凝血酶衍生物以及含有所述凝血酶衍生物的医药组合物的制作方法

专利名称：凝血酶衍生物以及含有所述凝血酶衍生物的医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝血酶衍生物(thrombin derivatives)以及含有所述凝血酶衍生物的医药组合物)，特别是涉及抗血栓剂、抗炎剂。
背景技术：
凝血酶(thrombin)发挥着血小板聚集反应及炎症反应等的作用，是与胰蛋白酶(trypsin)的相同性非常高的如胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶(serine protease)。例如，非专利文献1中记载了凝血酶通过将作为基质(substrate)的凝血酶受体(thrombin receptor)活化，而引起血小板聚集反应、血管内皮细胞活化、炎症反应。
关于凝血酶的生理作用有如下报道。非专利文献2(日本血栓止血学会会刊第10卷(1999)第2、3号)中记载，在关于主要由凝血酶引起的与血液凝固的基质认识中，Exocite I区域有重要作用。在非专利文献3(Biochemical J.(2001)354.第309-313页)中记载，去水凝血酶(Anhydrothrombin)，其为具有凝血酶基质蛋白质(以下有时称为“凝血酶基质”)结合能力的非活化凝血酶，与野生型凝血酶同样地维持较高的可与Exocite I结合的凝血酶基质的结合能力。另外，非专利文献3中记载，通过如苯甲脒(benzamidine)的物质的添加，失去AHT的结合能力，而所述物质提供活性中心的立体位阻(steric hindrance)。非专利文献4(沃伊特生物化学(Voet biochemistry)(Donald Voet着)上卷1996年第331-340页东京化学同人)中记载，如凝血酶的丝氨酸蛋白酶在活性中心具有丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸，而这三个氨基酸的电荷中继系统(chargerelay system)引起蛋白酶活性的表现；甘氨酸193(193是胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen)中的氨基酸的位置，在凝血酶中是B链第203位的甘氨酸)参与从丝氨酸蛋白酶的米歇尔复合体(Michaelis complex)向4面复合体的进展。
在此基础上，为了开发抗血栓药等药物，业者现正尝试对各种凝血酶进行修饰及改变。专利文献1(国际公开第01/03740号手册)中，记载有一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其具有通过与丝氨酸蛋白酶竞争而与丝氨酸蛋白酶的基质结合，来抑制所述丝氨酸蛋白酶与所述基质发生反应的物质(以下有时称为“反应抑制物质”)。另外，在所述文献中记载，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂作为抗血栓剂(血栓形成抑制剂)有效。所述文献中记载有一种凝血酶衍生物(去水凝血酶(anhydrothrombin)，以下，称为“AHT”)作为所述反应抑制物质的具体例，其通过使作为丝氨酸蛋白酶的凝血酶与苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulphonyl fluoride)(以下有时称为“PMSF”)等抑制剂进行反应，将存在于活性部位的丝氨酸转换成脱氢丙氨酸(dehydroalanine)(以下，称为“去水化(anhydrolyze)”)，而使丝氨蛋白酶活性显着降低。
并且，在专利文献2(国际公开第02/077031号手册)中，公开有一种去水凝血酶(AHT)衍生物(以下，称为“M-AHT”)，其中使去水凝血酶(AHT)的羧基与酰亚胺反应，将AHT进行化学性修饰。M-AHT与大量存在于血液中的纤维蛋白原(Fibrinogen)(以下称为“Fbgn”)的结合能力选择性地低，与AHT相比可增加延长活化部分促凝血酶原激酶时间(Activated partialthromboplastin time)(以下称为“APTT”)的效果，从而具有较高的抗血栓效果。
在另一方面，业者现也正对氨基酸置换的凝血酶衍生物进行研究。关于通过凝血酶的基因重组(gene recombination)将活性中心的氨基酸置换的重组物，过去有如下述的几种研究。例如，在非专利文献5(Experimental cell research 219，第650-656页(1995))中记载，将活性中心丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物对白血球产生影响。另外，非专利文献5中记载，所述凝血酶衍生物失去其酶活性。
非专利文献6(Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999)第173-186页)中记载，将凝血酶B链203甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物、将活性中心丝氨酸置换成丙氨酸或苏氨酸的凝血酶衍生物、将活性中心组氨酸置换成天冬酰胺(Asparagine)的凝血酶衍生物，另外，将活性中心天冬氨酸(Aspartic acid)置换成天冬酰胺的凝血酶衍生物。所述非专利文献6中记载，关于这些凝血酶衍生物的酶活性，将活性中心丝氨酸置换成苏氨酸的凝血酶衍生物、将活性中心组氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶衍生物、将活性中心天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶衍生物的酶活性与野生型凝血酶相比，降低至数千至数万分之一；将凝血酶B链203甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物以及将活性中心丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物的酶活性完全失去。
然而，非专利文献5及6中所记载的凝血酶衍生物，残存有以各文献所记载的测定法无法检测水平的酶活性(凝血酶基质分解活性)，凝血酶基质结合能力显着降低，或者与血中大量存在的Fbgn具有较高的结合能等，由此难以说它们具有作为抗血栓剂、抗炎症剂的充分的功能。
在专利文献3(日本专利特表平09-509045号公报)、非专利文献7(J.Biol.Chem Vol.275，第39827-39830页)、非专利文献8(J.Biol.ChemVol.279，第26387-26394页)、非专利文献9(J.Biol.Chem Vol.277，第27581-27584页)中记载有，通过将氨基酸置换而具有酶活性(凝血酶基质分解活性)及抗血液凝固效果的凝血酶衍生物。这些凝血酶衍生物，是通过保持或增强与血栓调节蛋白(thrombomodulin)(以下，称为“TM”)的结合能力，并且使Fbgn分解能力显着降低，从而与TM特异性地结合且使蛋白质C活化，而表现抗血栓效果的凝血酶衍生物。
专利文献4(日本专利特表平11-507542号公报)中记载有，将活性中心氨基酸置换再进而将作为抗血栓剂的水蛭素(hirudin)C末端肽给患者使用，在产生出血等问题时，将中和其水蛭素C末端肽的抗凝固活性作为其目的的凝血酶原(Prothrombin)衍生物。
专利文献5以及6中记载有，将活性中心的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物、以及将活性中心的丝氨酸置换成丙氨酸而且将活性中心天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶衍生物，抑制了清洗血小板悬浊液中的凝血酶对凝血酶受体的刺激。
然而，这些凝血酶衍生物与血液中大量存在的Fbgn具有强结合能力。在将这些凝血酶衍生物投予到血中时，它们中的几乎所有部分与Fbgn结合，因此为了获得抗凝血酶受体效果，不可避免地进行大量投予，所以实际上不可能将这些凝血酶衍生物作为抗凝血酶受体剂(antithrombin receptoragent)(抗血小板剂)在血液中使用(参考本说明书实验例3)。
专利文献1国际公开第01/03740号手册专利文献2国际公开第02/077031号手册专利文献3国际公开第95/13385号手册专利文献4国际公开第96/41868号手册专利文献5国际公开第92/14750号手册专利文献6美国专利第5,256,766号说明书非专利文献1J.Biol.Chem.261(1986)第15928-15933页非专利文献2日本血栓止血学会志第10卷2、3号(1999)非专利文献3Biochemical J.(2001)354.第309-313页非专利文献4沃伊特生物化学上卷1996年第331-340页东京化学同人出版非专利文献5Experimental cell research 219，第650-656页(1995)非专利文献6Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999)第173-186页非专利文献7J.Biol.Chem第275卷，第39827-39830页非专利文献8J.Biol.Chem第279卷，第26387-26394页非专利文献9J.Biol.Chem第277卷，第27581-27584页发明内容通过如AHT及M-AHT的化学方法所获得的凝血酶衍生物，具有抗血栓效果及抗炎症效果，但是因为使用化学方法，所以残存的丝氨酸蛋白酶的活性不稳定。并且，在变换成AHT时，必须进行碱处理、再生处理等多个步骤，回收率为50至60％。于AHT以及M-AHT中，微量存在的残存酶活性(凝血酶基质分解活性)，有时会降低其抗凝固能力。尤其是在AHT中，这种倾向明显。
并且，将上述凝血酶的活性中心氨基酸置换的凝血酶衍生物，难以具有作为抗血栓、抗炎症剂的充分功能。一般认为其理由是，将这些凝血酶衍生物用于抗血栓、抗炎症剂的目的时，具有实质性的凝血酶基质分解活性，或者由于氨基酸置换的影响、主要是Exocite I的结构产生变化，由此使凝血酶基质结合能力显着降低等。
例如在非专利文献6(Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999)第173-186页)中报导，将凝血酶B链203甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物，其凝血酶基质分解活性完全丧失。然而，所述凝血酶衍生物，在用于抗血栓、抗炎剂的目的时，残存有实质性的凝血酶基质分解活性。另外，在非专利文献6中记载，凝血酶B链203甘氨酸、活性中心组氨酸、以及天冬氨酸的置换，更进一步降低凝血酶基质分解活性，但有时其组合会引起Exocite I的结构变化，因而凝血酶基质结合能力被削弱。
另一方面，如果将目光转移到实际医疗现状，则日本人的3大死因第1位的癌(30％)，第2位的心脏病(15％)，第3位的脑血管障碍(13％)，占整体疾病的约六成。心脏病大多是心肌梗塞、心绞痛的冠状动脉疾病，将心脏与脑合计的血管疾病在现实中成为与癌相同程度的死因，但是今后有进一步增加的倾向，因此对有效治疗药物的开发有着较大的社会需求。并且，脑梗塞患者即使不死亡，但也有许多残留后遗症的病例，因而巨大的护理、医疗费用的负担则变成社会性问题。
心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞等血栓病是由多个主要因素复合性而造成。现有报道如图48所示，在实际心肌梗塞的血栓中，对于白色血栓中的连续血流，在中游可观察到混合血栓，在下游可观察到红色血栓。
脑、心脏中的血管疾病中的大部分是血栓病。其主要原因是血流异常、凝固成分异常、血管内皮异常，但实际上是它们复合性地作用而引发血栓病。关于其全部，在血栓形成中起关键作用的是作为凝固酶的凝血酶。凝血酶在凝血连锁反应的最终阶段形成纤维蛋白聚集块，同时使XI、V、VIII因子活化而加速凝血连锁反应。并且，通过血小板以及血管内皮上的受体PAR1，引起血小板聚集及内皮细胞活化。内皮细胞的活化引起血管壁的凝固亢进，进而通过负连锁反应而促进血栓形成。已知在实际动脉血栓病理解剖中，在几乎所有病例中，可观察到白色、混合色、红色血栓，也因此在抗血栓治疗中，重要的是对凝固、血小板的复合性抑制。不仅如此，现有的抗血栓剂全部分类为抗凝剂或抗血小板剂，以各自药剂进行治疗。
考虑到上述状况，业者期望开发出可以用作抗血栓剂、抗炎症剂的抗血栓剂，从而可有效抑制(i)凝固的活化及促进、(ii)血小板的聚集及粘着、以及(iii)血管内皮细胞的活化功能。
本发明者发现以下所述。即，发现一种凝血酶衍生物，其中将从凝血酶B链的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的一种以上氨基酸置换，在实际上不分解凝血酶基质的水平上降低凝血酶基质分解活性，而且活性中心氨基酸的置换并不影响具有置换前凝血酶所具有的ExociteI及Exocite II的结构；所述凝血酶衍生物可获得将与AHT同样的APTT延长作为主要效果的抗血栓症效果，另外其APTT延长效果并不受以凝血酶残存活性为起因的培养的影响，从而可确实地延长APTT(参考实验例21)。另外，如果所述凝血酶衍生物对于对血栓形成起重要作用的凝血酶基质有更特异性的结合能力，则可更确实地获得超过AHT的抗血栓效果、抗炎症效果。
进而，发现通过将除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换，血中大量存在的与Fbgn的结合能力，与凝血酶受体或者血液凝固第VIII因子(以下称为“FVIII”)的结合能力相比，相对性地降低，可通过更少的投予量而获得良好的抗血栓效果。另外，发现通过除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换，而获得具有较高延长APTT效果但抗血小板效果较低类型的凝血酶衍生物、及具有较高延长APTT效果及较高抗血小板效果(其中仅为抑制PAR1的效果)类型的凝血酶衍生物等效果表达方式不同的凝血酶衍生物。
发现通过将除所述活性中心氨基酸以外的新氨基酸进行置换，可在不损害本发明凝血酶衍生物所具有的抗血栓效果的情况下，特异性地降低与所述凝血酶衍生物的与TM的结合能力。将除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换的本发明的凝血酶衍生物，即使将其给生物体投予，也不会抑制TM上的凝血酶对蛋白质C的活化。即，将除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换的本发明的凝血酶衍生物，并不抑制凝血酶本来所具有的抗血栓能力。
另外，发现如果将本发明的凝血酶衍生物的羧基，以专利文献2(国际公开第02/077031号手册)中所记载的方法来修饰羧基，则不仅只延长APTT而且取决于氨基酸的置换也可附加及控制抗血小板效果，尤其是PAR1活化及对因瑞斯托霉素引发血小板聚集的抑制效果。具体地，可获得控制药效平衡的凝血酶衍生物，其具有非常高的APTT延长效果以及较高的抗血小板效果，具有中度APTT延长效果及强抗血小板效果。即，通过将本发明的凝血酶衍生物的羧基进行羧基修饰，可获得具有可适应各种血栓症的抗血液凝固效果、抗血小板效果的凝血酶衍生物。
本发明者根据这些由发现所获得的知识完成本发明。
即，本发明如下所述。
1.<活性中心氨基酸的置换>
(1)一种凝血酶衍生物，其包括A链及B链，所述B链具有将从凝血酶B链的氨基酸序列中第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的一种或一种以上活性中心氨基酸进行置换的氨基酸序列，其特征在于1)当所述凝血酶衍生物与凝血酶基质在含有0.1M的NaCl的pH 7.4的50mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸中在37℃下反应3小时，被所述凝血酶衍生物分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下。；2)保持Exocite I的结构。
(2)一种凝血酶衍生物，其包括A链及B链，所述B链具有将从凝血酶B链的氨基酸序列第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择一种或一种以上活性中心氨基酸置换的氨基酸序列，其特征在于1)当所述凝血酶衍生物与凝血酶基质在含有0.1M的NaCl的pH 7.4的50mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸中在37℃下反应3小时，被所述凝血酶衍生物分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下。；2)保持与水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合能。
(3)根据第(2)项所述的凝血酶衍生物，其进而保持与肝素的结合能力。
(4)根据第(1)或(2)项所述的凝血酶衍生物，其中凝血酶基质是血液凝固第XIII因子。
(5)根据第(1)或(2)项所述的凝血酶衍生物，其中凝血酶基质是纤维蛋白原。
(6)根据第(1)至(5)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中，活性中心氨基酸的置换，是从凝血酶B链的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的两种或两种以上的氨基酸的置换。
(7)根据第(1)至(6)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中活性中心氨基酸的置换包括第205号丝氨酸的置换。
(8)根据第(1)至(7)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中活性中心氨基酸的置换包括第205号丝氨酸及第43号组氨酸的置换。
(9)根据第(8)项的凝血酶衍生物，其中将第43号组氨酸置换成丙氨酸或丝氨酸。
(10)根据第(6)至(9)项中任一项述的凝血酶衍生物，其中将第205号丝氨酸置换成丙氨酸、苏氨酸、或甘氨酸。
(11)根据第(6)至(9)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中将第205号丝氨酸置换成丙氨酸。
(12)根据第(8)项的凝血酶衍生物，其中将第205号丝氨酸及第43号组氨酸置换成丙氨酸。
(13)根据第(1)至(12)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中血液凝固第VIII因子结合能力是去水凝血酶的10％以上。
(14)根据第(1)至(12)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中血液凝固第VIII因子结合能力是去水凝血酶的80％以上。
(15)根据第(1)至(14)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIA)与纤维蛋白原结合能力(FA)至比即VIIIA/FA，是去水凝血酶的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIa)与纤维蛋白原结合能力(Fa)之比即VIIIa/Fa的1.1folds以上。
(16)根据第(1)至(14)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIA)与纤维蛋白原结合能力(FA)之比VIIIA/FA，是去水凝血酶的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIa)与纤维蛋白原结合能力(Fa)之比VIIIa/Fa的1.2folds以上。
(17)根据第(1)至(12)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的活化部分促凝血酶原激酶时间是去水凝血酶的1.1folds以上。
(18)根据第(1)至(12)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中通过活性中心氨基酸的氨基酸置换，纤维蛋白原结合能力降低10％以上，活化部分促凝血酶原激酶时间延长1.1folds以上。
(19)一种凝血酶衍生物，其包括A链及B链，所述B链含有将从凝血酶B链的氨基酸序列中第205号丝氨酸、以及第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸以及第43号组氨酸中选择一种或一种以上氨基酸置换的氨基酸序列。
(20)一种凝血酶衍生物，其包括A链及B链，所述B链含有将凝血酶B链的氨基酸序列中的第205号丝氨酸及第43号组氨酸进行置换的氨基酸序列。
2.<除活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换>
(21)根据第(1)至(20)相中任一项所述的凝血酶衍生物，其中上述B链具有将上述活性中心氨基酸以外的氨基酸进行进一步置换的氨基酸序列。
(22)根据第(21)项所述的凝血酶衍生物，其中除活性中心氨基酸以外的氨基酸是凝血酶的Exocite I区域的氨基酸。
(23)根据第(22)项所述的凝血酶衍生物，其中凝血酶的ExociteI区域的氨基酸是碱性氨基酸。
(24)根据第(22)项所述的凝血酶衍生物，其中凝血酶的ExociteI区域的氨基酸，是从凝血酶B链的第24号谷氨酰胺、第65号赖氨酸、及第77号赖氨酸中选择的一种或一种以上氨基酸。
(25)根据(21)至(24)中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIA)与纤维蛋白原结合能力(FA)之比VIIIA/FA，是除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIa)与纤维蛋白原结合能力(Fa)之比VIIIa/Fa的1.1folds以上。
(26)根据第(21)至(24)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIA)与纤维蛋白原结合能力(FA)之比即VIIIA/FA，是除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIa)与纤维蛋白原结合能力(Fa)之比即VIIIa/Fa的1.5folds以上。
(27)根据第(21)至(24)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其具有APTT延长效果、抑制凝血酶受体活化的效果、抑制瑞斯托霉素引发血小板聚集的效果，而且与将除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物相比，凝血酶衍生物具有降低的血栓调节蛋白结合能力。
