包含类凝血酶的止血组合物及其制备方法

专利名称：：包含类凝血酶的止血组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种止血组合物及其制备方法，更具体是涉及一种包含类凝血酶的止血组合物及其制备方法。
背景技术：
：人和动物凝血过程包括纤维蛋白的形成与交联，这一过程包括纤维蛋白单体的形成、聚合及纤维蛋白的交联。1)纤维蛋白单体的形成纤维蛋白原是由肝合成，具有两条α链(Aa)、两条β链(Ββ)、和两条γ链(Υ2)，即三对不同的多肽链组成的糖蛋白，可用(Aa、Bi3、Y)2表示，在凝血酶的作用下，纤维蛋白原释放出A和B小肽，形成纤维蛋白单体。2)纤维蛋白单体的聚合及交联可溶性纤维蛋白单体间通过氢键等次级键相连而成的多聚体凝块，虽可网罗血细胞而形成血凝块，但较松软且不稳定，需在Ca2+参与下，由XIIIa作用才能进一步转变为稳定的纤维蛋白多聚体。因子XIII是由两对不同的多肽链组成的四聚体，在Ca2+参与下由凝血酶、Xa作用于转变为XlIIa，XlIIa使可溶性纤维蛋白多聚体中一分子纤维蛋白单体的Gln残基与另一分子单体的Lys残基间形成分子间共价键，从而形成稳定的纤维蛋白多聚体，并在血小板的作用下，使网罗血细胞的血块进一步收缩，形成更坚固的血凝块，完成凝血过程。在凝血过程中凝血酶起主要作用。在蛇毒中存在着一类蛋白酶，它们与凝血酶有相似的功能，被称为蛇毒类凝血酶。蛇毒类凝血酶主要存在于蝮亚科(Viperidae)和蝰科(Crotalidae)蛇毒中。蛇毒类凝血酶具有精氨酸酯酶活性，能够直接作用于纤维蛋白原，水解释放血纤肽A(fibrinop印tideA,FPA)或B(FPB)，使纤维蛋白单体首尾聚合而凝固。在体外作为促凝剂引起血浆或纤维蛋白原凝集，但类凝血酶在体内不激活凝血因子XIII，由类凝血酶水解生成的纤维蛋白凝块不产生侧链交联，对纤溶酶的作用高度敏感，很容易被天然网状内皮系统或正常的纤溶作用清除。一般来说，不同种属的血浆纤维蛋白原对类凝血酶的敏感性依次为人>狗>鼠>兔。蛇毒类凝血酶与凝血酶的不同点在于1、已知的蛇毒类凝血酶均是单一的多肽链，具有多个二硫键，不含游离的巯基。凝血酶含A、B两条链。2、几乎所有的类凝血酶均为糖蛋白，但与凝血酶不同的是其寡糖链是与天冬酰氨连接，而不是丝氨酸。3、它进行水解时有的仅使纤维蛋白原Aa链上裂解出纤维蛋白肽A，有的蛇毒则只裂解出纤维蛋白肽B，或是裂解出纤维蛋白A和B肽，但速率不同。其分子间是首尾相连接。4、对凝血因子XIII无激活作用，不能使纤维蛋白之间交联。5、对纤维蛋白原的作用较凝血酶更专一，其活性不被抗凝血酶III、肝素、水蛭素、大豆胰蛋白酶等抑制剂所抑制。6、类凝血酶对热稳定，即使在低浓度时对热也稳定。7、类凝血酶形成的凝块不会引起收缩。纤维蛋白止血胶，它的作用机制是效仿血液凝固的最后阶段，使纤维蛋白原在凝血酶和钙离子的作用下，转变为纤维蛋白网，再在第XIII因子的作用下，变为稳定的纤维蛋白网，从而发挥其止血功效。1909年Bergel首次报道了纤维蛋白粉的止血功能。现今生产的生物胶都是由动物体内提取，含A、B两种试剂。试剂A包括生物胶主体及主体溶解液两部分，主要含高浓度的纤维蛋白原、凝血因子XIII;试剂B则包括催化剂及催化剂溶解液，主要含凝血酶原(或直接用凝血酶)和氯化钙。当B试剂的溶解液和催化Ca2+剂混合后，便将凝血酶原激活转化为凝血酶。凝血酶能水解纤维蛋白原，使之转化为纤维蛋白单体。