专利名称：氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医疗技术领域，涉及一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的制备 以及将其用于改善与血液接触医疗设备的血液、生物相容性的涂层方法，特别涉及一种氧 化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层体外循环管道的制备方法。
背景技术：
体外循环是目前心脏外科的常规技术。体外循环主要由连接管道、氧合器、贮血 器、动脉微栓过滤器等部分组成，其构成材料多为聚氯乙烯、聚四氟乙烯、涤纶、聚乙烯、硅 橡胶和不锈钢等化学物质。由于这些人工合成材料的生物相容性欠佳，与血液接触后可引 起机体的体液和细胞激活(尤其是补体系统)，从而导致患者术后发生全身炎症反应综合 症、败血症以及多器官功能衰竭等并发症，直接影响患者术后的康复。体外循环管道表面改性是改善其生物相容性的重要手段。在众多的表面改性处理 方法中，肝素涂层技术因具有操作方法简便、效果确切、价格合适等特点而首先获得了临床 认可和商品化应用。大量的相关实验研究和临床应用表明肝素涂层能够有效改善体外循环 管道的生物相容性，降低血液的激活，减少炎性因子和氧自由基的产生，从而减轻患者术后 的全身炎症反应。肝素涂层技术是体外循环管道表面改性的一个重要里程碑，然而由于肝 素分子本身的特性，肝素涂层表面仍具有对血浆蛋白吸附不具选择性和不能完全阻止手术 创面所介导的血液激活等局限，而血浆蛋白吸附则恰恰是引起血液与人工材料表面相互作 用的始动因素。以往有研究人员成功合成出了一种基于非酶糖基化反应的抗凝血酶-肝素共价 复合物(以下简称复合物)，并对其进行了一系列研究，发现该复合物具有强大的直接和间 接抑制凝血酶活性，其对血浆蛋白和内皮细胞的吸附较肝素明显减少，更令人欣喜的是该 复合物还能抑制纤维蛋白结合的凝血酶活性和使结合有凝血酶的纤维蛋白血栓具有抗凝 血活性，从而能有效的抑制手术创面所介导的血液激活(见Thrombosis Research, 2007, 120(2) :151_160)。该复合物的制备方法主要涉及抗凝血酶赖氨酸残基的ε _氨基与具有 抗凝血酶结合特异五糖及醛糖共同末端的肝素分子发生非酶糖基化作用和丁基_琼脂糖 快流速疏水层析及二乙基氨基乙基_琼脂糖快流速阴离子交换层析。然而，由于这种特殊 末端的肝素分子在天然肝素分子中比例仅约为0. 4%，且两步层析纯化过程中复合物会有所 消耗，故该方法最终获得的复合物合成率约为50%。另外，最近有研究表明高碘酸钠能有效地将肝素分子中的羟基氧化为醛基，并且 肝素分子量的大小与其对血浆蛋白和内皮细胞的吸附性成正相关。(见J Biomed Mater Res Α，2007，86Α(3) 648-661 和 Thromb Haemost,2004,91 (5) 1009-1018)。
发明内容
本发明针对肝素涂层体外循环管道仍具有对血浆蛋白吸附不具备选择性和不能 完全阻止手术创面所介导的血液激活等技术缺陷，制备一种氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物，并应用聚乙烯亚胺-戊二醛结合技术将其固定于体外循环管道表面，以进一步改 善体外循环管道的生物相容性。为了实现上述技术任务，本发明提供一种氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物制 备方法，利用该方法制得的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物作为涂层剂应用于体外循 环管道涂层技术中，进一步改善体外循环管道的生物相容性。本发明所制备出的氧化低分 子量肝素_抗凝血酶复合物涂层体外循环管道具有较肝素涂层和低分子量肝素涂层体外 循环管道更佳的涂层稳定性、抗凝血性能和生物相容性，减轻了血液与体外循环管道表面 接触所引起的炎性介质生成、释放和凝血系统激活。本发明采用如下技术方案实现上述技术目的
一种氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物制备方法，该方法包括如下步骤 (1)将高碘酸钠和低分子量肝素钠注射液进行室温避光反应，然后采用离心超滤装置 进行超滤离心，得到氧化低分子量肝素钠溶液。(2)将上述氧化低分子量肝素钠溶液与抗凝血酶在磷酸盐缓冲生理盐水中进行第 一次水浴反应，促使氧化低分子量肝素的终末醛糖残基与抗凝血酶的赖氨酸残基的ε _氨 基发生非酶糖基化反应而生成希夫碱，并进而发生阿马多利分子重排形成稳定的共价复合 物，然后加入氰基硼氢化钠溶液进行第二次水浴反应，以还原未发生阿马多利分子重排的 希夫碱。(3)将步骤(2)得到的混合溶液首先通过离心超滤装置进行超滤离心；然后用三 羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液透析；随后利用二乙基氨基乙基_琼脂糖快流速阴离子交换 层析进行纯化；最后经过磷酸盐缓冲生理盐水透析，得到氧化低分子量肝素_抗凝血酶复 合物溶液。