(28)根据第(21)至(24)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其具有APTT延长效果、抑制凝血酶受体活化的效果、抑制瑞斯托霉素引发血小板聚集的效果中的任一种效果，而且与将除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物相比，凝血酶衍生物具有降低10％以上的血栓调节蛋白结合能力。
(29)根据第(21)至(24)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIA)与血栓调节蛋白结合能力(TMA)之比即VIIIA/TMA，是除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIa)与血栓调节蛋白结合能力(TMa)之比即VIIIa/TMa的1.1folds以上。
(30)根据第(21)至(24)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIA)与血栓调节蛋白结合能力(TMA)之比即VIIIA/TMA，是除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力(VIIIa)与血栓调节蛋白结合能力(TMa)之比即VIIIa/TMa的1.5folds以上。
(31)根据第(21)项所述的凝血酶衍生物，其中除活性中心氨基酸以外的氨基酸是凝血酶Exocite II区域的氨基酸，且当所述凝血酶的所述Exocite II区域的氨基酸的肝素结合能力下降，所述凝血酶的所述ExociteII区域的氨基酸保持抗血栓能力下降。
(32)根据第(31)项所述的凝血酶衍生物，其中凝血酶的ExociteII区域的氨基酸是从凝血酶B链的第98号精氨酸、第245号精氨酸、第248号赖氨酸、及第252号赖氨酸中选择的一种或一种以上氨基酸。
(33)根据第(31)或第(32)项所述的凝血酶衍生物，其中上述凝血酶衍生物的肝素结合能力是将除所述活性中心以外的氨基酸置换前的凝血酶的90％以下。
(34)根据第(21)至(33)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中从活化部分促凝血酶原激酶时间延长效果、抑制修饰凝血酶引起血小板聚集的效果、抑制瑞斯托霉素引起血小板聚集的效果中选择的一种或一种以上的抗血栓效果提高。
(35)根据第(21)至(33)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中上述凝血酶衍生物的活化部分促凝血酶原激酶时间是去水凝血酶的1.1folds以上。
(36)根据第(31)或(32)项所述的凝血酶衍生物，其中上述凝血酶衍生物的活化部分血栓时间是将除所述活性中心以外的氨基酸置换前的凝血酶的1.5folds以上，而且血栓调节蛋白结合能力降低至将除所述活性中心以外的氨基酸置换前的凝血酶的50％以下。
(37)根据第(1)至(36)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中凝血酶B链的氨基酸序列是人野生型凝血酶B链的氨基酸序列。
(38)根据第(37)项所述的凝血酶衍生物，其中人野生型凝血酶B链的氨基酸序列是序列号2的第50～308位的氨基酸序列。
3.<凝血酶修饰体>
(39)根据第(1)至(38)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其中将羧基进行修饰。
(40)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中以氨基酸的酯来修饰羧基。
(41)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中以聚乙二醇来修饰羧基。
(42)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中以具有氨基的聚乙二醇来修饰羧基。
(43)根据第(41)或(42)项所述的凝血酶衍生物，其中上述聚乙二醇是分子量1000以下的聚乙二醇。
(44)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中以碳酰二亚胺(carbodiimide)来修饰羧基。
(45)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中将每个分子中的至少3处以上的羧基进行修饰。
(46)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中将每个分子中的25处以下的羧基进行修饰。
(47)根据第(39)项所述的凝血酶衍生物，其中至少将B链第25号谷氨酰胺的羧基进行修饰。
(48)根据第(1)至(47)项中任一项所述的凝血酶衍生物，其具有抑制PAR1活化的效果及/或抑制由瑞斯托霉素(ristocetin)引起血小板聚集的效果。
4.<DNA、用途>
(49)一种DNA，其特征在于其编码根据第(1)至(38)项中任一项所述的凝血酶衍生物。
(50)一种医药组合物，其特征在于其含有根据第(1)至(48)项中任一项所述的凝血酶衍生物。
(51)根据第(50)项所述的医药组合物，其是抗血栓剂。
(52)根据第(50)项所述的医药组合物，其是抗炎症剂。
(53)根据第(50)项所述的医药组合物，其是血小板聚集抑制剂。
(54)根据第(50)项所述的医药组合物，其是血小板粘着抑制剂。
(55)根据第(50)项所述的医药组合物，其是内因类血液凝固抑制剂。
(56)根据第(50)项所述的医药组合物，其是凝血酶受体活化抑制剂。
(57)根据第(50)项所述的医药组合物，其兼具抗血液凝固作用及抗血小板作用。


图1是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰203A205G凝血酶(37μg/ml)的抗血小板效果图。009表示对照，010表示羧基修饰203A205G凝血酶。纵轴表示透过率(％)，横轴表示时间(分钟)(图2-12、15、21-22、25-35亦相同)。
图2是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶(羧基修饰凝血酶)引起血小板聚集之PRP，羧基修饰203A205G凝血酶(37μg/ml)的抗血小板效果图。002表示对照，001表示羧基修饰203A205G凝血酶。
图3是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，205A43A凝血酶(30μg/ml)的抗血小板效果图。079表示对照，080表示205A43A凝血酶。
图4是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引起血小板聚集的PRP，205A43A凝血酶(30μg/ml)的抗血小板效果图。083表示对照，084表示205A43A凝血酶。
图5是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰205A43A凝血酶(30μg/ml)的抗血小板效果的图。056表示对照，055表示羧基修饰205A43A凝血酶。
图6是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰205A43A凝血酶(15μg/ml)的抗血小板效果图。042表示对照，041表示羧基修饰205A43A凝血酶。
图7是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰205A43A凝血酶(7.5μg/ml)的抗血小板效果图。058表示对照，057表示羧基修饰205A43A凝血酶。
图8是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶来引起血小板聚集的PRP，羧基修饰205A43A凝血酶(30μg/ml)的抗血小板效果图。064表示对照，063表示羧基修饰205A43A凝血酶。
图9是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引起血小板聚集的PRP，羧基修饰205A43A凝血酶(15μg/ml)的抗血小板效果图。067表示对照，066表示羧基修饰205A43A凝血酶。
图10是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引发血小板聚集的PRP，羧基修饰205A43A凝血酶(7.5μg/ml)的抗血小板效果的图。070表示对照，069表示羧基修饰205A43A凝血酶。
图11是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，203A205G凝血酶(80μg/ml)的抗血小板效果图。104表示对照，095表示203A205G凝血酶。
图12是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶引起血小板聚集的PRP，203A205G凝血酶(80μg/ml)的抗血小板效果图。097表示对照，098表示203A205G凝血酶。
图13是表示203A205G凝血酶与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图14是表示AHT与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图15是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶引起血小板聚集的PRP，205A43A凝血酶(007326μM，0080.81μM)的抗血小板效果图。009表示对照。
图16是表示205A43A凝血酶衍生物与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图17是表示205A43S凝血酶衍生物与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图18是表示24E205A43A凝血酶与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图19是表示205A43A凝血酶及24E205A43A凝血酶的TM结合能力的图。D表示205A43A凝血酶，E表示24E205A43A凝血酶。
图20是表示203A凝血酶的凝血酶基质分解活性的电泳图(照片)。1表示分子量标记物，2、5表示空的泳道(lane)，3仅表示FXIII，4表示FXIII+203A凝血酶。并且，泳道6～10表示在FXIII中添加203A凝血酶后分别反应0、0.5、1、3、6小时的物质。
图21是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶引起血小板聚集，PRP的羧基修饰205A凝血酶(100μg/ml)的抗血小板效果图。016表示对照，015表示羧基修饰205A凝血酶。
图22是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰205A凝血酶(100μg/ml)的抗血小板效果图。003表示对照，004表示羧基修饰205A凝血酶。
图23是表示205A凝血酶衍生物与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图24是表示205A203A凝血酶衍生物与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图25是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰77E203A205G凝血酶(50μg/ml)的抗血小板效果图。001表示对照，002表示羧基修饰77E203A205G凝血酶。
图26是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶来引发血小板聚集的PRP，羧基修饰77E203A205G凝血酶(50μg/ml)的抗血小板效果图。014表示对照，013表示羧基修饰77E203A205G凝血酶。
图27是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶引起血小板聚集的PRP，77E205A43A凝血酶(100μg/ml)的抗血小板效果图。019表示对照，020表示77E205A43A凝血酶。
图28是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰77E205A43A凝血酶(30μg/ml)的抗血小板效果图。005表示对照，006表示羧基修饰77E205A43A凝血酶。
图29是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶引起血小板聚集的PRP，65A205A43A凝血酶(100μg/ml)的抗血小板效果图。020表示对照，019表示65A205A43A凝血酶。
图30是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引起血小板聚集的PRP，65A205A43A凝血酶(25或者50μg/ml)的抗血小板效果图。021表示25μg/ml，022表示50μg/ml。
图31是表示相对于以1μg/mlM-凝血酶引起血小板聚集的PRP，65A205A43A凝血酶(10μg/ml)的抗血小板效果图。023表示对照，024表示65A205A43A。
图32是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引起血小板聚集的PRP，羧基修饰65A205A43A凝血酶(36μg/ml)的抗血小板效果图。038表示对照，033表示羧基修饰65A205A43A凝血酶。
图33是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引起血小板聚集的PRP，羧基修饰65A205A43A凝血酶(9或18μg/ml)的抗血小板效果图。035表示18μg/ml，036表示9μg/ml。
图34是表示相对于以1μg/ml M-凝血酶引起血小板聚集的PRP，羧基修饰65A205A43A凝血酶(4.5μg/ml)的抗血小板效果图。
图35是表示相对于以5mg/ml瑞斯托霉素引起血小板聚集的PRP，羧基修饰65A205A43A凝血酶(36μg/ml)的抗血小板效果图。041表示对照，042表示羧基修饰77E205A43A凝血酶。
图36是表示65A205A43A凝血酶衍生物与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图37是表示65A205A43A凝血酶的TM结合能力的图。
图38是表示使用205A43A凝血酶的水蛭素C末端肽柱进行提纯过程的电泳图案的图(照片)。在非还原条件下进行SDS-PAGE，进行CBB染色。泳道1、2表示标准凝血酶，泳道3表示应用前的部分(fraction)；泳道4表示直接通过的部分；泳道5～10表示溶出部分。
图39是表示使用205A凝血酶的水蛭素C末端肽柱进行提纯过程的电泳图案的图(照片)。在非还原条件下进行SDS-PAGE，而进行CBB染色。泳道1～3表示标准凝血酶，泳道4表示应用前的部分，泳道5表示直接通过的部分，泳道6～11表示溶出部分。
图40是表示205A凝血酶的凝血酶基质分解活性的电泳图(照片)。泳道1表示标记物，泳道2、5表示样品，泳道3仅表示FXIII，泳道4表示FXIII+凝血酶，泳道6～10表示使用195A凝血酶分别反应0、1、3、6、24小时的FXIII。
图41是表示203A205G凝血酶的凝血酶基质分解活性的电泳图(照片)。泳道1表示标记物，泳道2仅表示FXIII，泳道3表示FXIII+凝血酶，泳道4～8表示使用203A205G凝血酶分别反应0、1、3、6、24小时的FXIII。
图42是表示各衍生物的凝血酶基质分解活性的电泳图(照片)。泳道1表示标记物，泳道3仅表示FXIII，泳道2、4表示FXIII+凝血酶，泳道5～7表示使用205G凝血酶III分别反应0、1、3小时的FXIII；泳道8、9表示使用205A43A凝血酶分别反应0、3小时的FXIII，泳道10、11表示使用203A205G凝血酶分别反应0、3小时的FXIII。
图43是表示各衍生物的凝血酶基质分解活性电泳的图(照片)。泳道1表示标记物，泳道2仅表示FXIII，泳道3表示FXIII+凝血酶，泳道4-8表示使用203A205A凝血酶分别反应0、1、3、6、24小时的FXIII；泳道9-13表示使用203A205A99N凝血酶分别反应0、1、3、6、24小时的FXIII。
图44是表示使用205V凝血酶的水蛭素C末端肽柱进行提纯过程的电泳图案的图(照片)。将SS键还原，并进行SDS-PAGE，使用抗人凝血酶多克隆(polyclonal)抗体以免疫印记法(western blot)确认泳带。泳道1表示标记物，泳道2、3表示标准凝血酶，泳道4表示应用前的部分，泳道5表示直接通过的部分，泳道6表示溶出部分。
图45是表示使用205D凝血酶的水蛭素C末端肽柱进行提纯过程的电泳图案的图(照片)。将SS键还原，并进行SDS-PAGE，使用抗人凝血酶多克隆抗体以免疫印记法确认电泳带。泳道1表示标记物，泳道2、3分别表示标准凝血酶，泳道4表示应用前的部分，泳道5表示直接通过的部分，泳道6表示溶出部分。
图46是表示相对于1μg/ml M-凝血酶的血小板聚集效果，抗PAR1抗体的效果图。002表示1μg/ml M-凝血酶，001表示1μg/ml M-凝血酶+抗PAR1抗体。
图47是表示19A205A43A凝血酶衍生物与Fbgn及FVIII的结合特异性的图。虚线表示1.0×10-7M的Fbgn，实线表示1.0×10-7M的FVIII。
图48是表示动脉血栓成长的模式图。
具体实施例方式
以下，详细地说明本发明。
1.<凝血酶>
本发明所使用的凝血酶衍生物是包括A链和B链而且将所述B链中特定的氨基酸进行置换的凝血酶衍生物。本发明所使用的凝血酶衍生物，如果在生物体内A链及B链通过S-S键成为交联的立体结构，则没有特别限制。由于A链及B链是将凝血酶前体蛋白质进行处理而生成，所以也可以是将本发明的凝血酶衍生物以前凝血酶(prethrombin)及凝血酶原等前体蛋白质的形式投予生物体，并在生物体内进行处理而获得上述立体结构。并且，以基因重组或化学合成等方法分别制造A链及B链，既可以将它们在体外(in vitro)形成S-S，也可以将它们分别投予，在生物体内上述A链及B链通过S-S键而成为交联立体结构。
此处，所谓A链，如果是野生型人凝血酶，则是指相当于序列号2的氨基酸号码1～49的区域，所谓B链，如果是野生型人凝血酶，则是指相当于序列号2的氨基酸号码50～308的区域。
人凝血酶中，A链N末端的13氨基酸残基通过自我分解而被切离。因此，A链也可以是从N末端切离的13个氨基酸残基(例如，序列号2的氨基酸号码1～13的残基)的序列。进而，在生物体内可以形成上述立体结构的凝血酶原或前凝血酶等的凝血酶前体蛋白质也包括在本发明的凝血酶衍生物中。另外，野生型人凝血酶原的氨基酸序列，作为入藏号码P00734公开在Swissprot的数据库中。
本发明中所获得的凝血酶衍生物，也可能以凝血酶原体而投与生体内。在这种情况下，在血栓部位具有抗血栓效果的凝血酶被活化，从而在血栓形成部位发挥出抗血栓效果，并在生物体内获得更加部位特异性的抗血栓效果。
2.<凝血酶基质分解活性>
血液凝固第XIII因子(FXIII)、纤维蛋白原(Fbgn)、S2238等合成基质(可从Sigma公司获得)、凝血酶受体、蛋白质C等凝血酶基质与本发明的凝血酶衍生物在含有0.1M NaCl、pH7.4的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸中在37℃下反应3小时时，被分解的凝血酶基质的比例为10％以下。一般认为，如果凝血酶基质分解活性在此范围内，则在投予生物体后至所述凝血酶衍生物被代谢前，所述凝血酶衍生物的凝血酶基质的活化没有问题。上述凝血酶基质中的FXIII对热比较稳定，进而可容易地以电泳进行确认，所以在本发明中可较好地使用。优选的是，凝血酶衍生物以相对于FXIII的摩尔比为1∶1或1∶1以上的浓度测定分解。
凝血酶中，通过确认基质FXIII中被电泳活化之泳带、纤维蛋白原中微量纤维蛋白块的有无，可确认基质分解能的有无。
另外，如果根据所述凝血酶基质分解活性的活性测定方法，则可以判断在非专利文献6(Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999)第173-186页)中报道的将完全失去活性的B链203号甘氨酸置换成丙氨酸的衍生物中，仍然残存凝血酶基质分解活性。
本发明中所获得的凝血酶衍生物，具有与专利文献3(日本专利特表平09-509045)、非专利文献7(J.Biol.Chem第275卷，第39827-39830页)、非专利文献8(J.Biol.Chem第279卷，第26387-26394页)、非专利文献9(J.Biol.Chem第277卷，第27581-27584页)中所公开的凝血酶衍生物不同的抗血栓作用机理。即，这些文献中所公开的凝血酶衍生物，其TM特异性得到保持或提高，优先地通过将蛋白质C活化来发挥抗血栓效果。相对于此，本发明的凝血酶衍生物不具有含有蛋白质C的凝血酶基质活化能。本发明的凝血酶衍生物，通过以不活化对于更特异性的血栓形成来说为重要的凝血酶基质的方式与所述凝血酶基质相结合、及抑制存在于血液中的凝血酶对这些凝血酶基质的活化，而发挥抗血栓效果。相反地，优选的是本发明的凝血酶衍生物不抑制生物体内的凝血酶的TM结合，优选的是TM结合能力下降。
3.<氨基酸的置换以及羧基的修饰>
本专利申请说明书的第1发明，是将从凝血酶B链的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、及第43号组氨酸中选择的一种以上氨基酸(活性中心氨基酸)进行置换的凝血酶衍生物；其是(1)在含有0.1M NaCl、pH7.4的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸中，与凝血酶基质在37℃下反应3小时时，被凝血酶衍生物分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下，(2)保持Exocite I结构的凝血酶衍生物。所述第1发明，通过形成所述构成，而表现以延长去水凝血酶(AHT)同等或以上的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)延长作为主要效果的抗血栓症效果。而且，其APTT延长效果不受培养的影响，可确实地延长APTT。
