中显示插入了 hATIII (人抗凝血酶III)基因片段。图8 :LAMP与PCR扩增人抗凝血酶III基因检出限比较，图中M :DL2000 DNAmarker ;1_7 pMD18T-hATIII 质粒拷贝数依次 IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10、5 拷贝。图9 =LAMP扩增人抗凝血酶III基因检出限试验可视化结果，图中1_7 :pMD18T-hATIII 质粒拷贝数依次 IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10、5 拷贝。图10 :LAMP检测转人抗凝血酶III基因转基因山羊，图中M DL2000 DNA marker ；1-5 :转人抗凝血酶III基因转基因山羊；6 :阳性对照，pMD18T-hATIII质粒；7 :阴性对照，非转基因山羊基因组DNA。图11 =LAMP检测转人抗凝血酶III基因转基因牛可视化结果，图中1_5 :转人抗凝血酶HI基因转基因山羊；6 :阳性对照，pMD18T-hATIII质粒；7 :阴性对照，非转基因山羊基因组DNA。
具体实施例方式实施例I :对人抗凝血酶III基因目的片段进行扩增I、样品的获得I)转人抗凝血酶III基因转基因山羊DNA样品由青岛森淼实业有限公司惠赠2)人的血液样品(采自中国湖北省武汉市)，用于提取基因组DNA，构建阳性质粒，验证检出率。按照常规方法采集人血样，采用报道的酚-氯仿抽提法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京2005版方法)抽提人基因组DNA，得到人基因组DNA。2.常规PCR扩增用常规的PCR扩增方法(萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京2005)以两条外引物即编号为F3、B3的引物扩增人基因组DNA中人抗凝血酶III基因的目的片段(其核苷酸序列见SEQIDN0 :1和图I所示，序列全长为172bp)。同时以非转基因山羊样品作为阴性对照。I)反应体系上游引物 F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgCl2, 75 μ MdNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因组DNA I μ L，用双蒸水补齐至10 μ L。2)反应程序95°C,5min ;34个循环95°C lmin，60°C lmin,72°C 20s ;72°C，5min。3)结果判定取2. 5μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(配方浓度为40 %的(ν/ν)甘油，60% (v/v)0. 25MTris-HCl,0. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，然后在2%的琼脂糖凝胶中电泳30min后，通过凝胶成像系统成像，可分别见长度为172bp大小的扩增片段，结果如图2所示。3、LAMP 扩增 以引物FIP、引物BIP的核苷酸序列为内引物，以引物F3、引物B3所示的引物为外引物对人基因组DNA进行恒温扩增，同时以非转基因山羊基因组DNA作为阴性对照。I)反应体系试剂组成如下1M 甜菜碱，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ 3mM,4. 8U BstDNA聚合酶，1μ I模板，外引物F3和B3各0. 24 μ M，内引物FIP和BIP各I. 56 μ Μ,补双蒸水至25 μ I02)反应程序将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于95°C反应5min，立即冰浴l-2min，再加入4. 8U Bst DNA聚合酶，于59°C下反应60min，然后置80°C下5min终止反应。3)结果分析与判定①琼脂糖凝胶电泳取2. 5μ I扩增产物，加入1μ I上样缓冲液(配方40% (ν/V)甘油，60% (V/V)0. 25MTris-HCl,0. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察是否有阶梯型条带出现，若有阶梯型条带则判定为含人抗凝血酶III基因，若没有阶梯型条带则判定不含人抗凝血酶III基因。②荧光染料染色SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5 μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加ASYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定含有人抗凝血酶III基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含人抗凝血酶III基因。③结果判定在上述分析方法①中，在凝胶成相系统的紫外灯下，模板为人基因组DNA，即含有人抗凝血酶III基因时，可以观察到阶梯型条带，而模板为非转基因山羊基因组DNA时，即不含人抗凝血酶III基因，则观察不到阶梯型条带，其结果如图3所示。在上述分析步骤②中，当模板为人的基因组DNA，即含有人抗凝血酶III基因时，扩增产物变为黄绿色；当模板为非转基因山羊基因组DNA时，扩增产物为棕黄色，其结果如图4所示。4) LAMP扩增产物特异性检验对LAMP扩增产物进行酶切验证LAMP扩增产物在电泳检测不是呈现一条带，而是呈现出由多条带组成的阶梯型条带，这是因为这种方法在扩增过程中形成以目的片段，连接在一起的长短不一的开环产物所造成。本发明中人抗凝血酶III基因目的片段(其核苷酸序列见图I所示)大小为172bp，在77bp处存在限制性内切酶Eco471所识别的酶切位点，由于LAMP产物是由互相连接的环状结构组成，在酶切位点处切开的产物分别由图5中所示方框部分组成，酶切后的两段长度应分别是62bp和106bp。因此可使用Eco471对LAMP扩增产物进行酶切，验证LAMP扩增得到的阶梯型条带是否由人抗凝血酶III基因目的片段所组成，若阶梯型条带能被Eco471识别而酶切，则酶切后电泳检测阶梯型条带不存在，且能获得大小为62bp和106bp的两个片段，则判定为阶梯型条带是由人抗凝血酶III基因目的片段所组成的，亦即LAMP扩增所得到的产物是人抗凝血酶III基因目的片段。①酶切反应体系取3μ ILAMP扩增产物，加入O. 8μ I限制性内切酶Eco471 (购自Fermentas 公司)和 1μ lbuffer,双蒸水补至 10 μ I。②反应程序于37°C恒温培养箱中酶切6小时。③结果判定取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(配方浓度为40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25MTris-HCl,0. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察到酶切以后的LAMP扩增产物不再有阶梯型条带，结果