遵照上述方法制得的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物用作涂层剂，利用聚乙 烯亚胺-戊二醛结合方法将其固定于与血液接触医疗设备表面，特别是体外循环管道表 本发明与现有技术相比具有以下优点(1)本发明选用低分子量肝素作为复合物 的合成原料，从而减少了复合物对血浆蛋白的吸附性。(2)本发明利用高碘酸钠将低分子量 肝素分子中的羟基氧化为醛基，从而使具有抗凝血酶结合特异五糖及醛糖共同末端的低分 子量肝素分子比例提高，并且通过醛基与抗凝血酶分子中的氨基非特异性结合以增加低分 子量肝素对抗凝血酶的亲和性，促使更多的低分子量肝素分子与抗凝血酶发生非酶糖基化 反应而生成最终的目的复合物。(3)本发明采用离心超滤和二乙基氨基乙基-琼脂糖快流 速阴离子交换层析取代丁基-琼脂糖快流速疏水层析及二乙基氨基乙基-琼脂糖快流速阴 离子交换层析两步层析法，从而减少了纯化过程中复合物的消耗，从而提高了最终复合物 的合成率，达到55%。(4)本发明所应用的聚乙烯亚胺-戊二醛结合技术中选用的聚乙烯亚 胺是一种高分子量的阳离子聚合物(相对平均分子量20000)，具有多个活性亚胺基团，与聚 氯乙烯体外循环管道具有极好的亲和力。而戊二醛在聚乙烯亚胺-戊二醛结合过程中起交 联剂的作用，其分子中的一个醛基与聚乙烯亚胺的亚胺基共价结合，另一个醛基则可与生 物活性分子的氨基等活性基团共价结合。因此本发明制得的氧化低分子量肝素-抗凝血酶 复合物能够牢固固定于聚氯乙烯体外循环管道表面，更好地发挥其生物学活性。
图1为本发明实施例中四种不同涂层聚氯乙烯管道的动态凝血时间曲线图。图2为本发明实施例中四种不同涂层聚氯乙烯管道内表面放大1000倍的扫描电 镜照片，其中各字母分别表示N:无涂层组H:肝素涂层组L:低分子量肝素涂层组S:氧 化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组。
具体实施例方式根据上述技术原理，本发明提供了一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物制备 方法，该方法包括如下步骤
(1)将过量的高碘酸钠和低分子量肝素钠注射液在室温避光条件下反应30分钟，并采 用截留分子量为3K的Amicon Ultra-4离心超滤装置超滤离心3次，得到氧化低分子量肝 素钠溶液，其中所述的低分子量肝素钠平均分子量为5000。(2)将步骤(1)得到的氧化低分子量肝素钠溶液与抗凝血酶在0. 02mol/L pH7. 3 磷酸盐缓冲生理盐水中40。C水浴反应14天，促使氧化低分子量肝素的终末醛糖残基与抗 凝血酶的赖氨酸残基的ε _氨基发生非酶糖基化反应而生成希夫碱，并进而发生阿马多利 分子重排形成稳定的共价复合物，然后加入0.5mol/L NaBH3CN溶液，在37 ° C继续进行水 浴反应5小时，以还原未发生阿马多利分子重排的希夫碱，得到氧化低分子量肝素-抗凝血 酶复合物和未共价结合的抗凝血酶及氧化低分子量肝素的混合溶液；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液首先用截留分子量为50K的Amicon Ultra-4离心超 滤装置超滤离心3次，然后用0. 01mol/L pH8. 0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液透析24小 时，随后进行二乙基氨基乙基-琼脂糖快流速(DEAE-Si^pharose Fast Flow)阴离子交换层 析，最后经过0. 02mol/L pH7. 3磷酸盐缓冲生理盐水透析24小时后，即得到氧化低分子量 肝素_抗凝血酶复合物溶液。遵循上述制备方法制得的氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物可以用作涂层剂， 利用聚乙烯亚胺_戊二醛结合的方法将其固定于与血液接触医疗设备(体外循环管道)表 面，进一步改善体外循环管道的生物相容性。本发明采用如下方法将氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物固定于体外循环管 道表面，形成氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层。首先，将聚氯乙烯体外循环管道用 乙醇超声波清洗30分钟，再用去离子水清洗30分钟，然后在真空干燥箱中充分干燥，得到 洁净的聚氯乙烯体外循环管道；随后，分别称取质量分数为40%的聚乙烯亚胺溶液和质量 分数为50%的戊二醛溶液5g和10g，用去离子水稀释至5%，然后将稀释后的聚乙烯亚胺溶 液逐滴加入到稀释后的戊二醛溶液中，边滴加边摇晃，最后用滤纸过滤，得到棕黄色的5wt% 的聚乙烯亚胺-戊二醛溶液。其次，将5wt %的聚乙烯亚胺-戊二醛溶液缓慢注入洗净的 聚氯乙烯体外循环管道，37。C中水浴30分钟后倒出剩余溶液，反复进行3次，并在真空常 温下干燥，得到聚乙烯亚胺_戊二醛结合聚氯乙烯体外循环管道；最后，将氧化低分子量肝 素_抗凝血酶复合物溶液缓慢注入聚乙烯亚胺_戊二醛结合聚氯乙烯体外循环管道，37^ C 中水浴30分钟后倒出剩余溶液，反复进行3次，并在真空常温下干燥，得到氧化低分子量肝 素-抗凝血酶复合物涂层聚氯乙烯体外循环管道。其中聚乙烯亚胺-戊二醛溶液中聚乙烯 亚胺和戊二醛的质量比约为1:2. 5，所选用聚乙烯亚胺的平均分子量为20000。