本专利申请说明书的第2发明，进而是将除活性中心氨基酸以外的氨基酸进行置换的凝血酶衍生物。所述凝血酶衍生物，是通过降低与血中大量存在的Fbgn的结合能力来提高抗血栓能力的衍生物。通过降低Fbgn的结合能力，可高效地与促进成为目标的血液凝固的凝血酶基质相结合，并可抑制其活化。
作为促进血液凝固的凝血酶基质，可举出FV、FVIII、FXI、凝血酶受体(PAR1)以及PAR4等。进而，为了更高效地提高抗血栓能力，更优选的是更特异性地抑制凝血酶受体或者FVIII。
即，更佳的本发明的凝血酶衍生物与Fbgn的结合能力和与凝血酶受体或者FVIII的结合能力相比相当低，可通过更少的投予量获得良好的抗血栓效果。另外，所述活性中心氨基酸以外进一步的氨基酸的置换，不使第1发明的凝血酶衍生物所具有的血栓效果丧失，而且与TM的结合能力特异性地降低。
另外，如果根据第2发明，则可获得虽然具有较高的APTT延长效果但是抗血小板效果较低的类型的凝血酶衍生物，以及较高的APTT延长效果与较高的抗血小效果(这里，仅仅指PAR1抑制效果)的类型的凝血酶衍生物等效果的表达实施例不同的凝血酶衍生物。
除如所述活性中心氨基酸以外的氨基酸，可举出B链的第24号谷氨酰胺、第65号赖氨酸及第77号赖氨酸等Exocite I区域的氨基酸、B链的第98号精氨酸、第245号精氨酸、第248号赖氨酸、及第252号赖氨酸等Exocite II区域的氨基酸、B链第197号精氨酸及B链第19号苯基丙氨酸等属于两Exocite的区域等。
本申请案的第3发明，是将第1发明或第2发明的凝血酶衍生物的羧基，按照专利文献2(国际公开第02/077031号手册)中记载的方法进行羧基修饰所形成的凝血酶衍生物。所述凝血酶衍生物，不仅只延长APTT，而且可附加、控制依赖于氨基酸置换的抗血小板效果、尤其是PAR1活化以及瑞斯托霉素引起血小板聚集抑制效果。具体地说，可获得具有非常强的APTT延长效果及较强的抗血小板效果的凝血酶衍生物、具有中等程度的APTT延长效果及较强的抗血小板效果的衍生物等。即，根据第3发明，可能获得可适应各种血栓症的具有抗血液凝固效果、抗血小板效果的凝血酶衍生物。
以下，为了易于理解氨基酸置换的影响及意义，而将活性中心氨基酸的置换(第1发明)、除活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换(第2发明)、羧基的修饰(第3发明)分开说明。
另外，本发明的凝血酶衍生物，如果是在不损害本发明效果的范围内，可以是在B链(序列号2的氨基酸号码50～308)中，除上述特定氨基酸以外，具有将一个或多个氨基酸进行置换、缺失、插入、添加的氨基酸序列的凝血酶衍生物。另外，此处，所谓多个是指2～20个，优选2～10个，更优选2～5个。并且，本发明的凝血酶衍生物，也可以是在A链(序列号2的氨基酸号码1～49)中具有将一个或多个氨基酸进行置换、缺失、插入、添加的氨基酸序列的凝血酶衍生物。这里，多个是指2～10个，优选2～5个，更优选2～3个。
并且，本发明的凝血酶衍生物，是在含有0.1M NaCl、pH7.4的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸中，与凝血酶基质在37℃下反应3小时时被分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下，只要保持Exocite I的结构，则也可以是对A链为序列号2的氨基酸号码1～49的序列、B链为序列号2的氨基酸号码50～308，在分别具有一定以上相同性的范围内，在除上述氨基酸以外的位置上，进一步进行置换、缺失、插入、加成等改变。这里，所谓一定以上的相同性，是指80％以上，优选90％以上，特别优选95％以上的相同性。
本发明的凝血酶衍生物，是通过制作以部位特异性变异导入法来编码各衍生物的DNA，将所述DNA重组入载体并在哺乳动物细胞等中表达而获得。象这样的DNA，可以编码上述A链及B链的两者，也可以是分别表达各链。部位特异性变异导入法并没有特别限定的，也可以是使用例如市售的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制造)等进行。并且，通过化学合成也可获得凝血酶衍生物。
3-1.<活性中心氨基酸的置换；以下也称第1发明>
本发明的凝血酶衍生物，是将从凝血酶B链第205号丝氨酸(B链205相当于序列号2的第254号丝氨酸的丝氨酸)、第203号甘氨酸(B链203相当于序列号2的第252号甘氨酸的甘氨酸)、43号组氨酸(B链43相当于序列号2的第92号组氨酸的组氨酸)、99号天冬氨酸(B链99相当于序列号2的第148号天冬氨酸的天冬氨酸)中选择的一种以上氨基酸(活性中心氨基酸)进行置换的凝血酶衍生物。
另外，本说明书中，B链205及B链203等，表示从B链第1号氨基酸(例如，序列号2的氨基酸号码50的异亮氨酸)开始计数的氨基酸号码。另外，如上述之置换氨基酸的位置，由于氨基酸的缺失、插入、添加等，所以位置有时前后偏移。例如，如果在N末端部插入一个氨基酸残基，则原来第205号丝氨酸残基成为第206号，但如此的相当于第205号丝氨酸残基的丝氨酸残基，也称为本发明中第205号丝氨酸残基。
为了使本发明的凝血酶衍生物表现本发明的效果，即使在活性中心氨基酸的置换后，也有必要维持置换前的凝血酶的Exocite I结构。
现有报道，凝血酶的Exocite I是对于与具有许多的血栓形成作用、炎症作用的凝血酶基质的结合起最重要作用的必需区域(Journal ofBiological Chemistry 1989，第264卷，第8692-8698页)。已知，水蛭素C末端肽特异性地与所述Exocite I结合(Journal of BiologicalChemistry 1991 Vol 266 23633-23636)。特别是报道有，通过血小板活化而具有对血栓形成起重要作用的凝血酶受体，牢固地结合在水蛭素C末端区域具有较高相同性的Exocite I上。因此，一般认为，对于蛭素C末端肽的结合能力的丧失，是失去与将以Exocite I结构破坏的凝血酶受体为代表的许多凝血酶基质的结合能力。因此，作为本发明中作为是否维持Exocite I结构的第一阶段的筛选，是通过是否维持对水蛭素C末端肽(例如，序列号3)的结合能力来判断。
是否维持与水蛭素C末端肽的结合能力，如后述实施例所示，可通过测定水蛭素C末端肽固定化凝胶对凝血酶衍生物的结合比例而进行。
本发明的凝血酶衍生物，优选的是保持对于水蛭素C末端肽的结合能力的衍生物，例如，在与水蛭素C末端肽固定化凝胶反应时，优选的是，添加入反应系统的本发明的凝血酶衍生物总量的10％以上、优选50％以上与水蛭素C末端肽固定化凝胶相结合。
另外，凝血酶衍生物的水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合比例的测定，完全是为了确认在活性中心氨基酸置换前后是否维持Exocite I的结构而进行。因此，在第2发明中，进而在进行除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换时，有时即使维持Exocite I结构，通过其进一步的氨基酸置换，而保持FVIII结合能力，而且与水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合能力丧失或者显着降低。
另外，本发明的凝血酶衍生物，优选的是通过活性中心氨基酸的置换，而丧失肝素结合能力的衍生物。相对于活性中心氨基酸置换前的凝血酶的肝素结合能力，更优选的是保持80％以上的肝素结合能力。在凝血酶的立体结构中，活性中心存在于偏离肝素结合部位(Exocite II)的区域。即，通过活性中心氨基酸置换而丧失肝素结合能力，是指其活性中心氨基酸的置换引起凝血酶分子整体的结构异常，并由此存在于偏离活性中心的位置的肝素结合区域的结构被破坏。分子整体的结构异常，是指对凝血酶基质结合能力的降低。
本发明中，活性中心氨基酸的置换，优选的是从凝血酶B链的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、及第43号组氨酸中选择的2种以上氨基酸的置换，更优选的是至少将第205号丝氨酸置换，特别优选的是至少将第205号丝氨酸及第43号组氨酸置换。
B链第203号甘氨酸，优选的是将换成丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸中的任何一个。第99号天冬氨酸，优选的是置换成天冬酰胺。第43号组氨酸，优选的是置换成丙氨酸或丝氨酸或天冬酰胺。
B链第205号丝氨酸，优选的是置换成丙氨酸、苏氨酸、或甘氨酸，其中特别优选的是置换成丙氨酸。在此情况下，Exocite I的结构难以受损害。
活性中心氨基酸的置换，在将第205号丝氨酸及第43号组氨酸进行置换情况下，优选的是将第205号丝氨酸置换成丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸，将第43号组氨酸置换成丙氨酸或丝氨酸的衍生物，尤其优选的是将第205号丝氨酸及第43号组氨酸中的任何一个置换成丙氨酸的衍生物。
以下，关于第1发明中的活性中心氨基酸的置换，现列举具体例加以说明。
活性中心氨基酸的置换，在将从凝血酶B链的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸及第43号组氨酸中选择的两种以上氨基酸进行置换的情况下，被置换的两种以上氨基酸(置换部位)的组合，进而根据成为置换对象的氨基酸种类，有时在凝血酶基质结合能力或抗血栓效果方面有所不同。作为一例，列举下述凝血酶衍生物1～7进行说明。


凝血酶衍生物1置换部位是B链第205号丝氨酸及第99号天冬氨酸，将丝氨酸置换成丙氨酸，将天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶衍生物(序列号22的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物2置换部位是B链第205号丝氨酸及第43号组氨酸，将丝氨酸置换成丙氨酸，将组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号26的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物3置换部位是B链第205号丝氨酸及第203号甘氨酸，将丝氨酸置换成甘氨酸，是将甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号8的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物4置换部位是B链第205号丝氨酸及第203号甘氨酸，是将丝氨酸及甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号24的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物5置换部位是B链第205号丝氨酸及第203号甘氨酸、及第99号天冬氨酸，是将丝氨酸及甘氨酸置换成丙氨酸，将天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶衍生物(序列号14的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物6置换部位是B链第205号丝氨酸、第43号组氨酸，将丝氨酸置换成甘氨酸，是将组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号34的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物7置换部位是B链第205号丝氨酸、第43号组氨酸，是将丝氨酸置换成丙氨酸，将组氨酸置换成丝氨酸的凝血酶衍生物(序列号36的氨基酸号码44～351的序列)。
凝血酶衍生物1-7中的任何一个均保持与水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合能力，但凝血酶衍生物4及5，与人野生型凝血酶相比，与肝素凝胶的结合能力降低。
凝血酶衍生物1～7中的任何一个均具有以APTT延长为主的抗血栓效果，其效果的顺序如下所示。
凝血酶衍生物2≥凝血酶衍生物6、7＞凝血酶衍生物1、3＞＞凝血酶衍生物4、5凝血酶衍生物2、6、7，与下述羧基修饰的有无无关，可以看到非常高的抗血栓效果。并且，凝血酶衍生物2中所看到的抗血栓效果，对于凝血连锁反应起特异性作用，特别是充分延长APTT。进而，将凝血酶衍生物2的羧基进行修饰的凝血酶衍生物，具有赋予或增强抗血小板能、抑制凝血连锁反应、抑制血小板聚集、以及抑制血小板粘着的作用。
在凝血酶衍生物2以及4中，将第205号丝氨酸置换成丙氨酸，但如上所述在其抗血栓效果中可以看到较大的不同。在凝血酶衍生物3以及4中，都是将第203号甘氨酸置换成丙氨酸，但在其抗血栓效果中，可以看到如上述的不同。
凝血酶衍生物1、3并不直接显示出那样强的抗血栓效果，但是通过以如下述方式来修饰其羧基，而改变基质特异性，或者通过置换除活性中心氨基酸以外的氨基酸(例如B链77号赖氨酸)，使与Fbgn的结合能力特异性地降低，相对地提高对FVIII的特异性，从而可显示出较强的APTT延长效果、血小板聚集抑制效果中的一个或两个效果。具体地，在羧基修饰的情况下，获得APTT延长及抗血小板效果(聚集以及粘着)，在将B链第77号氨基酸置换的情况下，获得仅具有APTT延长效果的凝血酶衍生物。
另一方面，凝血酶衍生物4、5中，即使是在进行羧基修饰的情况下，以及置换B链第77号氨基酸的情况下，抗血栓效果较弱。凝血酶衍生物6、7显示出接近凝血酶衍生物2的抗血栓效果。
本发明，不管众所周知的技术，将凝血酶B链第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、及第43号组氨酸中的任何一个进行置换而获得的凝血酶衍生物，是按以下方式进行分类。
A.如通过置换第205号丝氨酸及第43号组氨酸所获得的凝血酶衍生物，是即使不进行羧基修饰及/或用于降低与Fbgn的结合能力的活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换，也具有以较强的APTT延长效果为主的抗血栓效果的凝血酶衍生物。
B.如通过置换从第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸中选择的一种、及将第205号丝氨酸置换而获得的凝血酶衍生物，是直接显示出如此程度的强抗血栓效果，但通过羧基修饰及/或用于降低与Fbgn的结合能力的除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换，而显示出较高的抗血栓效果的凝血酶衍生物。
C.是凝血酶基质分解活性虽然丧失，但通过羧基修饰及/或使Fbgn结合能力降低的氨基酸的置换，而不显示出高抗血栓效果的凝血酶衍生物。
D.虽然显示抗血栓效果，但因为具有残存活性，所以不可以作为抗血栓剂来使用的凝血酶衍生物。
已知，关于组(group)A，在确认对Fbgn、FVIII的结合能力时，任何一个均提高FVIII结合能力。因此，一般认为，较高的APTT延长效果，其原因在于通过将活性中心氨基酸的置换组合，使凝血酶基质分解活性丧失，同时使FVIII结合能力相对性地特异性地上升(Fbgn相对性地降低)。这些凝血酶衍生物，在没有进行羧基修饰下，通过降低其Fbgn结合能力，也可以确认有较弱的抗血小板效果。并且，其效果是抑制PAR1活化的效果，不伴有瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果。
由于活性中心氨基酸置换所导致的FVIII结合能力的相对性特异性上升的程度，是根据如上述的具体的置换组合而确定。基本上，通过保持对于促进血液凝固反应的凝血酶基质的结合能力，同时使Fbgn结合能力降低，而提高本发明的凝血酶衍生物的抗血栓能力。进而，如果所获得凝血酶衍生物的FVIII结合能力(VIIIA)与Fbgn结合能力(FA)之比即VIIIA/FA，是AHT的FVIII结合能力(VIIIa)与AHT的Fbgn结合能力(Fa)之比即VIIIa/Fa的1.1folds以上，则可以获得较高的抗血栓效果；如果VIIIA/FA是VIIIa/Fa的1.2folds以上，则可获得非常高的抗血栓效果。
将上述活性中心氨基酸置换的凝血酶衍生物，优选的是FVIII结合能力对于去水凝血酶保持在10％以上的衍生物，更优选的是保持在80％以上的衍生物。
将上述活性中心氨基酸置换的凝血酶衍生物，优选的是活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)为去水凝血酶(AHT)1.1folds以上的衍生物。
并且，在活性中心氨基酸的置换组合中，除了Fbgn结合能力、FVIII结合能力等相对性、特异性变化以外，对FVIII的结合能力也会产生差异。上述凝血酶衍生物2、6、7，表示与AHT具有相等的较高FVIII结合能力。另一方面，其他凝血酶衍生物的FVIII结合能力也降低。即，组A，通过具有对于FVIII的较高的结合能力，并且对于Fbgn的FVIII结合能力的比提高的双重效果，而具有较高的抗血栓效果。
本发明的凝血酶衍生物，更优选的是，通过活性中心氨基酸的氨基酸置换，使Fbgn结合能力降低10％以上，并由此使APTT延长效果增加1.1folds以上的衍生物。
凝血酶的活性中心部位、水蛭素C末端肽、肝素结合部位即ExociteI、以及Exocite II，在立体结构上有一定距离。一般认为，如果考虑到如此凝血酶的立体结构，则通过所例示的活性中心氨基酸的置换组合而降低肝素结合能力的凝血酶衍生物、以及通过活性中心氨基酸的置换而使水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合能力降低的凝血酶衍生物，通过活性中心氨基酸的无法(在结构上带来负荷)置换，而产生分子整体的折叠(folding)异常、结构异常，从而进一步亦引起Exocite I结构及Exocite II结构发生异常。因此，可推测产生凝血酶基质结合能力的降低，产生抗血栓效果的降低。
3-2.<除活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换；以下，称为第2发明>
以下对目的是进一步提高第1发明的抗血栓效果，而将除活性中心氨基酸以外的氨基酸、尤其是将Exocite I及/或Exocite II区域上的氨基酸进行进一步置换的凝血酶衍生物加以说明。虽然通过所述活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换有时可降低与水蛭素C末端肽固定化凝胶以及肝素的结合能力，但是这是由于这些的区域氨基酸的直接的置换的结果是和由于活性中心的氨基酸的置换而引起的基于蛋白整体的结构异常的结合能力的降低不同。
本申请案第2发明的凝血酶衍生物，是提高使与血中大量存在的Fbgn间的结合能力降低，而进一步提高抗血栓能力的衍生物。
通过降低与Fbgn的结合能力，可以与促进成为目标的血液凝固的凝血酶基质高效地结合，并可以抑制其活化。
促进血液凝固的凝血酶基质，可举出FV、FVIII、FXI、凝血酶受体(PAR1)以及PAR4等。进而，为了更高效地提高抗血栓能力，更优选的是更特异性地抑制凝血酶受体或者FVIII。
即，本发明的凝血酶衍生物与Fbgn的结合性与凝血酶受体或者FVIII的结合能力相比相对较低，可通过更少的投予量获得良好的抗血栓效果。进而，如果是第2发明，不仅不明显损害第1发明的凝血酶衍生物所具有的抗血栓效果，而且可以特异性地降低TM的结合能力。如此，在本发明中，通过选择性降低TM结合能力，本发明的凝血酶衍生物即使投予生物体内，也不会与TM结合并且抑制凝血酶的蛋白质C活化。
由于TM不是基质，所以与凝血酶的活性中心没有相互作用，因此，根据第1发明难以特异性地降低TM结合能力。并且，通过在根据第1发明而被提高的抗血栓能力上，进一步加上第2发明，可以进一步附加上提高抗血栓效果、具有基质特异性等特征。
第2发明的凝血酶衍生物，优选的是与Fbgn的结合能力降低的衍生物。更优选的是与凝血酶受体或者FVIII的结合能力相比相对较低的衍生物。具体地说，优选的是FVIII结合能力(VIIIA)与Fbgn结合能力(FA)之比VIIIA/FA，是除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换前的凝血酶衍生物的FVIII结合能力(VIIIa)与Fbgn结合能力(Fa)之比VIIIa/Fa的1.1folds以上，更优选的是1.5folds以上。
另外，第2发明的凝血酶衍生物，优选的是特异性地降低与TM的结合能力的衍生物。具体地说，优选的是FVIII结合能力(VIIIA)与TM结合能力(TMA)之比VIIIA/TMA是除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换前的凝血酶衍生物的FVIII结合能力(VIIIa)与TM结合能力(TMa)之比VIIIa/TMa的1.1folds以上，更优选的是1.5folds以上。
另外，根据第2发明，可以获得虽具有较高的APTT延长效果但抗血小板效果较低类型的凝血酶衍生物、以及具有高APTT延长效果以及高抗血小效果(其中，仅指抑制PAR1效果)的类型的凝血酶衍生物等效果的表现方式不同的凝血酶衍生物。
除活性中心以外的氨基酸的置换，如果是获得上述效果的置换，则并没有特别限制，具体地说，可举出Exocite I以及Exocite II区域上的氨基酸置换以及其他凝血酶衍生物中的纤维蛋白原、与TM的相互作用区域。
所谓凝血酶的Exocite I区域，已知是与水蛭素的C末端区域有特异性相互作用的富碱性的氨基酸区域，已知是与Fbgn、凝血酶受体、TM等有相互作用的重要区域(E.Di Cera Thrombin Interactions Chest，2003；124(90030)第11-17页)。本发明中，优选的是将从其中的碱性氨基酸中选择一种以上进行置换，更优选的是将从凝血酶B链的第24号谷氨酰胺(B链24；序列号2的第73号谷氨酰胺)、第65号赖氨酸及第77号赖氨酸(B链77；与序列号2的第126号赖氨酸相当的赖氨酸)中选择一种以上进行置换。置换第77号赖氨酸、第24号谷氨酰胺、第65号赖氨酸的氨基酸，并没有特别限制，但是优选的是丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺(glutamic acid)或者谷氨酰胺(glutamine)。
所谓Exocite II区域，已知主要是作为与肝素有相互作用的富碱性的氨基酸区域。(E.Di Cera Thrombin Interactions Chest，2003；124(90030)第11-17页)。本发明中，优选的是将从其中的碱性氨基酸中选择一种以上进行置换，更优选的是将从凝血酶B链的第98号精氨酸(相当于序列号2的第147号精氨酸的精氨酸)、第245号精氨酸(相当于序列号2的第294号精氨酸的精氨酸)，第248号赖氨酸(相当于序列号2的第297号赖氨酸的赖氨酸)，以及第252号赖氨酸(相当于序列号2的第301号赖氨酸的赖氨酸)中选择一种以上进行置换。置换第98号精氨酸、第245号精氨酸、第248号赖氨酸、第252号赖氨酸的氨基酸，可举出丙氨酸等，只要是可获得目的衍生物，则没有特别限制。