单体由于负电荷减少，自发聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白多聚体。同时，在Ca2+存在的条件下，凝血酶能激活因子XIII。因子XIII能催化某些肽链间的残基共价结合，最后形成稳定的不溶性纤维蛋白多聚体，起到止血、封闭、粘合作用。目前，上市的品种主要有奥地利IMMUNO公司生产的TISSEEL纤维蛋白封闭剂。其产品含四个组分1)冻干纤维蛋白原，75-115mg/ml，并含有XIII因子，纤维结合蛋白等；2)纤维蛋白原溶解液，含抑肽酶3000KIU/ml；3)冻干凝血酶，500IU/ml；4)凝血酶溶解液，含氯化钙40mmol。四个组分分别用西林瓶密封包装，并配有一种双联注射器。使用前，分别用两个注射器抽取两种溶解液，溶解相应冻干组分，再分别将两种溶解后溶液用两只注射器抽出，并将两只注射器通过一个三通组装成双联注射器；使用时，将两种溶液同时等量混合喷涂到创面上，起到止血封闭创面的作用。另一种市售的纤维蛋白封闭剂是由奥地利NYC0MED医药公司生产的商品名为“特可考”的纤维蛋白封闭剂，其有欧洲专利EP0059265。该纤维蛋白封闭剂的各组分粘附在胶原海绵上。使用时直接贴创面即可。纤维蛋白原胶已广泛地运用于外科手术，迄今还未发现明显的毒性和不良反应。但有病人采用纤维蛋白原胶后产生自身抗凝血酶抗体，引起严重的出血。人们已经了解牛凝血酶可能携带牛海绵状组织脑炎病原体以及其它使哺乳动物致病的病毒，而且牛凝血酶是一种强抗原，使用牛凝血酶后会在人体引起各种免疫反应。牛凝血酶引发交叉免疫反应所产生的抗体，可能会因其削弱抗凝血酶III(AT-III)的正常抑制作用而导致血栓形成。目前市场上，牛凝血酶都混有牛凝血因子V，进入人体后可发生交叉免疫反应，所产生的免疫复合物经血循环被清除，由此可导致人凝血因子V的缺乏，并可能引起严重出血倾向。Tisseel,BeriplastP等几家公司使用人凝血酶制剂，用人凝血酶替代牛凝血酶，但人类携带的各种病毒，例如肝炎病毒将存在潜在的传播危险。有人使用猪凝血酶，但一样存在携带人畜共患病毒等可能。
发明内容针对现有技术存在的问题，本发明人研究开发了一种新型的止血组合物。该组合物至少包括任何来源获得的纤维蛋白原或纤维蛋白、以及任何来源的类凝血酶。由于类凝血酶形成的凝块不会引起收缩，而且类凝血酶不会引发交叉免疫反应，因而本发明的止血组合物能够克服现有包含凝血酶或凝血酶原的止血产品所存在的诸多缺点。本发明人经过大量的研究工作，确定了本发明的止血组合物中类凝血酶与纤维蛋白原(或纤维蛋白)的适当的比例范围。即，类凝血酶与纤维蛋白原(或纤维蛋白)的比例范围应为0.01100IUImgo当低于0.OlIUImg的比例时，难以形成凝胶；而高于100IUImg时，成本太高，会造成浪费。上述比例优选为0.1IOIUlmg，在这个比例范围，形成凝胶的时间适宜，且所形成的凝胶的弹性和粘合力较好。在本发明的止血组合物中，纤维蛋白原(或纤维蛋白)和类凝血酶可以分别为溶液形式或者固体形式。其中，当为液体形式时，纤维蛋白原或纤维蛋白的浓度为10120mg/ml。当低于10mg/ml时，形成的凝胶含水量高、弹性小、易破裂，而浓度高于120mg/ml很难达到。优选为40100mg/ml，在此范围形成的凝胶弹性和粘合力好。类凝血酶的浓度为15000国际单位(IU)/ml。低于lIU/ml形成凝胶的时间过长，而高于5000IU/ml形成凝胶时，局部成胶过快，无法均勻成胶。优选501000IU/ml，形成凝胶的时间适宜。