以下是发明人给出的具体实施例及其相关性能检测试验，需要说明的是本发明并 不局限于以下实施例。实施例氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层聚氯乙烯管道的制备及其理化 性能检测
将2g高碘酸钠和8ml低分子量肝素钠注射液加入25ml的容量瓶中，然后加去离子水 至25ml，室温避光反应30分钟；用截留分子量为3K的Amicon Ultra-4离心超滤装置在 室温下6500rpm离心20min，丢弃超滤液，向保留液中补充去离子水，重复离心3次，得到约 2ml氧化低分子量肝素钠溶液。将2mg 抗凝血酶、0. 18g NaCl,0. 44ml 0. 2mol/L NaH2PO4 溶液、1. 56ml 0. 2 mol/L Na2HPO4溶液、氧化低分子量肝素钠溶液及16ml去离子水充分混合，得到约20ml的混合反 应液，放入40° C水浴中反应14d ；向上述混合反应液中加入2ml 0. 5mol/L氰基硼氢化钠溶 液，放入37。C水浴中继续反应5h，得到氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物和未共价结合 的抗凝血酶及氧化低分子量肝素的混合液。用截留分子量为50K的Amicon Ultra-4离心超滤装置将上一步所获得的混合液 在室温下6500rpm离心5min，丢弃超滤液，向保留液中补充0. 02mol/L pH7. 3的磷酸盐缓冲 生理盐水，重复离心3次，收集保留液；将保留液移入预处理过的透析袋中，然后放入400ml 的0. 01mol/L pH8. 0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中4° C下透析24h，每4h更换一次 透析液；待透析完毕以后，将透析袋内的保留液上预先用0. 01mol/L pH8. 0三羟甲基氨基 甲烷_盐酸缓冲液平衡好的二乙基氨基乙基_琼脂糖快流速阴离子交换层析预装柱，流速 0. 5ml/min ；上样结束后，再先后用含 0. 2mol/L 和 2mol/L NaCl 的 0. 01mol/L pH8. 0 三羟 甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液分步洗脱，流速0. 5ml/min,收集第二个蛋白质峰的洗脱液；最 后将收集的洗脱液移入透析袋中，放入400ml 0. 02 mol/L pH7. 3的磷酸盐缓冲生理盐水中 C下透析24h，每4h更换一次透析液，透析完毕后，透析袋内的保留液即纯化的氧化低分 子量肝素_抗凝血酶复合物溶液，4。C保存备用。将直径3mm，长50cm的聚氯乙烯管道用乙醇超声波清洗30min，再用去离子水清洗 30min，在真空干燥箱中干燥得到洁净的聚氯乙烯管道。分别称取质量分数为40%的聚乙烯亚胺溶液和质量分数为50%的戊二醛溶液5g 和10g，用去离子水稀释至5%，然后将稀释后的聚乙烯亚胺溶液逐滴加入到稀释后的戊二 醛溶液中，边滴加边摇晃，最后用滤纸过滤，得到棕黄色的5wt%的聚乙烯亚胺-戊二醛溶 液。将洁净的聚氯乙烯管道一端封闭，另一端缓慢注入5wt%的聚乙烯亚胺_戊二醛溶 液，37。C中水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥，即得聚乙烯亚胺-戊
二醛结合聚氯乙烯管道。将聚乙烯亚胺-戊二醛结合聚氯乙烯管道一端封闭，另一端分别缓慢注入500 U/ mL pHl.O的肝素钠水溶液、500 IU/mL pHl. 0的低分子量肝素钠水溶液和氧化低分子量肝 素_抗凝血酶复合物溶液，37。C中水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥， 最终得到肝素涂层、低分子量肝素涂层和氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层聚氯乙 烯管道。采用分光光度法和动态凝血时间实验分别测定氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物合成率以及不同涂层聚氯乙烯管道的涂层结合密度、涂层脱落率和抗凝血性能。结果 表明氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物的合成率约为55% ；低分子量肝素涂层组的涂层 结合密度最大，肝素涂层组次之，氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层组最小；将各组 管道置于生理盐水中浸泡1个月后，低分子量肝素涂层组的涂层脱落率最大，肝素涂层组 次之，氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组最小，并且氧化低分子量肝素_抗凝血 酶复合物涂层组与肝素涂层、低分子量肝素涂层组之间有显著差异(/X0. 05)，而肝素涂层 组和低分子量肝素涂层组之间无显著差异0°>0. 05)(参见表1);动态凝血时间曲线显示各 组管道的吸光度值随时间的延长而减小，任意时刻吸光度值的大小排序均为氧化低分子量 肝素_抗凝血酶复合物涂层组 > 低分子量肝素涂层组 > 肝素涂层组 > 无涂层组，其中氧化 低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层组的吸光度值明显大于其余各组，亦即氧化低分子量 肝素_抗凝血酶复合物涂层的抗凝血性能明显优于肝素涂层和低分子量肝素涂层(参见图 1)。