关于肝素结合能力的下降，推测其肝素结合力的下降是由于在肝素结合区域(Exocite II等)以外的区域，例如活性中心氨基酸的置换而引起的情况下，通过其置换，对凝血酶衍生物整体的分子结构、进一步说ExociteII的立体结构变形等产生不良影响，从而肝素结合能力降低。
另一方面，在实际投予生物体内的情况下，除了以如本发明中所公开的最佳组合置换活性中心氨基酸外，也可根据目的通过将作为活性中心氨基酸以外的氨基酸，积极地位于Exocite II的氨基酸，例如B链第98号精氨酸、B链第245号精氨酸、B链第248号赖氨酸置换成丙氨酸等其他氨基酸，由此获得可降低肝素结合能力的凝血酶衍生物。可期望通过使用降低肝素结合能力的衍生物，而降低与血管内皮细胞上的硫酸肝素等的结合能力或者增加血中循环量。
如此的除了在活性中心氨基酸上，还在Exocite II区域导入氨基酸置换的凝血酶衍生物，优选的是与肝素凝胶的结合能力为将Exocite II区域氨基酸置换前的凝血酶的90％以下。
如此的凝血酶衍生物，可举出将第205号丝氨酸、第43号组氨酸以及第65号赖氨酸置换成丙氨酸，进而将第245号精氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号54的氨基酸号码44～351的序列)；将第205号丝氨酸、第43号组氨酸以及第65号赖氨酸置换成丙氨酸，进而将第248号赖氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号56的氨基酸号码44～351的序列)等。这些衍生物具有APTT延长效果，而且通过Exocite II上的氨基酸置换而使得肝素亲和性与人野生型凝血酶相比下降。
并且，在WO2002/004008，WO2002/007748中公开了，凝血酶通过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸(凝血酶B链的197至200位相当于序列号2的246～249的区域)的区域，注入针对对PAR的水解非依赖性的各种细胞的增殖性信号，以及精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸的全部是所述信号路径所必需。本发明中所获得的衍生物中，由于细胞增殖信号是不必要的，所以可以置换作为其他氨基酸的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸序列中的任何一个氨基酸。例如，将实验例25记载的B链197精氨酸(相当于序列号2的第246号精氨酸的精氨酸)、205丝氨酸及43组氨酸分别置换成丙氨酸的衍生物(序列号48的氨基酸号码44～351的序列)，与将第205号丝氨酸及第43号组氨酸分别置换成丙氨酸的衍生物相比，具有较高的APTT延长能力。可预测，所述衍生物缺失的原因是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸序列的细胞信号能缺失。
并且，也可以置换B链第19号苯基丙氨酸(相当于序列号2的第68号苯基丙氨酸的苯基丙氨酸)。如此的凝血酶衍生物，可举出将第205号丝氨酸、第43号组氨酸及第19号苯基丙氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物(序列号58的氨基酸号码44～351的序列)。
本专利说明书的第2发明的凝血酶衍生物，更优选的是通过除活性中心以外的氨基酸置换，将活化部分促凝血酶原激酶时间延长1.5folds以上且血栓调节蛋白结合能力降低至50％以下的凝血酶衍生物。
本发明说明书第2发明的凝血酶衍生物，更优选的是APTT延长效果、修饰凝血酶引起血小板聚集抑制效果、瑞斯托霉素引起血小板聚集抑制效果中的至少一种以上抗血栓效果提高的衍生物。
以下，列举具体例对第2发明中除活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换加以说明。
具体例1是在具体说明第1发明时所例示的凝血酶衍生物3(将第203号甘氨酸置换成丙氨酸、将第205号丝氨酸置换成甘氨酸的凝血酶衍生物)的APTT延长效果并不高的衍生物。相对于此，除了凝血酶衍生物3中所进行的活性中心氨基酸的置换外，还将第77号赖氨酸置换成谷氨酰胺的凝血酶衍生物(序列号28的氨基酸号码44～351的序列)，Fbgn结合能力降低，进而FVIII结合能力相对于Fbgn结合能力相对性提高，并且显示出高的APTT延长效果。
具体例2具体说明第1发明时所例示的凝血酶衍生物2(将第205号丝氨酸置换成丙氨酸、将第43号组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物)，显示出高的APTT延长效果。除了在凝血酶衍生物2中所进行的活性中心氨基酸的置换外，还将第77号赖氨酸置换成谷氨酰胺、丙氨酸或丝氨酸的凝血酶衍生物(序列号38、44或50的氨基酸号码44～351的序列)，显示有更强的APTT延长抑制效果。即，可以认为，通过活性中心氨基酸置换引起的与凝血酶基质结合特异性的变化，与进一步进行除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换所引起的与凝血酶基质的结合特异性变化具有相乘效果，因而影响药效的强度。
具体例3除了在凝血酶衍生物2中所进行的活性中心氨基酸置换外，将第24号谷氨酰胺置换成谷氨酰胺的凝血酶衍生物(序列号40的氨基酸号码44～351的序列)，具有APTT延长效果且其TM结合能力显着下降。
具体例4除了在凝血酶衍生物2中所进行的活性中心氨基酸的置换外，将第65号赖氨酸置换成丙氨酸的衍生物(序列号46的氨基酸号码44～351的序列)，可以看到APTT延长效果增强、进而TM结合能力下降的二重效果。通过将Exocite I上的第65号赖氨酸置换成丙氨酸，发现与水蛭素凝胶的结合能力有所下降，但是FVIII结合能力被保持且对Fbgn的FVIII特异性上升。
具体例5除了在凝血酶衍生物2中所进行的活性中心氨基酸的置换外，还将第65号赖氨酸及第77号赖氨酸置换成丙氨酸的衍生物(序列号52的氨基酸号码44-351的序列)中，可以看到由于两处氨基酸置换而导致的相乘效果是非常较高的APTT延长效果。
具体例6除在凝血酶衍生物2中所进行的活性中心氨基酸的置换外，还将第65号赖氨酸及第245号精氨酸置换成丙氨酸的衍生物(序列号54的氨基酸号码44～351的序列)中，可以看到具有抗血栓能力同时看到肝素结合能力下降。
除了如此的活性中心氨基酸的置换外，通过置换除这些以外的氨基酸，尤其是置换Exocite I区域及Exocite II区域的氨基酸，而获得具有各种特征的凝血酶衍生物。
3-3.羧基的修饰<第3发明>
若将本发明说明书第1及第2发明的凝血酶衍生物的羧基，按照专利文献2(国际公开第02/077031号手册)中所记载的方法进行羧基修饰，则对Fbgn的结合能力下降且对凝血酶受体等凝血酶基质的选择性增加，因此可以用更少量达到抗血栓效果。
并且，不仅只延长APTT，而且也可以附加、控制依赖于氨基酸置换的抗血小板效果，特别是PAR1活化及瑞斯托霉素引起血小板聚集抑制效果(由GPIb与v WF的相互作用所导致)。具体地说，可以获得具有非常强的APTT延长效果及强的抗血小板效果的凝血酶衍生物、具有中等程度APTT延长效果及强的抗血小板效果的衍生物等。即，通过将本发明的凝血酶衍生物的羧基进行羧基修饰，可获得具有可适应各种血栓症的抗血液凝固效果及抗血小板效果的凝血酶衍生物。
按照专利文献2(国际公开第02/077031号手册)中公开的方法对本发明的凝血酶衍生物的羧基进行羧基修饰的时候，优选的是使用碳酰二亚胺进行羧基修饰。
本发明的凝血酶衍生物的羧基，可通过具有氨基的化合物进行修饰。具有氨基的化合物并没有特别限制，但是优选的是氨基酸的酯、在侧链上具有氨基的聚乙二醇等。氨基酸的酯，可举出甘氨酸乙酯等。使用具有氨基的化合物进行修饰，也可以根据国际公开02/077031号手册中所公开的方法来进行。另一方面，通过将本发明的凝血酶衍生物与聚乙二醇进行反应，也可进行其羧基修饰。另外，在使用聚乙二醇或者具有氨基的聚乙二醇的情况下，聚乙二醇部分的分子量，优选1000以下。
另外，在进行羧基修饰的情况下，其效果受到由其修饰个数的影响。为了获得下述修饰体1至5中所记载的效果，优选的是将3处以上的羧基进行修饰。如果被修饰的羧基个数为3以上，则可明确获得由于羧基修饰所附加的效果。并且，所修饰的羧基，优选的是25处以下。如果被修饰的羧基个数为25以下，则同样可明确地获得由于羧基修饰所附加的效果，同时由于修饰导致难以引起回收率下降。其中，通过凝血酶衍生物表面的氨基酸置换而导入、削除了羧基所获得的凝血酶衍生物，不包括由于其置换而导致的羧基增加及减少。
进而，可以获得根据其修饰个数而具有多种效果的衍生物。例如通过将下述修饰体1的修饰部位减少至8或者5个部位，而获得具有非常高的APTT延长效果以及中到低度的抗血小板效果的衍生物。
本发明中，在修饰羧基的情况下，优选的是将至少B链第25号谷氨酰胺的羧基进行修饰。本发明的将羧基进行修饰的凝血酶衍生物，优选的是血小板的瑞斯托霉素聚集抑制能力上升的凝血酶衍生物及/或具有对血小板的GPIbα有拮抗能力的凝血酶衍生物。
为了提高抗血栓效果，在进行除活性中心氨基酸以外的氨基酸置换的情况下所获得的效果，以及在进行羧基修饰的情况下所获得的效果，根据置换氨基酸的组合等而有较大不同。根据疾病以及病态等，并且根据目的，可以使用仅导入氨基酸置换的凝血酶衍生物、以及将羧基修饰组合在其中的凝血酶衍生物。
即，因为在深部静脉血栓症等静脉中的血栓症中，一般使用抑制血液凝固的药物，所以优选的是使用从各凝血酶衍生物以及其羧基修饰体的中选择具有高APTT延长效果的凝血酶衍生物。
另一方面，因为在心肌梗塞、不稳定心绞痛等动脉血栓症中一般使用抑制血小板聚集的药，所以优选的是具有高血小板聚集抑制效果的凝血酶衍生物。从其中选出的APTT延长效果不同的凝血酶衍生物，应所述根据出血等副作用的状况等进行选择。
并且，报道有伴随着粥状硬化部位中的斑(plaque)的破裂，血栓症中对血小板以及对凝固系统的抑制也是重要的(血栓症，南江堂)，同时抑制血小板、凝固系统双方是有效的。如此的作用于凝固系统、血小板两者的药剂，现在还没有在市场上销售，而本发明可提供全新的治疗剂。
以下，就活性中心氨基酸的置换以及除活性中心氨基酸以外的氨基酸的置换，与羧基修饰的关系，列举具体例加以说明。以下的具体例，是将水溶性碳酰二亚胺用作缩合剂，并且用甘氨酸乙酯进行修饰，而将约15个羧基进行修饰的衍生物。
修饰体1将第205号丝氨酸置换成丙氨酸，且将第43号组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物，不进行羧基修饰，并且具有非常高的APTT延长效果。在所述凝血酶衍生物进行羧基修饰的凝血酶衍生物，不仅由于羧基修饰所产生的APTT延长效果具有一定程度的放大，而且显示出对血小板的瑞斯托霉素引起血小板聚集抑制效果、M-凝血酶引起血小板聚集抑制效果较高，抗血液凝固、抗血小板能力中同时显示除非常高的效果。
修饰体2将第205号丝氨酸置换成甘氨酸、将第203号甘氨酸置换成丙氨酸的衍生物，在羧基修饰前，起APTT延长效果、抗血小板效果不高，但是通过进行羧基修饰，而形成APTT延长效果、抗血栓效果提高的同时具有中等程度APTT抑制效果以及高抗血小板效果的凝血酶衍生物。
修饰体3将第205号丝氨酸置换成丙氨酸、将第203号甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶衍生物，其APTT延长效果并不高。即使将所述凝血酶衍生物的羧基进行修饰，APTT延长效果的增幅也不显着。
修饰体4将第205号丝氨酸置换成甘氨酸、将第203号甘氨酸置换成丙氨酸、将第77号赖氨酸置换成谷氨酰胺的凝血酶衍生物，虽然具有APTT延长效果，但是抗血小板效果非常弱。在进行所述凝血酶衍生物的羧基修饰的情况下，APTT延长效果没有看到进一步增加，然而，抗血小板效果被显着地增大。其中，通过羧基修饰，其回收率显着降低至50％以下。
修饰体5将第205号丝氨酸置换成丙氨酸的衍生物，是虽然具有相当弱的APTT延长效果，但抗血小板效果非常弱的衍生物。在对所述凝血酶衍生物进行羧基修饰的情况下，APTT延长效果没有看到大幅度增加，抗血小板效果(PAR1及瑞斯托霉素两方的路径)显着地被放大。
修饰体6将第205号丝氨酸置换成丙氨酸、将第43号组氨酸置换成丙氨酸、将第65号赖氨酸置换成丙氨酸的衍生物，不仅具有强的APTT延长效果，而且具有强的PAR1路径的血小板聚集抑制效果。另一方面，不具有瑞斯托霉素引起血小板聚集抑制效果。在对所述凝血酶衍生物进行羧基修饰的情况下，APTT延长效果有所增强，M-凝血酶引起血小板聚集效果也有所增强，而重新赋予瑞斯托霉素引起血小板聚集抑制效果。并且，没有产生修饰体4中所看到的回收率的大幅降低。
另外，在仅抑制GPIbα的衍生物的情况下，使用通过将活性中心进行闭塞，凝血酶基质分解活性以及凝血酶基质结合能力降低的将PPACK-凝血酶(苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸序列被氯甲基酮修饰)修饰的凝血酶衍生物。其中，在此情况下，通过使对于TM的结合能力降低的本说明书中记载的氨基酸置换，而发挥更有效的效果。
本发明的各种凝血酶衍生物，可以根据目的分开使用。例如，可预测前面提到的凝血酶衍生物2，在静脉内对纤维蛋白血栓(红色血栓)具有效果，或者可预测凝血酶衍生物2的羧基修饰体，对于动脉内的血小板血栓(白色血栓)也具有效果。
或者一般认为，未进行羧基修饰的将上述第205号丝氨酸置换成丙氨酸、将第43号组氨酸置换成丙氨酸，且将第77号赖氨酸置换成谷氨酰胺的凝血酶衍生物，也对静脉内血栓有效。
并且，在动脉内的血小板血栓中，也在所述疾病中有出血问题的情况下，相对于凝血酶衍生物2的羧基修饰体，优选的是APTT延长效果较低的凝血酶衍生物3的羧基修饰体。对于这些，可以考虑疾病患者的危险及出血危险而进行选择。
4.本发明的用途、其他并且，本发明还提供编码上述凝血酶衍生物的DNA。如此的DNA，例如可例示编码含有序列号7、13、21、23、25、27、33、35、37或者39的碱基号码130～1056的碱基序列的凝血酶衍生物前驱体的DNA等。这些DNA，也可以以进行编码的氨基酸序列不产生变化的方式来改变密码子(codon)。另外，只要仅置换如上述的特定氨基酸，而编码具有目的活性的凝血酶衍生物，则可以与含有序列号7、13、21、23、25、27、33、35、37或39的碱基号码130～1056的碱基序列的DNA在严厉的(stringent)条件下进行杂交(hybridize)。这里，作为严厉的条件，例如可举出用于通常的Southern杂交(Southern hybridization)的洗涤条件，也就是以相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选的是60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，尤其优选的是65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度，进行1次，更优选的是2～3次清洗的条件。
另外，本发明的DNA并不限定于编码凝血酶衍生物的前驱体，即使是象编码A链的DNA与编码B链的DNA分别准备的情况下也包括在本发明的DNA中。
本发明的凝血酶衍生物具有抗血栓效果。所述作用可通过例如如实施例中所示的血浆的APTT测定以及全血凝固时间测定、血小板聚集能抑制效果加以确认。另外，在本发明中确认抗血小板效果时使用M-凝血酶引发血小板聚集抑制效果进行评价。
一般认为，因为M-凝血酶在PRP(富血小板血浆platelet rich plasma)中引发血小板聚集，以及其血小板聚集引发可通过抗PAR1抗体(ATAP2CosmoBio公司)完全被抑制，所以M-凝血酶通过凝血酶受体(PAR1)活化血小板。因此，一般认为，本发明中所获得的衍生物的抑制M-凝血酶引发血小板聚集的效果基于凝血酶受体活化抑制效果。
本发明的凝血酶衍生物也可以是除了上述置换以外，另外钠结合部位被置换的凝血酶衍生物。所谓钠结合部位是指在Biochemistry 1992年，第31卷，第11721-11730页中所记载的部位。其中优选的是B链232或者B链234的天冬氨酸(相当于序列号2的281或者283号天冬氨酸的天冬氨酸)。这些天冬氨酸两者都亦可被置换。而且，这些天冬氨酸，优选的是置换成丙氨酸或者天冬酰胺。
通过将本发明的凝血酶衍生物与制剂学上可接受的制剂载体进行组合，可用作医药组合物。这里，作为医药组合物优选的是可举出抗血栓治疗药、抗炎症剂、血小板聚集抑制剂、血小板粘着抑制剂、血小板GPIb拮抗剂、凝血酶受体活化抑制剂等。上述制剂载体如果是制剂学上可接受的载体，则并没有特别限制，然而，可使用在通常的药剂中所通用的注射剂用溶剂、稳定剂、稀释剂、表面活性剂等。本发明的医药组合物的投予单位形态并没有特别限定，可根据治疗目的进行适当选择。例如，可例示注射剂等。本发明的医药组合物的投予量可根据症状等适当进行选择。
实施例以下利用实验例更详细地说明本发明，但是只要不脱离其精神则本发明并不局限于所述实验例。
<1>凝血酶基质分解活性的测定方法A将合成基质S2238(Sigma公司)作为基质，根据在50mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8)、37℃中的405nm处吸光度的增加，进行测定。
被验样品(人野生型凝血酶或凝血酶衍生物)的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1MNaCl溶液(pH7.4)、人野生型凝血酶的情况下的浓度为1μg/ml，在凝血酶衍生物的情况下的浓度为200μg/ml)、合成基质S2238的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1M NaCl溶液(pH7.4)，每Eppen管中添加200μl，在37℃下培养12小时。添加200μl的50％乙酸中止反应。
另外，将每200μl的合成基质S2238的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1M NaCl溶液(pH7.4)、及50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1M NaCl(pH7.4)加入Eppen tube中，在37℃下培养12小时，作为对照品。
12小时培养后的对照品的吸光度，与培养前相比，增加了0.005。被验样品在12小时培养结束后的吸光度的增加，在与培养前的吸光度相比为0.05以下的情况下，判定为测定界限以下。
关于在方法A中在并未发现活性水平上活性降低的凝血酶，进而进行以下方法B或C或D中的任一活性测定。
方法B使用Fibrogammin P(Aventis Pharma公司)作为FXIII。相对于50μl将3ml的Fibrogammin P 250单位透析于入50mM EDTA、0.1MNaCl(pH7.4)溶液中，将100μl被验样品0.1mg/ml(凝血酶衍生物)的PBS溶液(pH7.4)加入Eppen tube中，在37℃下培养3小时后，通过SDS-PAGE来确认FXIII的活化的有无。在以目视确认分解产物的情况下，在-SH条件下进行SDS-PAGE，使用Light capture(Atto股份限公司)将FXIII的A链及活化A链的泳带浓度进行解析比较。
方法C在200μl的在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1M NaCl(pH7.4)中溶解4mg/ml Fbgn的溶液中，添加100μl调整为0.2mg/ml的被验样品(凝血酶衍生物)，充分混和后，在37℃下培养3小时。以目视判断在3小时后有无血液凝块形成。
方法D在200μl的于50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1M NaCl pH7.4中溶解0.1mg/ml凝血酶受体细胞外区域肽(序列号4)的溶液中，添加100μl调整为0.3mg/ml的被验样品(凝血酶衍生物)，充分混和后，在37℃下培养3小时。添加200μl的50％乙酸中止反应后，通过SDS-PAGE来确认有无凝血酶受体的活化。在以目视确认分解产物的情况下，在-SH条件下实行SDS-PAGE，使用lightcapture(Atto股份限公司)对凝血酶受体的分解产物的泳带浓度进行解析比较。
<2>基质结合能力的测定法方法E与水蛭素C末端肽(序列号3)的结合能力的确认(1)水蛭素C末端肽凝胶的制作将10mg水蛭素C末端肽溶解于0.1M NaHCO3缓冲液中，并添加10ml置换成同缓冲液的NHS活化Cellulophine(Chisso公司)，混合，于25℃下30分钟搅拌。
于其中添加20ml 1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH8、25℃，进而搅拌30分钟，获得水蛭素C末端肽固定化凝胶。将相同凝胶用50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.15M NaCl(pH7.4)于25℃下进行平衡化后，添加以0.1M NaHCO3缓冲液进行透析的各凝血酶衍生物，以30ml 0.1M NaHCO3缓冲液清洗。
(2)水蛭素C末端肽(序列号3)的结合能力的确认将2ml含有人野生型凝血酶或者凝血酶衍生物的部分，添加在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.15M NaCl(pH8)在4℃下中平衡化的水蛭素C末端肽柱10ml中，用30ml的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液清洗后，用50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸1M NaCl 3M尿素(pH8)进行溶出。通过使用抗人凝血酶抗体的免疫印迹(western blotting)发来确认直接通过的部分，以及溶出部分的凝血酶。另外，本发明中判断，水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合比例为添加于柱中的被验样品的50％以下的凝血酶衍生物，丧失基质结合能力。
<3>肝素结合能力的确认法方法F将5ml人野生型凝血酶或者凝血酶衍生物添加于用50mMNaHCO3/50m MNaCl溶液进行平衡化的HI-TRAP HEPARIN柱(AmershamPharmasia公司)，用15ml的50mM NaHCO3/50mM NaCl溶液清洗，然后使用缓冲液A50mM NaHCO3/50mM NaCl缓冲液(Buffer)B50mM NaHCO3/1MNaCl，在流速0.5ml/min、100分钟的条件下，进行从B0％至B100％的梯度(gradient)溶出。
