专利名称：一个新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其止血活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药和蛋白质酶学领域。具体的讲，其涉及一种从尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一种具有止血活性的类凝血酶(Agacutase)的结构特征和医药领域方面的用途。该止血效应的类凝血酶(Agacutase)通过激活纤维蛋白原而加强凝血，同时因不激活II和XIII因子，不会引起体内血栓形成。
背景知识尖吻蝮蛇又称五步蛇或蕲蛇，分布在华南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性较低，无神经毒和激肽释放酶活性。在其组份中，以纤维蛋白原为底物的酶分布十分丰富，这些酶在体外能使人血浆和牛纤原凝结，但在体内却引起各种不同的生理效应如降纤抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。Kornalic F将以纤维蛋白原为底物的蛇毒酶按其作用机理分成三类I类是类凝血酶(Thrombin-like enzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它仅分解纤维蛋白原的α链和/或β链的N端肽链，释放A肽(α链)和/或B肽(β链)，使血液凝固。II类是纤维蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它直接从纤维蛋白原三条肽链(α，β和γ)的C端水解，将纤原分解成碎片，血液不被凝固。III类是纤溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纤维蛋白溶解的间接或直接激活剂，它通过激活纤溶酶原产生纤溶酶，来裂解纤维蛋白或纤维蛋白原。本发明在低浓度给药剂量(≤1U/kg)下属第I类，在给药剂量大于1.5单位/kg时，由于对血纤维蛋白原较高的活力，大量消耗纤原，引起血管t-PA的释放，会激活纤溶酶原产生溶拴效应。
尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组份，经动物实验验证，它们均有不同程度抗凝作用，其中的Acutin，分子量41KD，后被发展成降纤酶。肖昌华等从1988年起和管锦华等从1992年起，多次偿试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离使动物凝血时间缩短的组份，但都因无法提纯，对其结构无法准确定性和定量，未成功。2001年，由沈阳赛诺科技发展有限公司、长春市斯达生物技术有限责任公司和北京赛生科技发展有限公司联合成功地在国内生产立止血产品，该产品自矛头蝮蛇(Bathrops atrox)提取，分子量36000±5000Da，市场名巴曲停，英文名Hemocoagulase。2005年辽宁锦州医学院牟萍等自长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii ussurensis)中提取35.5KDa的具有止血活性的类凝血酶，该类凝血酶N端15个氨基酸残基测序发现，与立止血一致，该类凝血酶仿制立止血，被发展成商品名为邦停上市。2006年西北师范大学王艳妮等自广西园斑蝰蛇(Viper russellii)毒提取了具有止血活性的X因子激活剂，该凝血酶在极低剂量(0.000313U/kg)下，对小鼠和大鼠显示良好的止血活性。
国外相似的产品有Hemocoagulase，Bothropase和Reptilase。Hemocoagulase它是Klobusitzky和Konig等1936年从Bothrops jararaca蛇毒中部分纯化的一个局部和非胃肠使用的安全止血剂，Bothropase由米兰Ravizzo公司从Bothrops jararaca蛇毒中提取，Reptilase由BaslePentapharm公司从Bothrops atrox蛇毒中提取。这些产品仅有立止血(Reptilase)的品种在国内由深圳建安医药公司代理销售。立止血疗效确切，付作用小，临床适应症广，优于其它止血药等特点，于1996年进入中国国家基本药物目录。
自从Reptilase进入中国以来，国内许多研究者都尝试寻找过类似的止血成分，如中科院上海生化所戚正武研究员曾申请国家863计划，但未成功。自1993年起，我们开始研究尖吻蝮蛇蛇毒中的类凝血酶组分。经13年的努力，我们获得了五个新的类凝血酶。以后的研究证实，至少两种具有止血活性。本文的类凝血酶取名Agacutase。
发明内容