纤维蛋白原或纤维蛋白在制成冻干品之前的浓度一般是40100mg/ml，类凝血酶的浓度为50500IU/ml。纤维蛋白原在和类凝血酶接触后转变为一种纤维蛋白，因此纤维蛋白原和纤维蛋白均可应用于本发明。纤维蛋白原和纤维蛋白的来源包括但不限于人血或牛血、猪血、马血等动物血液。纤维蛋白原可以利用现有的和未知的方法获得，例如冷沉淀法、盐析法、乙醇沉淀法、反复冻溶法、等电点沉淀法等。纤维蛋白可以通过化学或生物的方法获得，包括但不限于血纤维蛋白I、desBB血纤维蛋白和血纤维蛋白II以及它们的混合物。纤维蛋白I是指纤维蛋白原解离纤维蛋白肽A产生的纤维蛋白单体。desBB纤维蛋白是指纤维蛋白原解离纤维蛋白肽B的纤维蛋白单体。纤维蛋白II是指纤维蛋白原解离纤维蛋白肽A和B的纤维蛋白单体。类凝血酶是任何一种将纤维蛋白原催化为非交联的纤维蛋白的酶，其中优选蛇毒来源的类凝血酶。它可以是从天然蛇毒中提取，也可以是基因重组表达获得。这种类凝血酶可作用于纤维蛋白原，进行水解时有的仅使纤维蛋白原Aa链上裂解出纤维蛋白肽A，有的蛇毒则只裂解出纤维蛋白肽B，或是裂解出纤维蛋白A和B肽，但速率不同，由此形成血纤维蛋白I、desBB血纤维蛋白和血纤维蛋白II，也可能存在它们的混合物。表1示出本发明可利用的来源于蛇毒的类凝血酶，它们的蛇毒的来源和类凝血酶的名称以及通过酶处理释放纤维蛋白肽。其仅为例示，本发明并不限于此。表1类凝血酶名称蛇毒来源(中文名)释放纤维蛋白肽~AcntinA.acutus(尖吻蝮)BA.cutin(2)A.acutus(尖吻蝮)-AncrodA.rhodostoma(红口蝮)AAsperaseBothropsasperABotropaseBjararacaACaiobinA.caligieuosus(朝鲜蝮)A<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注_表示未见报道本发明的包含类凝血酶的止血组合物还可包括1.Ca2+，其离子浓度在1200mmol；2.从血浆中得到的凝血因子XIII、纤维结合蛋白和其它血浆中的蛋白；3.具有抑菌或杀菌作用的成分，例如庆大霉素、丁胺卡那霉素等；4.纤维蛋白原稳定增强因子，例如阳离子蛋白、聚阳离子化合物、多聚赖氨酸、碱性蛋白、亚甲蓝、链霉素等；5.抑制蛋白分解的物质，例如抑肽酶；6.促进组织生长的物质，例如成纤维生长因子、生长激素等；7.作为肿瘤栓塞时合并的抗肿瘤药物，例如顺钼等。本发明的包含类凝血酶的止血组合物还可根据具体剂型的需要而有选择地包括各种适宜的药用辅料，例如填充剂、赋形剂、矫味剂等。本发明的止血组合物的制备方法，可包括以下步骤将纤维蛋白原或纤维蛋白、以及类凝血酶按比例混合。本发明通过组合物形成纤维蛋白凝胶起作用。该纤维蛋白凝胶能快速有效控制外科手术过程中血液的流失，尤其在控制缓慢出血、体液渗出、针线处渗血、淋巴液渗出及实质性脏器的出血等方面具有显著特点。应用于人和动物组织或器官的无缝或有缝粘合、伤口闭合、止血和愈合等方面的治疗。本发明可通过以下方式实施，但不限于以下方式。1、纤维蛋白胶，其产品组成有四个组分1)冻干纤维蛋白原，每毫升含10-500毫克；2)纤维蛋白原溶解液；3)冻干类凝血酶，其含量为10500IU；4)类凝血酶溶解液。四个组分分别用西林瓶密封包装，并配有一种双联注射器。使用前，分别用两个注射器抽取两种溶解液，溶解相应冻干组分，再分别将两种溶解后的溶液用两只注射器抽出，并将两只注射器通过一个三通组装成双联注射器；使用时，将两种溶液同时等量混合喷涂到创面上，起到止血封闭创面的作用。