人野生型凝血酶，A50％(0.5M NaCl)成为溶出峰。可判断，本条件下，与人野生型凝血酶相比，80％的以A40％以下盐浓度溶出的凝血酶衍生物，其肝素结合能力降低。
方法F使用生物传感器(IAsys日制产业公司)进行凝血酶衍生物的凝血酶受体结合能力的测定(1)凝血酶衍生物固定化试管的制作通过将被验样品(凝血酶衍生物)及10mM磷酸缓冲溶液(pH7.7)，在NHS活化CM右旋糖苷试管(dextran cuvet)(日制产业公司)中在25℃下搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM右旋糖苷试管中，获得凝血酶衍生物固定化试管。接着，添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断(Blocking)处理。
(2)将调整为1000、500、200、100、50、25、10nM的将凝血酶受体细胞外区域肽(序列号4)的50mM磷酸缓冲液、及0.1ml的0.15M NaCl溶液(pH7.4)添加于(1)中所获得的凝血酶衍生物固定化试管中，对结合曲线进行解析。使用FAST fit(日制产业公司)，按照相同公司手册(manual)进行解析。
<3>APTT测定方法关于本实施例中的方法，只要没有特别指定，则APTT测定可以采用下述方法进行。
将标准血浆(国际试剂公司)与样品混和，添加总量的25％的APTT试剂(国际试剂公司)，在37℃下培养5分钟。5分钟后，添加0.1M CaCl2溶液，使其浓度成为8μM，测定从添加氯化钙起至凝固的时间。
<4>AHT的合成本实施例中的AHT，使用以下述实验方法而获得的AHT。
4-1AHT的合成将60mg人野生型凝血酶溶解于50ml 100μM PIPES pH6.5中，添加10mg的APMSF(WAKO公司)，再搅拌10分钟。接着，用冰水混合物使溶解样品冷却，添加6ml的1N NaOH溶液，反应10分钟后(在冰水混合物中反应)，添加14ml的5M NaCl以及70ml的丙三醇，搅拌，以1M PIPES(pH值6.5)调整为pH8.0。进而，向560ml的0.1M NaHCO3-0.5M NaCl中滴加调整样品，稀释，以0.1M NaHCO3-0.5M NaCl进行透析。接着，将透析样品以8,000rpm转速离心5分钟以除去沉淀，然后将样品浓缩至最终体积100ml。
在1ml的50单位/ml抗凝血酶(Anti-Thrombin，AT)中加入10mg肝素，再将其加入将其浓缩后的样品中，再透析入50mM NaHCO3-0.3M NaCl中。然后，以8,000rpm转速离心5分钟以除去沉淀。
4-2AHT的提纯在50ml以50mM NaHCO3平衡化的苯甲脒-琼脂(Benzamidine-Sepharose)中，添加50ml在A中所获得的样品(流速2ml/min)，以50mM NaHCO3-0.1M NaCl清洗后，用0.1M苯甲脒(Benzamidine)-50mM NaHCO3-0.1M NaCl进行溶出。用BCA进行蛋白确认，将含有AHT蛋白的部分，添加于用50mM NaHCO3平衡化的肝素-琼脂(HePARlne-Sepharose)中(流速2ml/min)，然后以1mM PIPES-0.1M NaClpH6.5进行清洗，除去苯甲脒，然后以1mM PIPES 1M NaCl pH6.5将AHT溶出。在溶出部分中，添加10mg的APMSF，透析入1mM PIPES 0.1 M NaClpH6.5中。
4-3第2次苯甲脒提纯接着，在样品中添加1mg APMSF后立即再次进行柱添加，再加入以1mMPIPES pH6.5平衡化的苯甲脒-琼脂(Benzamidine-Sepharose)柱中。用1mM PIPES-0.1MNaCl pH6.5进行清洗，然后以0.1M苯甲脒(Benzamidine)-1mM PIPES 0.1M NaCl pH6.5进行溶出，在用1mM PIPES pH6.5平衡化的肝素-琼脂(Heparine-Sepharose)中，添加AHT部分，用1mM PIPES-0.1M NaClpH6.5清洗，然后以1mM PIPES-1M NaCl pH6.5进行溶出。
4-4第3次苯甲脒提纯在所获得的样品中添加10mg APMSF，通过1mM PIPES-0.1M NaCl pH值6.5进行透析，然后以与第2次苯甲脒提纯同样的操作提纯AHT，在肝素溶出AHT中再次添加1mg的APMSF。回收约30mg的AHT。
4-5APTT的测定方法将100μl的调整为50μg/ml及25μg/ml的AHT以及凝血酶变异体PBS溶液(PBS；137mM NaCl，2.68mM KCl，8.1mM NaHPO4，1.47mM KHPO4(pH7.4)与100μl标准血浆(国际试剂公司)混合，添加50μl的APTT试剂(国际试剂公司)，在37℃培养5分钟，然后添加22μl的0.1M CaCl2，分别测定从添加氯化钙起至凝固(析出血纤维蛋白(fibrin)块)的时间。作为对照品，是使用同样地仅添加PBS的标准血浆，以同样方法测定APTT。
以下实验例中，也进行培养、添加APTT试剂、钙溶液；APTT的测定也是用同样方法进行。
另外，各种凝血酶衍生物中的APTT延长能力，在50μg/ml及25μg/ml的至少一个浓度中，将相对于比较对象(AHT等)有APTT增加的情况判断为APTT延长能力提高。例如在50μg/ml及25μg/ml的至少任一浓度中，将APTT相对于比较对象上升至1.1folds以上的情况判断为APTT延长效果上升至1.1folds以上。
4-6AHT的APTT的测定将100μl的50μg/ml及25μg/ml的AHT(PBS137mM NaCl、2.68mMKCl、8.1mM NaHPO4、及1.47mM KHPO4(pH7.4))与100μl标准血浆(国际试剂公司)混合，添加50μl的APTT试药(国际试剂公司)，在37℃下培养5分钟，然后添加22μl的0.1M CaCl2，分别测定从添加钙起至凝固(纤维蛋白块析出)的时间。代替AHT溶液，将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照品测定的结果分别为对照品46.5秒AHT 50μg/ml63.5秒(1.36folds)AHT 25μg/ml58.5秒(1.25folds)[实验例1](1)人野生型凝血酶的表达将含有人野生型凝血酶的A链及B链的DNA(序列号5)插入载体中，并转染入CHO细胞中，获得前凝血酶生产细胞。
另外，序列号6中所表示的人野生型前凝血酶的序列中，氨基酸号码1～43是信号序列，44～92是A链，93～351是B链。
将2升前凝血酶生产细胞置入CD-CHO培养基中培养10天。将2升所获得的前凝血酶生产细胞的培养液在20升10mM的PIPES缓冲液(pH7)中，在4℃下每6小时透析2次，然后加入500ml的CM cellulofine(Chisso公司)中，用1升10mM的PIPES缓冲液(pH7)进行清洗。接着，用0～1M的10mM的PIPES缓冲液(pH7)，以NaCl的直线性浓度梯度进行溶出。将每25ml的溶出液分为一个部分，在以使用抗人凝血酶多克隆抗体(CosmoBio公司)的免疫印记法(Western blotting)对这些部分进行确认时，在约0.4M的浓度下将人野生型凝血酶溶出。
(2)通过ecarin的人野生型凝血酶的活化以及活化人野生型凝血酶的水蛭素C末端肽结合能力的确认将约100ml含有5mg所获得的人野生型凝血酶的部分透析入2升的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、0.15M NaCl、5mMCaCl2(pH8)溶液中，然后添加100单位的ecarin(Sigma公司)在37℃下培养24小时。在使用ecarin处理后的一部分而进行方法E记载的水蛭素C末端肽结合实验时，在直接通过的部分中，没有确认有凝血酶，而在溶出部分中确认有凝血酶的泳带。
(3)人野生型凝血酶的提纯接着，将98ml含有水蛭素C末端肽结合实验中所使用的残留的ecarin活化后的凝血酶的溶液，加入以50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、0.1M NaCl(pH8)平衡化的硫酸化cellulofine柱(Chisso公司)200ml中，用200ml相同缓冲液清洗相同柱，然后以50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、1M NaCl(pH8)进行溶出。进而，将溶出液透析入50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、0.1M NaCl(pH8)中，加入用相同缓冲液进行平衡化的水蛭素C末端肽柱中(除将水蛭素C末端肽设为200mg、将NHS活化cellulofine(Chisso公司)设为30ml以外，根据上述“方法E确认与水蛭素C末端肽(序列号3)的结合能力”中所记载的方法进行制作)。用150ml的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液将所述水蛭素C末端肽柱清洗，然后以50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、1M NaCl 4M胍(Guanidine)盐酸(pH8)溶液进行溶出，在SDS-PAGE上获得约5mg的大致提纯的有水蛭素结合能力的人野生型凝血酶。
(4)羧基修饰凝血酶(M-凝血酶)的合成将溶解于5ml的50mM磷酸缓冲液0.5M NaCl(pH6.5)溶液中的1mg人野生型凝血酶置于0.25M甘氨酸乙酯0.5M NaCl(pH6.5)中，在4℃下透析3小时，然后以浓度成为20mg/ml的方式在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，和光纯药)，在25℃下培养1小时，对人野生型凝血酶的羧基进行修饰。以残存碳酰二亚胺最终浓度成为0.5M的方式添加甘氨酸，中止反应。质量分析的结果是分子量约增加1400，约将15个羧基修饰。
(5)对使用PRP的修饰凝血酶的引起血小板聚集以及抗PAR1抗体(ATAP2 CosmoBio公司)的抑制效果的评价将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，从上清液中获得2ml的PRP。进而，通过以2800rpm转速离心分离10分钟而获得PPP。
在140μl的PRP中添加100μl的PBS，再添加35μl的1μg/ml的修饰凝血酶/PBS溶液，记录透过率的随时间变化。结果示于图46的002。
将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，从上清液中获得2ml的PRP。进而，以2800rpm转速离心分离10分钟，获得PPP。
在140μl的PRP中添加100μl的50μg/ml的PAR1抗体/PBS溶液，再添加35μl的1μg/ml的修饰凝血酶的PBS溶液，记录透过率的随时间变化。结果示于图46的001。
根据以上结果可知，修饰凝血酶引发血小板聚集，而且PAR1抗体完全抑制由修饰凝血酶引起的血小板聚集。因此显示出，修饰凝血酶是通过PAR1活化而引起血小板聚集。
(1)B链203甘氨酸置换成丙氨酸以及B链205丝氨酸置换成甘氨酸的凝血酶衍生物(以下称为203A205G凝血酶)的表达通过使用相当于203A205G凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码203A205G凝血酶基因的碱基序列示于序列号7。将203A205G凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约5mg大致提纯的203A205G凝血酶。然后，根据方法F测定肝素凝胶的结合能力时，所述凝血酶在与野生型人的凝血酶同等的溶出位置(A50％)上被溶出。
(2)203A205G凝血酶的基质分解活性的测定按照上述方法A对(1)中所获得的203A205G凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是没有看到培养后的吸光度有显着增加。
另外，根据上述方法B对203A205G凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定的结果示于图41。没有确认到培养3小时后的样品(泳道6)FXIII的A链活化产物的泳带。另外，根据上述方法C测定203A205G凝血酶的凝血酶基质分解活性的结果是没有确认到血液凝块(Clot)形成。
(3)203A205G凝血酶的凝血酶受体的结合能力的确认根据上述方法F测定(1)中所获得的203A205G凝血酶的凝血酶受体的结合能力。203A205G凝血酶的凝血酶受体的离解常数(Dissociationconstant)是3.2μM。
(4)203A205G凝血酶的APriVr的测定将100μl的50μg/ml 203A205G凝血酶(PBS；137m MNaCl，2.68mMKCl，8.1mMNa2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH7.4))与100μl标准血浆(国际试剂公司)进行混合，并测定APTT。作为对照，同样地测定仅添加PBS的标准血浆时，对照为44秒，203A205G凝血酶为48秒，延长1.09folds。
(5)使用PRP(富血小板血浆platelet rich plasma)对203A205G凝血酶的抗血小板效果的评价评价1将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，从上清液中获得2ml PRP。另外，通过在2500rpm离心分离10分钟，获得PPP(贫血小板血浆platelet poor plasma)。在添加100μl的情况下，使最终浓度成为80μg/ml对203A205G凝血酶的浓度进行调整，将100μl的203A205G凝血酶的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液添加到130μl PRP中，作为血小板聚集引发物质添加35μl的5mg/ml的瑞斯托霉素5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)溶液。作为对照品，在130μl的PRP中，添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化。另外，使用EASY TRACERET-800(东京光电股份限公司)进行透过率(波长700nM)的测定。结果示于图11中。另外，纵轴的透过率是表示与血小板聚集能正的相关值。
评价2除了1μg/mlM-凝血酶(人野生型)5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)溶液作为血小板聚集引发物质以外，根据评价(1)的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)，记录透过率的经时变化。另外，使用EASY TRACERET-800(东京光电股份限公司)进行透过率的测定。结果示于图12中。
从图11，12中可以获得这样的结果即使添加80μg/ml的浓度的203A205G凝血酶，也不可能获得显着抑制血小板聚集的效果。
(6)使用IAsys的凝血酶基质结合能力比较实验将203A205G凝血酶衍生物或者AHT的0.1mg/ml的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶液分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，在25℃搅拌10分钟，通过这样的操作将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得203A205G凝血酶或者AHT固定化比色管。(各比色管中，203A205G凝血酶与4100arc，AHT与2400arc分别结合。)接着，添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。在203A205G比色管或者AHT比色管中分别添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图13及图14。
可以确认，相对于从图14中知道的在AHT比色管中Fbgn和FVIII几乎相同程度地进行结合，从图13知道的在203A205G比色管中FVIII比Fbgn更少的结合。可以知道，与为了将结构变化最小化通过单纯地将第205号丝氨酸变换为脱氢丙氨酸而获得的AHT相比，203A205G凝血酶具有较低的FVIII结合能力。而且，相对于AHT，203A205G凝血酶以与固相化量的比进行换算，FVIII结合降低约11％。因此，一般认为203A205G凝血酶的APTT延长效果较低。
(7)羧基修饰203A205G凝血酶的APTT以及凝血酶原时间(PT)的测定将溶解于5ml的50mM磷酸缓冲液0.5MNaCl(pH6.5)中的1mg的203A205G凝血酶在0.25M甘氨酸乙酯0.5M NaCl(pH6.5)中于4℃下透析3小时后，在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，和光纯药)，并使其浓度成为201mg/ml，在25℃下培养1小时对203A205G凝血酶的羧基进行修饰。使残存碳酰二亚胺的最终浓度成为0.5M添加甘氨酸中止反应。质量分析的结果是，分子量增加约1400，约有15个的羧基被修饰。
评价1APTT测定1将50μl的溶解有500μg被修饰的203A205G凝血酶的1ml的5mMPIPES缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)，添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶10的比例，并测定APTT。将5mMPIPES缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶10，作为对照，并测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为38秒，羧基修饰203A205G凝血酶的APTT为65秒。
评价2APTT测定2将100μl的溶解有50μg被修饰的203A205G凝血酶的1ml的PBS溶液，添加到100μl的标准血浆(国际试剂公司)中，并测定APTT。将同样添加PBS的标准血浆(国际试剂公司)作为对照，并测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为44秒，羧基修饰203A205G凝血酶的APTT为85秒。
评价3PT的测定将溶解有500μg被修饰的203A205G凝血酶的1ml的5mMPIPES缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)，添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使容量比成为1∶10，并测定PT。将5mMPIPES缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶10，以此为对照测定PT。另外，PT试剂使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITH CALSIUM其结果是，相对于对照的PT为20秒，羧基修饰203A205G凝血酶的PT为21秒。
(8)使用PRP(富血小板血浆platelet rich plasma)的羧基修饰203A205G凝血酶的抗血小板效果的评价评价1将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，从上清液中获得2ml PRP。另外，通过在2800rpm离心分离10分钟，获得PPP(贫血小板血浆platelet poor plasma)。在添加100μl的情况下，使羧基修饰203A205G凝血酶的最终浓度成为37μg/ml进行调整浓度，将100μl羧基修饰203A205G凝血酶的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液添加到130μl的PRP中，作为血小板聚集引发物质添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液。作为对照，在130μl的PRP中，添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)，记录透过率的经时变化。另外，使用EASYTRACERET-800(东京光电股份限公司)进行透过率(波长700nM)的测定。结果示于图1。另外，纵轴的透过率表示与血小板聚集能正的相关值。
评价2除了使用1μg/mlM-凝血酶(人野生型)5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)溶液作为血小板聚集引发物质以外，根据评价1的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)记录透过率的经时变化。另外，使用EASYTRACERET-800(东京光电光电股份限公司)进行透过率的测定。结果示于图2。
根据图1、图2可知，由于使用羧基修饰203A205G凝血酶导致血小板聚集降低，因此，所述凝血酶衍生物在瑞斯托霉素引发血小板聚集以及修饰凝血酶引发血小板聚集中显示出抗血小板效果。
根据以上结果可知，203A205G凝血酶虽然活性下降到检测界限以下，但是仍保持基质的结合能力。而且，从APTT的结果以及血小板聚集抑制实验的结果可知，203A205G凝血酶在80μg/ml的情况下，保持充分的抗血栓效果，抗血小板效果，然而，约15个的羧基被修饰了的羧基修饰203A205G凝血酶即使在低浓度的情况下也具有充分的抗血栓效果、抗血小板效果。
而且，从使用IAsys的基质结合能力比较实验可以推测，因为203A205G凝血酶的FVIII结合能力较低，而且结合力与AHT相比，如果是固定化蛋白的情况下也降低11％左右，没有较高的APTT延长效果。进行过羧基修饰的203A205G凝血酶具有与实验例12中所记载的205A43A凝血酶同等的APTT延长效果，但是，血小板聚集抑制效果与205A43A凝血酶相比显示出同等的效果。在与进行过羧基修饰的205A43A凝血酶相比的情况下，进行过羧基修饰的203A205G凝血酶中即使是APTT延长效果较弱的，血小板聚集抑制效果也显示出同等较强的性质。