1本发明的类凝血酶(Agacutase)作用方式与Reptilase相似，能使人血浆和牛纤维蛋白原在体外凝固，因不激活XIII和II因子，产生可溶性非交联纤维蛋白单体。在伤口处，该单体与其它凝血因子相互作用加速止血效应，在完整血管内，该单体有几分钟半衰期，可迅速被纤溶酶降解清除。该类凝血酶(Agacutase)在体外使柠檬酸化血浆凝固，在体内可使出凝血时间显著缩短，同时又不造成血栓形成，达到伤口部位的止血或预防出血之目的。
2本发明的目的是提供具有预防临床手术出血、治疗外伤出血及全身和局部止血效应的尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)，确定其准确的物理化学性质、结构特征和药学效果。
3本发明的目的是提供该尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)肽链的N端15个氨基酸残基序列，用于与其它类凝血酶的结构区别。
4一种具有防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶4.9)法测得其分子量为37KDa，由单肽链组成，该酶最适温度为37℃(见图7))，最适pH7.5(见图8)，等电点为5.86(见图9，10)，根据文献和我们的试验结果证实，该类凝血酶(Agacutase)结构与立止血、巴曲停、邦停、和我们此前申请的Agacutin等完全不同。
5用生化方法纯化后的类凝血酶(Agacutase)，SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法测定的分子量为37KD(见图1)，正相HPLC测定为单一峰(见图2)，PAGE为单一带(见图3)。比较几种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的分子大小和结构(图2、3、4、5、6)，发现Agacutase与Acutin和Agacutin具有明显不同的分子大小和结构。该类凝血酶在体外能使新鲜人血浆和牛纤原凝固，血浆凝结比活大于500单位/mg。N端15个氨基酸残基测序结果Val-Ile-Gly-Gly-Asn-Glu-Cys-Asp-Thr-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
6体内药效学验证纯化后的尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)经新西兰白兔耳静脉注射，实验采用三个剂量组
，在给药后10，30，60，180分钟，使全血凝固时间(表1)明显缩短。各实验剂量组静脉注射使血纤维蛋白原含量(表2)有不同程度的减少。对家兔凝血活酶时间(表3)、血小板数量(表4)无明显影响。对优球蛋白溶解时间(表5)，该类凝血酶在大剂量下，可使溶解时间略缩短。本试验设立立止血阳性对照组和生理盐水阴性对照组，肌注后，相同剂量的本品与立止血对照组比较，两者药效相近，但优于生理盐水组对照组。
7常用适用途径有肌肉注射，静脉注射，可局部或全身使用等。
8药效学见表1～6。
表1尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)对新西兰兔全血凝固时间的影响(x±s，n＝3)
*P＜0.05，**P＜0.01给药前后的t检验表2尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)对新西兰白兔纤原含量的影响(x±s，n＝3)
*P＜0.05，**P＜0.01给药前后的t检验表3尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)对新西兰白兔APTT的影响(x±s，n＝3)
表4尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)对血小板数量的影响(x±s，n＝3)
表5类凝血酶(Agacutase)对优球蛋白溶解时间(ELT)的影响(x±s，n＝3)
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组相比表6尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutase)对小鼠剪尾出血时间的影响
*P＜0.05，与生理盐水组相比
图1类凝血酶Agacutase的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶4.9)。Lane1和2Agacutase(37KDa)，Lane3标准分子量蛋白(14.4～97.4KDa)。
图2类凝血酶(Agacutase)凝胶HPLC分析。实验条件色谱(色谱柱BIOSEPSEC-S2000，Phenomenx型号，7.8×300mm，Pharmacia-LKB Co.；色谱仪岛津LC-10A)、0.2M磷酸盐缓冲液(pH6.8)和1ml/min流速。