2、止血贴，其产品特征将从人血或动物血中提取的纤维蛋白原粉和蛇毒提取的类凝血酶粉按合适的比例混合均勻。将混合物加入无水乙醇中搅拌均勻形成悬浮液，将载体例如胶原蛋白制成一定形状，其中一面与悬浮液接触，抽真空干燥即成。3、口服制剂包含类凝血酶的纤维蛋白封闭剂的口服剂型，可以制成各种口服剂型，例如片剂、胶囊剂、冲剂、滴丸等。口服制剂中除含有类凝血酶和纤维蛋白原外，还可含有血浆中多种活性因子例如纤维结合蛋白，还可添加抗酸剂、胃酸分泌抑制剂等，例如铝酸铋、氢氧化铝、尿囊素等。4、干粉剂将纤维蛋白原或纤维蛋白原复合物(包含纤维蛋白原、凝血因子XIII、纤维结合蛋白等)和类凝血酶分别冻干，按一定比例混合，还可添加其它成分例如抗生素。该干粉剂可直接用于伤口的涂抹。将纤维蛋白原或纤维蛋白原复合物和类凝血酶预先反应生成非交联的纤维蛋白，再用适合的方法制成干粉使用，方法可以是已知的如冻干方法、减压干燥法、有机溶剂沉淀法等和未知的干燥方法。本发明具有以下优势1、由于蛇与人类种属关系远，来源于蛇毒的类凝血酶并不携带人类能感染的病毒，减少了病毒感染的机会。2、类凝血酶与人和哺乳动物的凝血酶在结构上存在较大的差异，所以不会在体内引起交叉免疫反应。避免人体内凝血功能受损，引起出血症状。3、类凝血酶不会引起血块的收缩，这有助于愈合，减小疤痕。4、类凝血酶对热稳定，即使在低浓度时对热也稳定，使包含类凝血酶的止血组合物的产品稳定，使用周期长。为了更好地理解本发明的本质，下面通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。图1实施例1中类凝血酶制备的离子交换色谱图；图2实施例中类凝血酶制备的亲和层析色谱图。具体实施例方式本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。纤维蛋白原和类凝血酶的制备实施例1A纤维蛋白原的制备及其缓冲液将猪全血浆于37°C融化冷却至10°C以下，以预冷_20°C的体积百分比50%乙醇缓慢加入不断搅拌至终浓度为10%乙醇，作12小时沉淀处理，5000转30分钟离心。再将沉淀溶于中性Tri/枸橼酸盐-赖氨酸缓冲液，蛋白终浓度约1.5%(重量百分比)。然后在4°C再用预冷50%乙醇作1012小时的第二次10%乙醇沉淀。5000转30分钟离心，溶解沉淀成40mg/ml，然后除菌过滤、分装每瓶5ml冻干。纤维蛋白原溶解液为含0.02MPH7.4柠檬酸钠缓冲液。B类凝血酶制备及其缓冲液称取长白白眉蝮蛇毒(购自辽宁清源蝮蛇养殖厂)IOg,用0.02mol/LρΗ7·2Tris_HCl缓冲液提取4小时，以4000rpm/min离心30分钟，取上清液。将沉淀同法再提取一次，合并上清液，调整PH至7.2，得提取液。将提取液上于平衡好的DEAE-S印harose层析柱，先用0.02mol/LpH7.2Tris-HCl缓冲液洗脱未吸附杂质，再用含有00.5mol/LNaCl的缓冲溶液进行梯度洗脱，收集类凝血酶活性峰，见图1。得活性组分收集液A。将上述活性组分收集液A上于平衡好的亲和层析柱，先用含0.5mol/LNaClO.05mol/LTris-HClpH7.0缓冲液洗脱未吸附杂质；然后用含0.lmol/L洗脱剂1.5mol/LNaCl0.05mol/LTris-HClpH7.0缓冲液洗脱收集活性组分，得到活性组分收集液B，见图2。取活性组分收集液B，用截留分子量10，000D的透析袋对聚乙二醇浓缩至20ml左右，即为浓缩液C。检测其凝血酶活性为10000国际单位/ml，过滤除菌，冻干得冻干粉。