(9)203A205G凝血酶的羧基修饰个数与抗血栓效果关系的评价(9)-1，修饰个数从1到10个的羧基修饰203A205G衍生物的制作将5ml的50mM磷酸缓冲液0.5M NaCl(pH6.5)中所溶解的1mg203A205G凝血酶在0.25M甘氨酸乙酯0.5M NaCl(pH6.5)中在4℃透析3小时后，在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)，并使最终浓度成为2mg～20mg/ml，在25℃下进行60分钟到120分钟的培养，获得203A205G凝血酶的2个到28个的羧基被修饰了的羧基修饰凝血酶衍生物1～5。
(9)-2，在PBS中透析的羧基修饰凝血酶衍生物1-5的APTT延长效果将100μl的溶解有50μg的被修饰的203A205G凝血酶的1ml的PBS溶液，添加到标准血浆(国际试剂公司)中，并测定APTT。在PBS中同样添加标准血浆(国际试剂公司)以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。
结果表示如下。
203A205G凝血酶 约0个修饰 APTT47秒羧基修饰凝血酶衍生物1约1个修饰 APTT48秒羧基修饰凝血酶衍生物2约3个修饰 APTT56秒羧基修饰凝血酶衍生物3约5个修饰 APTT61秒羧基修饰凝血酶衍生物4约10个修饰APTT77秒羧基修饰凝血酶衍生物5约26个修饰APTT60秒从以上可知，在使用EDC的203A205G凝血酶中，通过3个以上的羧基修饰可以确认到显着的APTT延长效果。羧基修饰凝血酶衍生物1-4中，修饰前后回收率为75％以上。虽然有26个被修饰的衍生物可以看到APTT延长效果，但是都有聚集的产生，如果回收率低于40％，则会发生由于过度羧基修饰导致回收率的降低的情况。
(1)B链205丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(以下205A凝血酶)的表达通过使用相当于205A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205A凝血酶基因的碱基序列示于序列号9。将205A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在。溶出峰中确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约6mg大致提纯的205A凝血酶。
根据205A凝血酶的水蛭素C末端固定化肽的提纯结果的电泳示于图39。泳道5的直接通过的中没有确认到205A凝血酶的泳带，而可以确认在溶出溶离份中被提纯的205A凝血酶的泳带。
从上述结果表示205A凝血酶具有水蛭素C末端肽固定化凝胶结合能力。
然后，根据方法F测定肝素凝胶的结合能力时，所述凝血酶在与野生型人的凝血酶同等的溶出位置(A50％)上被溶出。
(2)205A凝血酶的基质分解活性测定根据上述方法B测定(1)中所获得的205A凝血酶的凝血酶基质分解活性的结果示于图40。如泳道8中所示，没有确认3小时后被活化的FXIII的A链。
(3)205A凝血酶的APTT的测定将500μg的205A凝血酶溶解于1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为55秒，205A凝血酶的APTT为95秒。
将50μg 205A凝血酶溶解于1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为41秒，205A凝血酶的APTT为62秒。
另外，将1mg/5ml的205A凝血酶/50mM磷酸缓冲液0.5M NaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5M NaCl(pH6.5)中在4℃透析3小时后，在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)，使其浓度成为20mg/ml，在25℃下培养1小时对205A凝血酶的羧基进行修饰。可以在可溶化状态下获得约80％的修饰衍生物。
将50μg羧基修饰205A凝血酶溶解到，1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使其容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为42秒，羧基修饰205A凝血酶的APTT为79秒。
(4)凝血酶原时间(PT)的测定将50μg 205A凝血酶以及羧基修饰205A凝血酶溶解到1ml的PBS中，并分别将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定PT。另外，PT试剂使用Sigama公司的THROMBOPLASTINWITH CALSIUM，其结果是，相对于对照的PT为21秒，205A凝血酶的PT为21秒，羧基修饰205A凝血酶的PT为20秒，其中任何一个均显示出PT的延长效果。
(5)使用PRP(富血小板血浆platelet rich plasma)的205A凝血酶的抗血小板功能的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，从上清液中获得2ml PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟，获得PPP(贫血小板血浆platelet poor plasma)。在添加100μl的情况下，使205A凝血酶的最终浓度成为70μg/ml调整浓度，在100μl的205A凝血酶的51nM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液中添加130μl PRP，添加35μl 5mg/ml瑞斯托霉素5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液作为血小板聚集引发物质。作为对照，在130μl PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化。另外，EASYTRCERET-800(东京光电股份限公司)进行透过率(波长700nm)的测定。然而本实验中美玉确认到70μg/ml时的血小板聚集抑制效果。
评价2除了使用1μg/mlM-凝血酶(人野生型)5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液作为血小板聚集引发物质以外，根据评价(1)的方法进行实验。作为对照，在130μl PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)，记录透过率的随时间变化。另外，EASYTRCERET-800(东京光电股份限公司)进行透过率的测定。然而本实验中没有确认到70μg/ml时的血小板聚集抑制效果。
从以上可以确认205A凝血酶具有较弱的APTT延长效果。然而，没有确认到抗血小板效果。如专利文献4中所示，在不含有血浆的培养基的环境下，205A凝血酶凝血酶显示出受体活化抑制能，然而，作为血浆中抗血小板剂可实质使用的水平的凝血酶不具有受体活化能。
(6)使用PRP的羧基修饰205A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，从上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，羧基修饰205A凝血酶的最终浓度成为100μg/ml之方式进行浓度制备，将羧基修饰205A凝血酶的PBS溶液在130μl PRP中各添加100μl，添加35μl的(i)1μg/ml的M-凝血酶PBS溶液，(ii)5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl，pH7.4进行血小板聚集抑制实验。(i)(ii)的结果示于图21、22。
(7)205A凝血酶的与Fbgn以及FVIII的结合能力的比较通过将205A凝血酶的约0.1mg/ml的浓度的10mM磷酸缓冲液(pH7.7)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，在25℃搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得205A凝血酶固定化比色管。(约600arc固相化)接着添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。
在205A凝血酶比色管中添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图23。从图23可知，205A凝血酶的FVIII特异性虽然增加，但是，FVIII结合信号相对地与AHT(图14)相比降低为40％左右。因此，195A凝血酶没有表现出那种程度的较强的抗血栓能。而且，195A凝血酶通过羧基修饰增加APTT延长效果，而且对于M-凝血酶引发血小板聚集、瑞斯托霉素引发血小板聚集两者均表现出抑制效果。

(1)B链205丝氨酸置换成苏氨酸的凝血酶(以下205T凝血酶)的表达通过使用相当于205T凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205T凝血酶基因的碱基序列示于序列号11。将205T凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约5mg大致提纯的205T凝血酶。
(2)205T凝血酶的基质分解活性测定按照上述方法A对在(1)中所获得的205T凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是205T凝血酶的基质分解活性与人野生型凝血酶相比约2.5×10-4的活性。
另外，根据上述方法B对凝血酶的凝血酶基质分解活性的结果是几乎全部的FXIII的A链接受野生型凝血酶同样的活化，可以确认所分解的FXIII的泳带。从以上可以知道残存有205T凝血酶活性。
(1)B链203甘氨酸置换成丙氨酸B链205丝氨酸置换成丙氨酸B链99天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶(203A205A99N凝血酶)的表达通过使用相当于203A205A99N凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码203A205A99N凝血酶基因的碱基序列示于序列号13。将203A205A99N凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约5mg大致提纯的203A205A99N凝血酶。
然后，根据方法F测定肝素凝胶的结合能力时，所述凝血酶在与野生型人的凝血酶同等的溶出位置(A40％)上被溶出。
(2)203A205A99N凝血酶的基质分解活性测定按照上述方法A对在(1)中所获得的203A205A99N凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是培养后的吸光度的增加。
另外，根据上述方法B对203A205A99N凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是没有确认到FXIII的A链活化产物的泳带。
(3)203A205A99N凝血酶添加血液的APTT的测定将100μg的203A205A99N凝血酶溶解于1ml 5mMPIPES缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使容量比成为1∶1，并测定APTT。将5mM PIPES缓冲液0.15MNaCl(pH7.4)添加到标准血浆(国际试剂公司)中使其容量比成为1∶1的比例，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为55秒，203A205A99N凝血酶的APTT为60秒。根据上述可知，203A205A99N凝血酶具有水蛭素凝胶的结合能力，而且，活性充分降低的203A205A99N凝血酶没有充分的抗血栓效果。
(1)B链205丝氨酸置换成缬氨酸的凝血酶(以下205V凝血酶)的表达通过使用相当于205V凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205V凝血酶基因的碱基序列示于序列号15。
将205V凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力。结果示于图44(SS结合还原下免疫印记法的图)。直接通过的馏分几乎全部显示出凝血酶的泳带，在溶出峰中没有确认到凝血酶的泳带。通过这些可以知道205V凝血酶通过活性中心的氨基酸的置换而基质结合能力降低。应用前在样品标准凝血酶的分子量上所出现的泳带通过ecarin没有在A，B链上进行活化(切断)的凝血酶，可以确认相对于ecarin感受性也显着降低。
(1)B链205丝氨酸置换成天冬氨酸的凝血酶(以下205D凝血酶)的表达通过使用相当于205D凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205D凝血酶基因的碱基序列示于序列号17。
将205D凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力。结果示于图45(SS结合还原下免疫印记法的图)。直接通过的馏分几乎全部显示出凝血酶的泳带，在溶出峰中没有确认到凝血酶的泳带。通过这些可以知道205D凝血酶通过活性中心的氨基酸的置换而基质结合能力降低。应用前在样品标准凝血酶的分子量上所出现的泳带通过ecarin没有在A，B链上进行活化(切断)的凝血酶，可以确认相对于ecarin感受性也显着降低。
(1)B链205丝氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶(以下205N凝血酶)的表达通过使用相当于205N凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205N凝血酶基因的碱基序列示于序列号19。
将205N凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分几乎全部显示出凝血酶的泳带，在溶出峰中没有确认到凝血酶的泳带。由此可知，205N凝血酶，因活性中心的氨基酸的置换而使其基质结合能力降低。
根据方法D测定AHT的凝血酶受体结合能力，所述AHT与凝血酶受体的离解常数为1.2μM。
(1)B链205丝氨酸置换成丙氨酸B链99天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶(205A99N凝血酶)的表达通过使用相当于205A99N凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。
编码205A99N凝血酶基因的碱基序列示于序列号21。
将205A99N凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分几乎全部显示出凝血酶的泳带，在溶出峰中没有确认到凝血酶的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约5.5mg大致提纯的203A205A99N凝血酶。
(2)205A99N凝血酶的基质分解活性测定按照上述方法A对在(1)中所获得的205A99N凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是培养后的吸光度的增加。
另外，根据上述方法B对205A99N凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是没有确认到FXIII的A链活化产物的泳带。
(3)205A99N凝血酶的APTT的测定将50μg的205A99N凝血酶溶解于1ml PBS中，将100μl所述溶液与100μl标准血浆(国际试剂公司)进行混和，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为55秒，205A99N凝血酶的APTT为58秒。
(1)B链203甘氨酸置换成丙氨酸B链205丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(203A205A凝血酶)的表达通过使用相当于203A205A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码203A205A凝血酶基因的碱基序列示于序列号23。
将203A205A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约4mg大致提纯的203A205A凝血酶。
然后，根据方法F测定肝素凝胶的结合能力时，与通过A40％进行溶出的人野生型凝血酶相比，可以确认向40％的亲和性的下降。
(2)203A205A凝血酶的基质分解活性测定按照上述方法A对在(1)中所获得的203A205A凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是培养后的吸光度的增加。
另外，将203A205A凝血酶的凝血酶基质分解活性根据上述方法B进行测定。结果示于图43。泳道6的培养3小时后没有确认到FXIII的A链活化产物的泳带。并可知，203A205A凝血酶具有水蛭素C末端肽结合能力而且失去充分的活性。将100μg的203A205A凝血酶溶解于5mM PIPES缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)中，将1ml所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使容量比成为1∶1的比例，并测定APTT。将5mM PIPES缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)以成为1∶1的比例的方式添加到标准血浆(国际试剂公司)中作为对照，并测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为55秒，203A205A凝血酶的APTT为59秒。
(3)羧基修饰体的APTT试验另外，将1mg/5ml的203A205A凝血酶0.5M NaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5MNaCl(pH6.5)中在4℃透析3小时后，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)，以浓度成为20mg/ml的方式进行添加，在25℃培养1小时对203A205A凝血酶的羧基进行修饰。可以在可溶化状态下获得约80％的修饰衍生物。将50μg羧基修饰203A205A凝血酶溶解到1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使其容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，羧基修饰203A205A凝血酶的APTT为46秒。
(4)凝血酶原时间(PT)的测定将50μg 203A205A凝血酶以及羧基修饰203A205A凝血酶溶解到1mlPBS中，将100μl所述溶液分别添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使其容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定PT。另外，PT试剂使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITH CALSIUM。其结果是，相对于对照的PT为20秒，203A205A凝血酶的PT为21秒，羧基修饰203A205A凝血酶的PT20秒，任何一个均显示出PT的延长效果。
(5)PRP203A205A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，自上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，203A205A凝血酶的最终浓度成为100μg/ml制备浓度，将203A205A凝血酶的PBS溶液，各100μl添加到130μl PRP中，添加(i)1μg/mlM-凝血酶PBS溶液，(ii)5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液35μl作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl，pH7.4进行血小板聚集抑制实验，然而，相对于(i)(ii)中任何一个引发物质，对照与203A205A凝血酶没有差异。
(6)203A205A凝血酶的与Fbgn以及FVIII的结合特异性的比较通过将203A205A凝血酶约0.1mg/ml的浓度的10mM磷酸缓冲液(pH7.7)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，在25℃搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得203A205A凝血酶固定化比色管。(约600arc固相化)接着，添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。
在203A205A凝血酶比色管中分别添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图24。从图24中可知，203A205A凝血酶在FVIII中，与AHT相比，根据固定化蛋白量的比的值仅表示约5％的信号。可以推测由于本序列的衍生物的基质结合能力降低导致不具有那些抗凝固能。
(1)B链205丝氨酸置换成丙氨酸，B链43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号25。
将205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在。从溶出峰中确认到与凝血酶同样的泳带可以确认到95％以上的205A43A凝血酶的结合。
然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的205A43A凝血酶。
由水蛭素C末端肽柱进行的提纯示于图38。水蛭素C末端肽提纯步骤中直接通过的(泳道4)中没有确认到凝血酶的溶出，可以确认到在溶出溶离份中所提纯的205A43A凝血酶的回收。
然后，根据方法F测定肝素凝胶的结合能力时，得到A50％的溶出液。
(2)205A43A凝血酶的基质分解活性测定按照上述方法A对(1)中所获得的205A43A凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是没有看到培养后的吸光度有显着增加。