如图6所示。结果说明本发明中LAMP扩增所得到的产物是人抗凝血酶III基因的片段。实施例2 :人抗凝血酶III基因LAMP检测方法灵敏度试验用含目的基因的质粒pMD18T_hATIII作模板，验证LAMP检测方法的检出限，并与PCR方法的检出限作对比。具体步骤如下I、质粒 pMD18T_hATIII 的构建I)人抗凝血酶III基因目的目的片段PCR产物的回收纯化用PCR方法以两条外引物即引物F3(其序列见SEQ ID NO :4)、引物B3 (其序列见SEQ ID NO 5)扩增人基因组DNA中人抗凝血酶III基因目的片段(其核苷酸序列见序列表SEQ ID N0:1或图I所示，序列全长为172bp)。反应体系上游引物F3 0.2μΜ，下游引物 Β3 O. 2μΜ, 1μ I PCR buffer, I. 5mM Mgcl2, 75 μ M dNTPs,0. 5U DNA 聚合酶，人基因组DNA I μ L，用双蒸水补齐至 10 μ L。反应程序95V，5min ；34 个循环95°C lmin, 60°C Imin ；72°C 20s ;72°C,5min。取50 μ L PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳30min，凝胶成相系统上成像。可以看到172bp大小的片段，结果如图2所示。将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司)回收DNA。2)目的片段PCR产物与pMD18-T载体连接将回收产物与pMD18_T载体(购自武汉大风生物科技有限公司)连接，连接体系为0· 5μ L PMD-18T载体，3· 5μ L solution I，3μ L回收产物，将上述试剂混匀后4°C连接过夜。pMD18T-hATIII的结构如图7所示。3)连接产物的转化、pMD18T_hATIII质粒的鉴定及提取取5yL连接产物加Λ IOOyL大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，冰浴30min，42°C循环水中热击90s，快速冰浴l-2min使细胞冷却，加入500 μ L LB液体培养基，37 °C摇床上培育45min，在4000rpm离心5min，弃去500 μ L上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100 μ L涂布于含氨苄青霉素(100yg/ml)的LB琼脂平皿上，37°C培养12h。用经高压蒸汽灭菌(121°C，灭菌30min)的10 μ L移液器头挑取菌落置于800 μ L含氨苄青霉素(lOOyg/ml)的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养4h，然后通过菌液PCR挑选阳性菌液，然后送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果经比对确认以后，用质粒小提试剂盒(购自TIANGEN公司，按照试剂盒的说明书介绍的方法操作)提取质粒，并测定质粒浓度。4)计算质粒拷贝数计算质粒拷贝数，其公式为
(6. 23 X IO23拷贝/mol) X (浓度g/ml) + [碱基数X (660道尔顿/碱基)]=拷贝数/ml用双蒸水将质粒pMD18T_hATIII进行倍比稀释，使其终浓度为IO6拷贝/ μ 1，IO5拷贝 / μ I, IO4 拷贝 / μ 1，IO3 拷贝 / μ 1，IO2 拷贝 / μ 1，IO1 拷贝 / μ 1,5 拷贝 / μ I。2、LAMP方法检测检出限试验利用本实施例中所计算出的已知含有人抗凝血酶III基因检测目的片段(172bp)拷贝数的质粒pMD18T-hATIII为模板，采用LAMP方法和PCR方法进行检测的灵敏度试验。I)LAMP方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T_hATIII以引物FIP、BIP为内引物，以引物F3、B3为外引物对本实施例中步骤I得到的质粒pMD18T-hATIII进行LAMP扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为106个，IO5个，IO4个，IO3 个，IO2 个，10，5 个。①反应体系试剂如下IM甜菜碱，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+3mM,4. 8U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，外引物F3和B3各0. 24 μ M，内引物FIP和BIP各
I.56 μ Μ,补双蒸水至25 μ I0②反应程序将上述反应体系除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，95°C反应5min，立即冰浴l-2min，再加入4. 8U Bst DNA聚合酶，于59°C下反应60min，然后置80°C下5min终止反应。2)PCR方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T_hATIII同时以两条外引物F3、B3进行PCR扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为106个，IO5 个，IO4 个，IO3 个，IO2 个，10 个，5 个.①反应体系上游引物F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgCl2, 75 μ M dNTPs，0. 5UDNA聚合酶，人基因组DNA I μ L，用双蒸水补齐至10 μ L。