类凝血酶溶解缓冲液为0.02MPH7.4缓冲液。包含类凝血酶的Ih血组合物的制备实施例2将按照实施例1中方法获得的纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，按100毫克纤维蛋白原和40国际单位(IU)类凝血酶比例混合，加入无水乙醇搅拌均勻，然后将胶原海绵的一面与悬浮液接触，真空干燥即得。实施例3将按照实施例1中方法获得的纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，按每粒200毫克纤维蛋白原和40国际单位(IU)类凝血酶，并加入20mg奥美拉唑和适量辅料，制得胶囊。实施例4将按照实施例1中方法获得的无菌纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，按100毫克纤维蛋白原和10国际单位类凝血酶混合，制成纤维蛋白干粉。实施例5将按照实施例1中方法获得的无菌纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，按100毫克纤维蛋白原和100国际单位类凝血酶混合，制成纤维蛋白干粉。实施例6将按照实施例1中方法获得的无菌纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，按100毫克纤维蛋白原和1000国际单位类凝血酶混合，制成纤维蛋白干粉。实施例7将按照实施例1中方法获得的无菌纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，按100毫克纤维蛋白原和10000国际单位类凝血酶混合，制成纤维蛋白干粉。实施例8按照实施例1中方法获得的无菌纤维蛋白原和类凝血酶冻干粉，将纤维蛋白原加入适量的蔗糖、组氨酸、精氨酸和白蛋白配成60mg/ml纤维蛋白原溶液，类凝血酶加入甘氨酸和白蛋白制成100国际单位/ml凝血酶溶液。实施例9在实施例2-8之一中，有选择地添加适当量的以下成分的一种或多种1.Ca2+，其离子浓度在1200mmol；2.从血浆中得到的凝血因子XIII、纤维结合蛋白和其它血浆中的蛋白；3.具有抑菌或杀菌作用的成分，例如庆大霉素、丁胺卡那霉素等；4.纤维蛋白原稳定增强因子，例如阳离子蛋白、聚阳离子化合物、多聚赖氨酸、碱性蛋白、亚甲蓝、链霉素等；5.抑制蛋白分解的物质，例如抑肽酶；6.促进组织生长的物质，例如成纤维生长因子、生长激素等；7.作为肿瘤栓塞时合并的抗肿瘤药物，例如顺钼等。本发明Ih血组合物的效果实骑实施例10肝切口的止血实验将SD大白鼠随机分为3组，即对照组、凝血酶组和实验组，每组10只动物。用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大白鼠，在肋缘下腹部正中24厘米切开，打开腹腔，暴露肝脏前叶，纵向切断，切口长约1厘米，创面对照组不处理，凝血酶组用600国际单位凝血酶处理，实验组用Iml纤维蛋白胶(50mg/ml纤维蛋白原1ml，500IU/ml类凝血酶1ml，临用前混合)处理，观察处理后20分钟内渗血情况，记录止血时间，并用棉球吸取渗出的血液，计算渗血量。结果见表1。结果显示渗血量和止血时间，实验组和凝血酶组及对照组有显著差异，实验组明显好于凝血酶组及对照组，存活率也高。表1大鼠肝出血创面比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例11股动脉切口模型实验动物30只健康Wistar大鼠180220g，雌雄各半，分为3组，即对照组、凝血酶组和实验组。