将50μg的205A43A凝血酶溶解于1mlPBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为46秒，205A43A凝血酶的APTT为78秒，延长APTT1.7倍。所述延长效果与相同条件下的去水凝血酶相比为APTT延长效果的1.25folds。
(3)PT的测定将50μg的205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定PT。中使容量比成为1∶1，另外，PT试剂是使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITHCALSIM。其结果是，相对于对照的PT为24秒，205A43A凝血酶的PT为25秒。
(4)羧基修饰205A43A凝血酶的APTT的测定将1mg/5ml的205A43G凝血酶/50mM磷酸缓冲液/0.5M NaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯/0.5M NaCl(pH6.5)中，在4℃透析3小时后，在其中，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)使其浓度成为20mg/ml，于25℃下培养1小时对205A43A凝血酶的羧基进行修饰。修饰体的质量分析进行测定，结果显示约16个羧基被修饰了。
将50μg的被修饰的205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为46秒，羧基修饰205A43A凝血酶的APTT为190秒。
(5)凝血酶原时间(PT)的测定将50μg的羧基修饰205A43A凝血酶溶解到1ml的PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为作为对照，测定PT。另外，PT试剂使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITH CALSIUM，其结果是，相对于对照的PT为22秒，羧基修饰205A43A凝血酶的PT为23秒，在修饰体中，205A43A凝血酶显示出PT的延长效果。
(6)PRP205A43A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，自上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，使205A43A凝血酶的最终浓度成为30μg/ml调整浓度，每130μl PRP添加100μl205A43A凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化。结果示于图3。
评价2除了使用1μg/ml M-凝血酶PBS溶液作为引发物质以外，按照评价1的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl PBS，记录透过率的经时变化。结果示于图4。
评价3添加100μl的1μg/mlM-凝血酶PBS溶液作为引发物质的情况下，以205A43A凝血酶的最终浓度分别成为120μg/ml、30μg/ml的方式调整浓度，添加205A43A凝血酶的PBS溶液，根据评价1的方法进行实验。结果示于图15。
评价4以205A43A凝血酶的最终浓度成为150μg/ml的方式调整浓度，每130μlPRP添加100μl 205A43A凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的PBS，记录透过率的经时变化。205A43A凝血酶在高浓度的情况下没有确认到瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果。
(7)PRP羧基修饰205A43A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，自上清液中获得2ml的PRP。另外，以2500rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，以羧基修饰205A43A凝血酶的最终浓度分别成为30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml的方式调整浓度，每130μl PRP中，分别添加100μl 3种类羧基修饰205A43A凝血酶的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH 7.4)，记录透过率的经时变化。另外，使用EASYTRACERET-800(东京光电光电股份限公司)进行透过率的测定。结果示于图5-7。
评价2引发物质1μg/mlM-凝血酶51nM磷酸缓冲液除了使用0.15M NaCl(pH7.4)溶液以外，根据评价(1)的方法进行实验。作为对照品，在130μl的PRP中，添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl(pH7.4)，记录透过率的经时变化。另外，使用EASYTRACERET-800(东京光电光电股份限公司)进行透过率的测定。结果示于图8-10。
(8)使用IAsys的凝血酶基质结合能力比较实验通过将205A43A凝血酶衍生物以及AHT的0.1mg/ml的浓度的10mM磷酸缓冲液(pH7.7)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，于25℃下搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHs活化CM葡聚糖比色管中，获得205A43A凝血酶以及AHT固定化比色管。使1307arc的205A43A凝血酶比色管固定化。接着，添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。在205A43A比色管以及AHT比色管中添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图16以及图14。相对于从图14中显示的在AHT比色管中，Fbgn与FVIII几乎相同程度地结合，可以确认从图16中显示的在205A43A比色管中，FVIII比Fbgn有较多结合。
可以确认205A43A凝血酶衍生物的FVIII与Fbgn结合能力的比与AHT相比约上升1.4folds。
并且，一般认为，与对于AHT固定化蛋白的对比，具有相同的FVIII结合能力。
(9)205A43A凝血酶的修饰个数与APTT延长效果的实验通过将1mg/5ml的205A43A凝血酶/50mM磷酸缓冲液0.5M NaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5M NaCl(pH6.5)中，于4℃下透析3小时后，在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)，使其浓度成为20mg/ml，于25℃下反应10分钟、60分钟、120分钟修饰羧基。各反应时间所残存的碳酰二亚胺以最终浓度成为0.5M的方式添加甘氨酸中止反应。
可以确认下面的羧基修饰反应与未反应的205A43A凝血酶相比，在10分钟反应样品中，分子量约增加480Da(相当于5.6个羧基被修饰了)，在60分钟反应样品中分子量增加1240Da(相当14.6个羧基被修饰了)，在120分钟反应样品中分子量增加1900Da(相当22.4个羧基被修饰了)。
各凝血酶衍生物的APTT延长效果将各修饰体分别调整为50、25、12.5μg/ml在PBS下降透析。将各样品与标准血浆混合成1∶1的比例测定APTT。测定结果示于下面的表2中。另外，各样品测定2次APTT，并计算出其平均值。


根据以上结果可以确认205A43A凝血酶中，5.6个的修饰与未修饰相比，APTT的延长效果被增强。虽然14.6、22.4个随着修饰数的增加，APTT延长效果增加，然而22.4个修饰的情况下，回收率降低到约50％。可以确认考虑到回收率与APTT延长效果的观点，5个以上的修饰的情况下，修饰具有高效的APTT延长效果，然而，22个以上的修饰的情况下，回收率有时降低。
已知为了将结构变化最小化，与通过单纯地将活性中心丝氨酸变换为脱氢丙氨酸所获得的AHT相比，205A43A凝血酶具有较高的FVIII特异性分钟。
根据以上结果可知205A43A凝血酶衍生物不管有没有羧基修饰都具有较强的APTT延长效果。而且，由于羧基修饰可进一步增加APTT延长效果。依赖于M-凝血酶引发血小板聚集抑制(PAR1活化抑制)的血小板聚集抑制效果虽然与羧基修饰的有无不相干，然而，经过羧基修饰后的非常强。因此，已知205A43A凝血酶主要对以APTT作为中心的血液凝固起较强的作用，而且具有血小板聚集抑制效果，相对于此，羧基修饰205A43A凝血酶不仅仅具有APTT而且具有较强的抗血小板能。被修饰的205A43A凝血酶除了具有M-凝血酶引发血小板聚集抑制(PAR1活化抑制)以外，还具有瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果，然而，没有经过修饰的205A43A凝血酶即使是在高浓度的情况下，也不具有瑞斯托霉素引发血小板聚集。如上所述，可获得具有含有如下面所表示的特征的抗血栓效果的凝血酶衍生物。
羧基修饰205A43A凝血酶APTT延长效果(大)，PAR1抑制(大)，瑞斯托霉素引发血小板聚集(大)205A43A凝血酶APTT延长效果(大)，PAR1抑制(小)，瑞斯托霉素引发血小板聚集(无)并且，使用IAsys的凝血酶基质结合能力比较实验中，作为205A43A凝血酶具有非常高的APTT延长效果的理由，可推测是由于第205号丝氨酸以及第43号组氨酸同时变异的所述凝血酶衍生物，由其变异导致完全丧失基质分解活性，而且与AHT相比具有较高的FVIII结合能力(Fbgn的结合能力相当降低)。如下面的实验例16以及17中所记载的他的氨基酸的置换的组合中，第205号丝氨酸以及第43号组氨酸同时发生变异的凝血酶衍生物具有将延长APTT作为主要效果的较高的抗血栓效果。
(1)B链203甘氨酸置换成丙氨酸B链205丝氨酸置换成甘氨酸B链77赖氨酸置换成谷氨酰胺的凝血酶(77E203A205G凝血酶)的表达通过使用相当于77E203A205G凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码77E203A205G凝血酶基因的碱基序列示于序列号27。
将203A205A99N凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的203A205A99N凝血酶。
(2)77E203A205G凝血酶添加血液的APTT的测定将50μg77E203A205G凝血酶溶解到PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。同样，将PBS添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1的比例，作为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为44秒，77E203A205G凝血酶的APTT为74秒，延长APTT 1.68folds。
因为在实验例中2203A205G凝血酶在相同条件下可延长APTT1.09folds，所以由于第77号赖氨酸置换成谷氨酰胺可增加APTT延长效果1.5folds。
(3)PRP77E203A205G凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，自上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，以77E203A205G凝血酶的最终浓度成为70μg/ml的方式调整浓度，每130μl PRP添加100μl77E203A205G凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化，然而，没有确认到瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制作用。
评价2除了使用1μg/mlM-凝血酶PBS溶液作为引发物质以外，根据评价1的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl PBS，记录透过率的经时变化，然而没有显示M-凝血酶引发血小板聚集抑制作用。
根据上述可知，203A205G凝血酶不具有充分的抗血栓能，然而，77E203A205G凝血酶通过77赖氨酸的置换降低Fbgn结合能力而导致降低大幅APTT延长效果的增加。并且，77E203A205G凝血酶没有显示相对于M-凝血酶以及瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果。
(4)羧基修饰体的APTT试验另外，将1mg/5ml的77E203A205G凝血酶0.5MNaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5M NaCl(pH6.5)下在4℃透析3小时后，在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)使其浓度成为20mg/ml，于25℃下培养1小时对77E203A205G凝血酶的羧基进行修饰。可以在可溶化状态下获得约35％的修饰衍生物。。
将50μg的羧基修饰77E203A205G凝血酶溶解于1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为作为对照，并测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，羧基修饰77E203A205G凝血酶的APTT分别为77.5秒。
(5)凝血酶原时间(PT)的测定将50μg的77E203A205G凝血酶以及羧基修饰77E203A205G凝血酶溶解到1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使各自的容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为作为对照，测定PT。另外，PT试剂使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITH CALSIUM。其结果是，相对于对照的PT为20秒，77E203A205G凝血酶的PT为22秒，羧基修饰77E203A205G凝血酶的PT为23秒，显示出PT的延长效果。
(6)PRP羧基修饰77E203A205G凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，以800rpm转速离心15分钟，自上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，添加修饰77E203A205G凝血酶的最终浓度成为50μg/ml的方式调整浓度，每130μl PRP添加100μl修饰77E203A205G凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化。结果示于图25。
评价2除了使用1μg/ml的M-凝血酶PBS溶液作为引发物质以外，根据评价1的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl PBS，记录透过率的经时变化。结果示于图26。
根据以上结果虽然没有确认到羧基修饰77E203A205G凝血酶与羧基修饰前相比增强了APTT延长效果，但是显示出M-凝血酶引发血小板聚集以及瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果。而且，可以确认由于77的谷氨酰胺的置换，与置换前相比，回收率的显着降低。
(7)77E203A205G凝血酶的Fbgn以及TM的结合特异性的确认将203A205G凝血酶的0.1mg/ml10mM磷酸缓冲(pH7.7)溶液，以及77E203A205G凝血酶的0.1mg/ml10mM磷酸缓冲(pH7.7)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，在25℃搅拌10分钟，通过这样的方式将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得203A205G凝血酶固定化比色管以及77E203A205G凝血酶固定化比色管。在203A205G比色管中约4100arc的蛋白质在77E203A205G比色管中约2000arc的蛋白质被固相化。接着，添加0.2ml 1M乙醇胺(pH8)阻断(blocking)处理。
另外，将两比色管用50mM磷酸缓冲液，2MNaCl，30mM苯甲脒(pH7.4)进行清洗、再生后，在两比色管中添加100μl的500nM的Fbgn溶液(溶解于50mM磷酸缓冲液，0.15MNaCl(pH7.4)中)，3分钟后在203A205G凝血酶固相化比色管中吸附约300弧秒的Fbgn，在77E203A205G凝血酶固相化比色管中约吸附80弧秒的Fbgn。
另外，将两比色管同样地进行清洗、再生后，在两比色管中添加100μl的500nM的FVIII溶液(50mM Tris-盐酸0.15M NaCl10mM CaCl2(pH7.4)溶解)时，3分钟后在203A205G凝血酶固相化比色管中吸附约300弧秒的FVIII，在77E203A205G凝血酶固相化比色管中吸附约300弧秒的FVIII。
另外，将两比色管用50mM磷酸缓冲液、2M NaCl、30mM苯甲脒(pH7.4)溶液清洗、再生后，分别在203A205G凝血酶固定化比色管以及77E203A205G凝血酶固定化比色管中添加100μl的50nM的可溶性TM溶液(CosmoBio公司)(溶解于50mM磷酸缓冲液，0.15MNaCl(pH7.4)中)，3分钟后在203A205G凝血酶固相化比色管中吸附约100弧秒的TM，在77E203A205G凝血酶固相化比色管中吸附约20弧秒的TM。
根据以上结果可知通过在203A205G凝血酶衍生物上添加新的对B链77赖氨酸的谷氨酰胺的置换，相对于比色管上血液凝固第VIII因子吸附，Fbgn吸附量降低约三分之一，TM吸附降低约二分之一。
而且根据IAsys FAST FIT PROGRAM(日制产业公司)解析的结果，对于亚203A205G的Fbgn结合常数为10.8nM，FVIII结合能力为5.07nM，对于77E203A205GFbgn结合能为190nM，FVIII结合能为22.5nM。
可预测，由于所述B链77赖氨酸的置换导致了相对于Fbgn的FVIII特异性的上升，实验例13中记载的77E203A205G凝血酶具有与203A205G凝血酶相比较高的APTT延长能。
(1)B链203甘氨酸置换成丙氨酸B链205丝氨酸置换成丙氨酸B链99天冬氨酸置换成天冬酰胺B链77赖氨酸置换成谷氨酰胺的凝血酶(77E203A205A99N凝血酶)的表达通过使用相当于77E203A205A99N凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码77E203A205A99N凝血酶基因的碱基序列示于序列号29。
将77E203A205A99N凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的77E203A205A99N凝血酶。
(2)77E203A205A99N凝血酶添加血液的APTT的测定将50μg77E203A205A99N凝血酶溶解于PBS中，添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。同样地，将PBS添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1的比例作为对照，并测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为41秒，77E203A205A99N凝血酶的APTT为39秒。由上述可知77E203A205A99N凝血酶不仅具有与水蛭素凝胶的结合能力，而且如果同时具有活性充分降低且Fbgn结合能力降低的变异，不具有充分的抗APTT效果。
B链203甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(203A凝血酶)的表达通过使用相当于203A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码203A凝血酶基因的碱基序列示于序列号31。
将203A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约2mg大致提纯的203A凝血酶。
根据上述方法B对203A凝血酶的凝血酶基质分钟解活性。结果示于图20。FXIII的A链30分钟后可以确认全部分解物，3小时后有半量以上被分解。
另外，上根据述方法C测定203A凝血酶的凝血酶基质分钟解活性进行测定，其结果是3小时后形成血液凝块。
根据以上结果可知203A凝血酶是在非专利文献5中报导为完全失去活性的衍生物，使用本发明中的凝血酶基质的活性测定法，作为抗血栓剂使用的目的，可以确认到明确的凝血酶基质分解活性，难以用作抗血栓剂。
(1)205丝氨酸置换成甘氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(205G43A凝血酶)的表达通过使用相当于205G43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205G43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号33。
将205G43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，按照实验例1的(3)的方法以硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约0.5mg大致提纯的205G43A凝血酶。
(2)205G43A凝血酶的基质分解活性测定按照上述方法A对在(1)中所获得的205G43A凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是培养后的吸光度的增加。
此外，根据上述方法B对205G43A凝血酶的凝血酶基质分解活性进行测定，其结果是没有确认到FXIII的A链活化产物的泳带。已知205G43A凝血酶具有水蛭素C末端肽结合能力而且充分地失去活性。将205G43A凝血酶24μg以及12μg，溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为43秒，205G43A凝血酶的APTT分别为62秒、55秒，分别延长APTT达1.44folds、1.28folds。
25μg/ml的AHT添加的APTT延长效果为1.25folds，24μg/ml的205G43A凝血酶延长APTT1.44folds，由此可显示205G43A凝血酶与AHT相比具有1.15folds以上较高的APTT延长效果。