②反应程序95V，5min；34 个循环95°C lmin, 60°C lmin, 72°C 20s ；72°C, 5min。3)结果分析经琼脂糖凝胶电泳后得到结果当pMD18T_hATIII质粒为IO2个拷贝时，PCR方法能扩增出特异性条带，当pMD18T-hATIII质粒为10个拷贝时，PCR方法未能扩增出特异性条带，因此判定PCR方法对pMD18T-hATIII质粒的扩增下限为IO2个拷贝；当pMD18T_hATIII质粒为10个拷贝时，LAMP方法能扩增出阶梯型条带，而当pMD18T-hATIII质粒为5个拷贝时，LAMP方法未能扩增出阶梯型条带，因此判定LAMP对pMD18T_hATIII质粒的扩增下限为10个拷贝，PCR与LAMP比较的结果如图8所示。LAMP扩增产物中，取5 μ I加入O. 5 μ ISYBRGreen I工作液，在日光下用肉眼观察结果，结果质粒拷贝数依次为106个，IO5个，IO4个，IO3个，IO2个，10个时，扩增产物变为黄绿色，而质粒拷贝数为5时，扩增产物则为棕黄色。结果如图9所示。本实施例中，LAMP方法灵敏度高，采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人抗凝血酶III基因，比普通PCR灵敏度高10倍。实施例3 :对转人抗凝血酶111基因的转基因山羊进行LAMP检测对5头转人抗凝血酶III基因的转基因山羊进行LAMP检测，试验中所用转基因山羊的基因组DNA以及人的基因组DNA样品，均稀释到20ng/y I。I) LAMP 扩增过程
以FIP (序列表SEQ ID NO :2)、BIP (序列表SEQ ID NO 3)为内引物，F3(序列表SEQ ID NO 4)、B3(序列表SEQ ID NO 5)为外引物对人抗凝血酶III基因进行恒温扩增，其反应体系为1M甜菜碱，400yMdNTPs，2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 3mM,4. 8U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，外引物F3和Β3各O. 24 μ Μ，内引物FIP和BIP各I. 56 μ Μ，补双蒸水至25 μ 1，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于90°C反应5min，反应后立即冰浴l_2min，再加入4. 8U Bst NDA聚合酶，于59°C反应60min，80°C下反应5min后终止反应;2)结果分析①琼脂糖凝胶电泳取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25Μ Tris-HCl, O. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则含有人抗凝血酶III基因，若没有阶梯型条带则不含人抗凝血酶III基因。 ②荧光染料染色将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5 μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人抗凝血酶III基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含有人抗凝血酶III基因。③结果判定本实施例的LAMP检测方法均检测出了转人抗凝血酶III基因山羊的人抗凝血酶III基因，结果分别如图10，图11。
权利要求
1. 一种适用于转人抗凝血酶III基因山羊的快速、简便检测方法，其步骤包括 (1)引物设计及合成根据人抗凝血酶III基因序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP :5’ -GCATGTGGACCACCACGATCA-CCAGAGGTGCTGCAAGAG-3’ ；BIP :5’ -CGCTTCCGCATTGAGGACGG-TCGACAAGGCCCATGTCTT-3’ ；F3 :5， -GGCCAAGGTAGAGAAGGAAC-3，；B3 :5， -GGACTTTTCAGGGCTGAACA-3，； (2)环介导等温扩增反应 以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人抗凝血酶III基因进行恒温扩增，其反应体系为IM 甜菜碱，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ 3mM,4. 8U Bst DNA 聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各O. 24 μ Μ，内引物FIP和BIP各1.56 μ Μ，补双蒸水至25 μ 1，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于90°C反应5min，反应后立即冰浴l-2min，再加入4. 8U Bst DNA聚合酶，于59°C反应60min，80°C下反应5min后终止反应； (3)环介导恒温扩增产物检测 1)琼脂糖凝胶电泳取2μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液，该缓冲液包含浓度为40%的甘油、O. 2%溴酚蓝和59. 8% O. 25Μ Tris-HCl，混匀，再按质量体积计加2%琼脂糖凝胶，于5V/cm下电泳30min,得到凝胶成像,观察是否有梯形条带出现； 2)将SYBRGreen I荧光染料按体积计稀释100倍后作为工作液，取5μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。
全文摘要
本发明属于转基因动物中转基因成分的分子检测技术领域，具体涉及提供一种适用于转人抗凝血酶Ⅲ基因山羊的快速简便检测方法，本发明利用环介导等温扩增法原理，准确快速检测出转基因山羊中的人抗凝血酶Ⅲ基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供了实用的分子检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102952853SQ20111024457
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者刘榜, 翟珊莉, 陶晨雨, 张庆德 申请人:华中农业大学