图3类凝血酶(Agacutase)的聚丙烯酰胺凝胶电泳(T∶C＝7.5∶4.9)分析。Lane1Agacutin；Lane2和3Acutin；Lane4和5Agacutase；Lane6标准蛋白(未标出)。
图4尖吻蝮蛇蛇毒不同类凝血酶(Agacutase和Acutin)的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶4.9)。Lane1和2Agacutase(37KDa)，Lane3Acutin(41KDa)，Lane4标准分子量蛋白(14.4～97.4KDa)。
图5尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutin)凝胶HPLC分析。
图6尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Acutin)凝胶HPLC分析。
图7温度-活性曲线。凝结实验条件0.2ml人拘橼酸化血浆+0.2mlAgacutase酶溶液(0.2U)，不同温度保温测活。
图8pH-活性曲线。凝结实验条件0.2ml人拘橼酸化血浆+0.2mlAgacutase不同pH酶溶液(0.2U)，37℃保温测活。
图9类凝血酶(Agacutase)的等电聚焦电泳分析。Lane AAgacutase；LaneBAgacutin；Lane C标准等电点蛋白(未标出)。
图10pH值与凝胶长度关系曲线。
具体实施例方式1类凝血酶Agacutase.的活性用生物化学方法纯度的Agacutase，见结果(图1、2、3)；凝胶正相为单一峰，SDS-PAGE和PAGE电泳带为单一条带。制剂成品每支含1单位类凝血酶(1单位的类凝血酶Agacutase是指在37℃保温条件下，使0.2ml人新鲜血浆在60±5秒凝结的酶量)。
2结构特征用生物化学方法制备的类凝血酶Agacutase，测其分子量(SDS-PAGE法)为37kDa，等点电5.86；最使温度37℃；最适pH7.5。N端15个氨基酸残基的测序Val-Ile-Gly-Gly-Asn-Glu-Cys-Asp-Thr-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。实验结果见图7-10。
3体内药效学研究用生物化学方法制备的Agacutase，制剂成品[1单位/瓶，冻干粉剂，内含1％微分子右旋糖酐敷料(敷料由中国药品鉴定所提供)，在新西兰白兔和小鼠体内进行了药学评估。阳性对照品立止血(Reptilase)，批号770604，市售，1单位/瓶，瑞士巴塞尔素高大药厂生产。两种冻干粉针临用前用灭菌注射用水注入瓶，轻轻振摇，速溶。小白鼠，17-22g，雌雄兼有；新西兰白兔，2-3kg体重，雌雄兼有，由南方医科大学动物中心提供。制剂由耳静脉给药，直接心脏取全血。实验结果见表1-6。
权利要求
1.一种防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)，其特征在于其分子量37KDa，单肽链组成，最适温度37℃，最适pH7.5，等电点5.86。
2.根据权利要求1所述的类凝血酶，其特征在于N端15个氨基酸残基的序列Val-Ile-Gly-Gly-Asn-Glu-Cys-Asp-Thr-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
3.根据权利要求1和2所述的类凝血酶，其特征在于在体外，促进人枸橼酸化血浆凝固和能使牛纤维蛋白原凝固，血浆凝结比活大于500单位/mg，在体内，低剂量使凝血时间缩短。
4.根据权利要求1和2所述的类凝血酶，其特征在于可预防临床手术出血，治疗外伤出血及全身和局部止血。
5.根据权利要求1和2所述的类凝血酶，其特征在于不仅可肌肉注射，还可静脉注射和静脉滴注，不仅全身，还可局部使用。
全文摘要
本发明的类凝血酶涉及生物医药和酶学领域。具体地讲，涉及一种从尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的结构特征，纯化方法和医药领域用途。该酶分子量为37KDa(SDS－PAGE法)，单肽链组成，其N端15个氨基酸残基的序列Val－Ile－Gly－Gly－Asn－Glu－Cys－Asp－Thr－Asn－Glu－His－Arg－Phe－Leu。HPLC为单峰。该酶最适温度为37℃，最适pH 7.5，等电点为5.86。血浆凝结试验在60±5秒，同时可使纤原凝结，血浆比活大于500U/mg。该酶在体内使全血凝固时间显著缩短，不造成血栓形成，用于预防临床手术出血、治疗外伤出血、全身和局部止血。
文档编号A61K38/48GK1958790SQ20061003668
公开日2007年5月9日 申请日期2006年7月27日 优先权日2006年7月27日
发明者唐松山 申请人:唐松山