表1各组管道的涂层结合密度及浸泡1个月后的涂层脱落率比较(Π=6, X 士s)
注与氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组比较，aZXO. 05 ；与低分子量肝素涂 层组比较，>>0. 05
实施例2 氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层聚氯乙烯管道的生物相容性评价 用实施例1中制备的肝素涂层、低分子量肝素涂层和氧化低分子量肝素-抗凝血酶复 合物涂层聚氯乙烯管道进行生物相容性评价实验。实验分为对照组、无涂层组、肝素涂层 组、低分子量肝素涂层组和氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组共5组。将人抗凝 全血用Chandlar-Loop模型体外模拟转流4h后，分别测定各组的血小板计数、纤维蛋白原 含量及血浆白细胞介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)的浓度，并用扫描电镜观 察各组管道的内表面情况。结果表明各组血小板计数(X109/L)和纤维蛋白原含量(g/L) 均较对照组基线值有所下降，其中氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组下降程度最 小，与肝素涂层、低分子量肝素涂层两组间有显著性差异O°<0. 05)，且肝素涂层组和低分子 量肝素涂层组之间也有显著性差异O°<0. 05)(参见表2)；各组血浆IL-8和MCP-I的浓度 (pg/ml)均较对照组基线值有所升高，其中氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层组升 高程度最小，与肝素涂层、低分子量肝素涂层两组间有显著性差异O°<0. 05)，而肝素涂层组 和低分子量肝素涂层组之间无显著性差异O°>0. 05)(参见表3)。扫描电镜观察结果显示 肝素涂层、低分子量肝素涂层、氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组较无涂层组均 减少了血小板和纤维蛋白粘附，其中氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层组管道的表 面情况明显优于肝素涂层组和低分子量肝素涂层组，低分子量肝素涂层组略优于肝素涂层组(参见图2)。
表2各组血小板计数和纤维蛋白原含量变化的比较(n=6, i 士s)
注与氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物涂层组比较，aZXO. 05 ；与低分子量肝素涂 层组比较，bZXO. 05 ；与对照组比较，^>0. 05
表3各组IL-8和MCP-I浓度变化的比较(n=6，i 士s)
注与对照组比较，aZXO. 05;与氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层组比较， bZXO. 05 ；与低分子量肝素涂层组比较，^>0. 0权利要求
一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将高碘酸钠和低分子量肝素钠注射液中进行室温避光反应，然后采用离心超滤装置进行超滤离心，得到氧化低分子量肝素钠溶液；(2)将步骤(1)得到的氧化低分子量肝素钠溶液与抗凝血酶在磷酸盐缓冲生理盐水中进行第一次水浴反应，促使氧化低分子量肝素的终末醛糖残基与抗凝血酶的赖氨酸残基的ε-氨基发生非酶糖基化反应而生成希夫碱，并进而发生阿马多利分子重排形成稳定的共价复合物，然后加入氰基硼氢化钠溶液进行第二次水浴反应，以还原未发生阿马多利分子重排的希夫碱，得到氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物和未共价结合的抗凝血酶及氧化低分子量肝素的混合溶液；(3)将步骤(2)得到的混合溶液首先通过离心超滤装置进行超滤离心；然后用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液透析；随后利用二乙基氨基乙基-琼脂糖快流速阴离子交换层析进行纯化；最后经过磷酸盐缓冲生理盐水透析，得到氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物溶液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中将高碘酸钠和低分子量肝素 钠注射液室温避光反应30min，并采用截留分子量为3K的离心超滤装置超滤离心3次，得到 氧化低分子量肝素钠溶液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中氧化低分子量肝素钠溶液与 抗凝血酶在0. 