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠35mg/kg，麻醉后仰面固定于手术台上。腹股沟部去毛，剥离股动脉，用止血夹夹住近心端，将动脉横向剪开占直径1/3的切口。立即擦去喷出的血液，实验组放包含类凝血酶的纤维蛋白胶干粉60mg(含纤维蛋白原58mg，类凝血酶200IU)；凝血酶组放500国际单位凝血酶粉于创口，打开止血夹，立即盖上纱布，用150g重的砝码压lmin。除去砝码，继续观察30min。记录止血时间，并计算30min内的失血量。结果见表2。表2大鼠股动脉切口实验比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果显示对照组在30分钟内不能止血，实验组在止血时间和失血量上与凝血酶组和对照组均有显著差异。实验组止血效果优于凝血酶组。以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。权利要求一种止血组合物，包括纤维蛋白原或纤维蛋白、以及类凝血酶，其中，类凝血酶与纤维蛋白原或纤维蛋白之比为0.01～100IU∶1mg。2.权利要求1所述的止血组合物，其特征在于，所述类凝血酶与纤维蛋白原或纤维蛋白之比为0.1IOIUImgo3.权利要求1所述的止血组合物，其特征在于，所述纤维蛋白原或纤维蛋白为溶液形式时，浓度为10120mg/ml。4.权利要求3所述的止血组合物，其特征在于，所述纤维蛋白原或纤维蛋白的浓度为40lOOmg/ml。5.权利要求1所述的止血组合物，其特征在于，所述纤维蛋白原来源于人血、牛血、猪血、以及马血的一种或多种。6.权利要求1所述的止血组合物，其特征在于，所述纤维蛋白为选自血纤维蛋白I、desBB血纤维蛋白、以及血纤维蛋白II的一种或多种。7.权利要求1所述的止血组合物，其特征在于，所述类凝血酶为蛇毒来源的类凝血酶。8.权利要求1所述的止血组合物，其特征在于，所述类凝血酶为溶液形式时，浓度为15000IU/ml。9.权利要求8所述的止血组合物，其特征在于，所述类凝血酶的浓度为501000IU/mlο10.权利要求19之一所述的止血组合物，其特征在于，所述止血组合物还包括以下的一种或多种1)Ca2+，离子浓度在1200mmol；2)从血浆中得到的凝血因子XIII、和/或纤维结合蛋白；3)具有抑菌或杀菌作用的成分；4)抑制蛋白分解的物质；5)促进细胞生长的细胞生长因子。11.要求19之一所述的止血组合物，其特征在于，所述止血组合物的剂型为纤维蛋白胶、止血贴、干粉剂、或口服制剂。12.要求1所述的止血组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤将纤维蛋白原或纤维蛋白、以及类凝血酶按比例混合。全文摘要本发明提供了一种新型的止血组合物，其包括纤维蛋白原或纤维蛋白、以及类凝血酶，其中，类凝血酶与纤维蛋白原或纤维蛋白之比为0.01～100IU∶1mg。由于类凝血酶形成的凝块不会引起收缩，而且类凝血酶不会引发交叉免疫反应，因而本发明的止血组合物能够克服现有包含凝血酶或凝血酶原的止血产品所存在的诸多缺点。文档编号A61K38/18GK101797378SQ20091007744公开日2010年8月11日申请日期2009年2月11日优先权日2009年2月11日发明者孔双泉,孙爽,宋梦薇,马骉申请人:北京赛生药业有限公司