02mol/L pH7. 3磷酸盐缓冲生理盐水进行第一次40° C水浴反应14天，然后 加入0. 5mol/L氰基硼氢化钠溶液进行第二次37。C水浴反应5小时。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中将步骤(2)得到的混合溶液 首先用截留分子量为50K的离心超滤装置超滤离心3次，然后用0. 01mol/L pH8. 0三羟甲 基氨基甲烷_盐酸缓冲液透析24小时，随后进行二乙基氨基乙基_琼脂糖快流速阴离子交 换层析，最后经过0. 02mol/L pH7. 3磷酸盐缓冲生理盐水透析24小时后，得到氧化低分子 量肝素_抗凝血酶复合物溶液。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述的低分子量肝素钠的平均分 子量为5000。
6.由权利要求1所述的制备方法制得的氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物的用途， 其特征在于该氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物作为涂层剂。
7.如权利要求6所述的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的用途，其特征在于涂 敷所述的氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物制成所述氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合 物涂层的与血液接触医疗设备。
8.如权利要求7所述的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的用途，其特征在于在 与血液接触医疗设备表面涂敷的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层采用聚乙烯亚 胺-戊二醛结合的方法。
9.如权利要求7或8所述的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的用途，其特征在于 所述的与血液接触医疗设备为体外循环管道。
10.如权利要求9所述的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的用途，其特征在于所 述的聚乙烯亚胺_戊二醛结合方法首先将聚氯乙烯体外循环管道用乙醇超声波清洗30分钟，再用去离子水清洗30分钟，然后在真空干燥箱中充分干燥，得到洁净的聚氯乙烯体外 循环管道；其次，将5wt %的聚乙烯亚胺-戊二醛溶液缓慢注入洗净的聚氯乙烯体外循环管 道，37。C中水浴30分钟后倒出剩余溶液，反复进行3次，并在真空常温下干燥，得到聚乙烯 亚胺_戊二醛结合聚氯乙烯体外循环管道；最后，将氧化低分子量肝素_抗凝血酶复合物溶 液缓慢注入聚乙烯亚胺_戊二醛结合聚氯乙烯体外循环管道，37。C中水浴30分钟后倒出 剩余溶液，反复进行3次，并在真空常温下干燥，得到涂敷氧化低分子量肝素_抗凝血酶复 合物涂层的聚氯乙烯体外循环管道；所述的聚乙烯亚胺_戊二醛溶液中聚乙烯亚胺和戊二醛的质量比为1:2. 5 ； 所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为20000。
全文摘要
本发明公开了一种氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物的制备以及将其用于改善体外循环管道血液、生物相容性的涂层方法。首先通过高碘酸钠氧化低分子量肝素，然后与抗凝血酶发生非酶糖基化反应，经离心超滤和二乙基氨基乙基-琼脂糖快流速阴离子交换层析而得到纯化的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物，再应用聚乙烯亚胺-戊二醛结合技术将该氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物固定于体外循环管道表面。本发明所制备出的氧化低分子量肝素-抗凝血酶复合物涂层体外循环管道具有较肝素涂层和低分子量肝素涂层体外循环管道更佳的涂层稳定性、抗凝血性能和生物相容性，减轻了血液与体外循环管道表面接触所引起的炎性介质生成、释放和凝血系统激活。
文档编号A61L33/10GK101879335SQ20101021909
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者刘维永, 周华, 易定华, 曹瑞军, 杨丽芳, 杨剑, 杨春, 罗鹏 申请人:中国人民解放军第四军医大学