根据以上结果可知，活性中心的丝氨酸，组氨酸同时被置换的205G43A凝血酶即使是在低浓度的情况下，也可以不进行羧基修饰而表现出较高的APTT延长效果。
(1)205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丝氨酸的凝血酶(205A43S凝血酶)的表达通过使用相当于205A43S凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205A43S凝血酶基因的碱基序列示于序列号35。
将205A43S凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的205A43S凝血酶。
(2)205A43S凝血酶的基质分解活性测定根据上述方法B在(1)中所获得的205A43S凝血酶的基质分解活性进行测定，其结果是没有确认到FXIII的A链活化产物的泳带。已知205A43S凝血酶具有水蛭素C末端肽结合能力而且充分地失去活性。接着将40μg205A43S凝血酶溶解于1mlPBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为42秒，205A43S凝血酶的APTT分别为72秒，延长APTT1.71folds。50μg/ml的AHT的APTT延长效果显示为1.36folds，205A43S凝血酶与AHT相比具有至少1.26folds以上的延长效果。根据以上结果可知，活性中心的丝氨酸、组氨酸同时被置换的205A43S凝血酶可不进行羧基修饰而显示出较高的APTT延长效果。
(3)205A43S凝血酶的Fbgn以及FVIII的结合特异性的比较将205A43S凝血酶衍生物或者AHT的约0.1mg/ml的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶液，添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，在25℃搅拌10分钟，通过这种方式将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得205A43S凝血酶或者AHT固定化比色管。约1200arc的205A43S凝血酶在比色管被固定化。接着添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)阻断处理。在205A43S比色管或者AHT比色管中添加100nM的Fbgn或者FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图17。可以确认相对于图14显示的AHT比色管中Fbgn与FVIII几乎同程度结合，在图17显示的205A43s凝血酶比色管中FVIII比Fbgn具有较多结合。
另外，从结合信号比可以确认FVIII与Fbgn的结合比与AHT相比上升约1.2folds。
而且，如果考虑到与固定化蛋白的对比，至少205A43S凝血酶显示与AHT同等的FVIII结合能力。与为了将结构变化最小化通过单纯地将活性中心丝氨酸变换为脱氢丙氨酸而获得的AHT相比，205A43S凝血酶具有较高的FVIII特异性。
(1)B链77赖氨酸置换成谷氨酰胺205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的代凝血酶(77E205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于77E205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码77E205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号37。
将77E205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的77E205A43A凝血酶。
(2)将50μg以及25μg的77E205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，77E205A43A凝血酶的APTT分别92秒(50μg)、85秒(25μg)，分别延长2.04folds、1.89folds。在实施例12中，50μg/ml的205A43A凝血酶通过具有1.7folds的APTT延长效果的将B链77赖氨酸的置换成谷氨酰胺的置换，与置换前相比，APTT延长效果上升1.2folds。
(3)使用PRP的77E205A43A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，自上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，使77E205A43A凝血酶的最终浓度成为100μg/ml之方式进行调整浓度，每130μl PRP添加100μl77E205A43A凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBs溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中，添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化，但是，显示出与对照同样的活化曲线，没有显示抑制作用。
评价2除了使用1μg/mlM-凝血酶PBS溶液作为引发物质以外，按照评价1的方法实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl PBS，记录透过率的经时变化。结果示于图27。
根据以上结果可知，77E205A43A凝血酶通过将77赖氨酸变化为谷氨酰胺，Fbgn结合能力特异性地降低，原先比通过第205号丝氨酸以及第43号组氨酸同时变异，而提高FVIII结合能力并且具有较强的APTT抑制效果的205A43A凝血酶，显示出更强的APTT抑制效果。并且，77E205A43A凝血酶虽然没有显示出瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制能，但是显示出M-凝血酶引发血小板聚集抑制效果。
(4)羧基修饰体的APTT试验另外，将1mg/5ml的77E205A43A凝血酶0.5MNaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5MNaCl(pH6.5)在4℃透析3小时后，在其中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)使其浓度成为20mg/ml，在25℃培养1小时对77E205A43A凝血酶的羧基进行修饰。可以在可溶化状态下获得约40％的修饰衍生物。将50μg以及25μg的77E205A43A凝血酶溶解于1mlPBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，77E205A43A凝血酶的APTT分别119秒(50μg)、89秒(25μg)。
(5)PRP羧基修饰77E205A43A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，从上清液中获得2mlPRP。另外，在2800rpm离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，使修饰77E205A43A凝血酶的最终浓度成为30μg/ml调整浓度，每130μlPRP添加100μl羧基修饰77E205A43A凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15M NaCl，pH7.4，记录透过率的经时变化。结果示于图28。
评价2除了使用1μg/mlM-凝血酶PBS溶液作为引发物质以外，根据评价1的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl PBS，记录透过率的经时变化。结果是羧基修饰77E205A43A凝血酶在最终浓度30μl/ml下完全抑制M-凝血酶引发血小板聚集。
根据以上的结果，77E205A43A凝血酶通过修饰增加延长APTT能。而且，显示出M-凝血酶引发血小板聚集以及瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果。然而，77E203A205G凝血酶的羧基修饰体和77E205A43A凝血酶修饰成分与由于B链77的谷氨酰胺的置换生成的205A43A凝血酶的修饰体相比，修饰成分的回收率有较大降低。
(1)B链24谷氨酰胺置换成谷氨酰胺205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(24E205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于24E205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码24E205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号39。
将24E205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中确认到一定程度泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到大部分的凝血酶泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法，通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯后，重组凝血酶含溶出溶液50mM NaHCO3pH8透析，应用50mM NaHCO3pH8平衡化的HITRAP苯甲脒柱5ml(Farumashia公司)。用50mM NaHCO30.3MNaCl pH8充分清洗后，再用50mM NaHCO30.3M NaCl 0.1M苯甲脒pH8进行溶出。在SDS-PAGE上获得约1mg大致提纯的24E205A43A凝血酶。
将50μg的羧基修饰24E205A43A凝血酶溶解于1mlPBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为作为对照，并测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为42秒，羧基修饰24E205A43A凝血酶的APTT分别为62秒。
(2)24E205A43A凝血酶以及AHT的Fbgn以及FVIII的结合特异性的比较将24E205A43A凝血酶以及AHT的0.1mg/ml10mM磷酸缓冲液(pH7.4)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业杜)中，在25℃搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得24E205A43A凝血酶以及AHT固定化比色管。(分别为1380arc、2400arc固相化)接着添加0.2ml 1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。
在24E205A43A凝血酶的比色管以及AHT的比色管中分别添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图18以及图14。
从图18可以确认，在24E205A43A凝血酶比色管中，FVIII比Fbgn有较多的结合。可以确认24E205A43A具有较高的FVIII特异性。
(3)205A43A凝血酶以及24E205A43A凝血酶的TM结合能力的比较在205A43A凝血酶以及24E205A43A凝血酶固定化比色管中，按顺序加入16.7nM、50nM的TM。
结合曲线示于图19中。此外，205A43A凝血酶固定化约980arc，24E205A43A凝血酶固定化约1380arc的凝血酶衍生物。
根据以上的结果，24E205A43A凝血酶是相对于Fbgn的FVIII特异性较高的衍生物，具有APTT延长效果。另外，由于TM结合能力业有较大的降低，所以在投予生态的情况下，所述凝血酶变异体不会因生体内的凝血而导致抑制蛋白质C的活化。
205丝氨酸置换成丙氨酸99天冬氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(205A99A凝血酶)的表达通过使用相当于205A99A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码205A99A凝血酶基因的碱基序列示于序列号41。
将205A99A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法进行ecarin活化时，不会因为ecarin而使A、B链切断。
根据所述结果，在前凝血酶的形式通过CHO细胞表现的205A99A凝血酶本实验中，无法获得2根链中被活化的205A99A凝血酶。
羧基修饰AHT以及羧基修饰203A205G凝血酶，以及205A43A凝血酶的APTT的比较将溶解于PBS的50g/ml的羧基修饰AHT、羧基修饰203A205G凝血酶、205A43A凝血酶按照以下的两个方法测定APTT。作为对照，仅添加PBS按照下面的方法a、b测定APTT。此外，羧基修饰AHT为了极力防止残存活性的影响，在合成后，再次添加2mg/ml APMSF试剂(Sigma公司)进行非活化，此外，然后通过PBS进行充分透析，除去残存的APMSF试剂。
方法a在标准血浆100μl中，添加APTT试剂50μl在37℃培养5分钟，将100μl溶解于PBS中的各样品添加到刚才的溶液中，另外，迅速添加12μl的0.1M CaCl2，测定从添加钙到凝固所需的时间。
方法b在100μl标准血浆中添加100μl溶解于PBS中的各样品以及50μl APTT试剂，在37℃培养5分钟后，添加22μl的0.1MCaCl2，测定从添加钙到凝固所需的时间。
结果如下。
对照 方法a 43秒 方法b 45秒羧基修饰AHT方法a 105秒 方法b 66秒羧基修饰203A205G凝血酶 方法a75秒 方法b80秒205A43A凝血酶方法a67秒 方法b77秒羧基修饰205A43A凝血酶 方法a145秒方法b170秒从以上所述可知，羧基修饰AHT可通过方法a较好延长APTT，而羧基修饰203A205G凝血酶、205A43A凝血酶可通过方法b较好延长APTT。而且在同一条件下，羧基修饰203A205G凝血酶比205A43A凝血酶具有更高的APTT延长效果。
方法a中，标准血浆和各凝血酶衍生物混合物的培养时间，而方法b中，标准血浆和各凝血酶衍生物混合物在37℃培养5分钟。一般认为，作为对羧基修饰AHT而言，方法bAPTT延长效果较小的理由是从凝血酶通过化学合成而获得的AHT中，不可避免存在极微量的残存凝血酶，极少的凝血酶通过与标准血浆在37℃进行培养，微量的血液凝固因子(尤其是FVIII)发生活化，从而抑制APTT延长效果。在另一方面，羧基修饰203A205G凝血酶、205A43A凝血酶是可通过基因重组技术完全失去活性的凝血酶衍生物，即使是在和标准血浆一起培养的情况下，也不会发生血液凝固因子的活化，相反地，进行培养的物质被平衡化，较好地反应出基质特异性，从而显着地延长APTT。
根据以上的研究，与使用混入极微量的凝血酶的AHT相比，作为抗血栓剂，凝血酶衍生物以及其羧基修饰凝血酶衍生物在基因工程学上非活化，而且，具有均一的功能。因此，可预想本发明的凝血酶衍生物以及其羧基修饰凝血酶衍生物显示出稳定和较高的药效。
(1)B链77赖氨酸置换成丙氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(77A205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于77A205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码77A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号43。
将77A205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽管柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的77A205A43A凝血酶。
然后，根据方法F测定与肝素凝胶的结合能力时，在与野生型人的凝血酶同等的溶出位置(A50％)上溶出。可以确认在活性中心以及ExociteI上的氨基酸虽然被置换了，但也能保持肝素结合能力。
(2)将50μg以及25μg的77A205A43A凝血酶溶解于lml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，77A205A43A凝血酶的APTT分别90.5秒、85秒，分别延长2.01folds、1.89folds。在实施例12中，因为50μg/ml的205A43A凝血酶具有1.7folds的APTT延长效果，所以通过将B链77赖氨酸的置换成谷氨酰胺可增强APTT延长效果1.2folds。
(3)羧基修饰体的APTT试验另外，将1mg/5ml的77A205A43A凝血酶/50mM磷酸缓冲液0.5MNaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5MNaCl(pH6.5)中在4℃透析3小时后，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，和光纯药)到其中，使其浓度成为20mg/ml，于25℃下培养1小时对205A凝血酶的羧基进行修饰。可以在可溶化状态下获得约80％的修饰衍生物。将50μg羧基修饰77A205A43A凝血酶溶解到1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中，使其容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为42秒，羧基修饰205A凝血酶的APTT为79秒。
将50μg以及25μg的77A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，77A205A43A凝血酶的APTT分别144、109秒。
(4)凝血酶原时间(PT)的测定将50μg 77A205A43A凝血酶以及羧基修饰77A205A43A凝血酶溶解到1ml的PBS中，并分别将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定PT。另外，PT试剂使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITH CALSIUM，其结果是，相对于对照的PT为21秒，205A凝血酶的PT为24秒，羧基修饰77A205A43A凝血酶的PT为25秒，其中任何一个均没有显示出PT的延长效果。
根据以上结果可知，通过将B链77赖氨酸置换成丙氨酸，与置换前相比，具有较高的APTT延长效果。而且，即使是在修饰体中，也可以通过将77赖氨酸置换成丙氨酸而增强APTT延长效果。而且，与将B链77置换成谷氨酰胺的情况相比没有确认到修饰的情况下有较大的回收率的降低，所述情况显示出在B链77中丙氨酸的修饰的适性较高。
(1)B链65赖氨酸置换成丙氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(65A205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于65A205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码65A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号45。
将65A205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的65A205A43A凝血酶。
(2)将50μg以及25μg的65A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为42秒，65A205A43A凝血酶的APTT分别93秒、86秒，分别延长2.21folds、2.05folds。在实施例12中，50μg/ml的205A43A凝血酶通过具有1.7folds的APTT延长效果的将B链65赖氨酸的置换成丙氨酸的置换可增强APTT延长效果1.3folds。
(3)羧基修饰体的APTT试验另外，将1mg/5ml的65A205A43A凝血酶0.5MNaCl(pH6.5)在0.25M甘氨酸乙酯0.5MNaCl(pH6.5)中在4℃透析3小时后，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光纯药)到其中，使其浓度成为20mg/ml，在25℃培养1小时对65A205A43凝血酶的羧基进行修饰。
将50μg以及25μg的65A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将100μl所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为41秒，65A205A43A凝血酶的APTT分别118秒、88秒。
(4)凝血酶原时间(PT)的测定将50μg 65A205A43A凝血酶以及羧基修饰65A205A43A凝血酶溶解到1ml的PBS中，并分别将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，测定PT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定PT。另外，PT试剂使用SIGMA公司的THROMBOPLASTIN WITH CALSIUM，其结果是，相对于对照的PT为23秒，205A凝血酶的PT为22秒，羧基修饰65A205A43A凝血酶的PT为25秒，其中任何一个均没有显示出PT的延长效果。
(5)PRP65A205A43A凝血酶的抗血小板效果的评价评价1通过将10ml采血后立即添加柠檬酸的全血，在800rpm离心15分钟，从上清液中获得2ml的PRP。另外，以2800rpm转速离心分离10分钟获得PPP。在添加100μl的情况下，使65A205A43A凝血酶的最终浓度成为100μg/ml调整浓度，每130μl的PRP添加100μl 65A205A43A凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的5mM磷酸缓冲液0.15MNaCl，pH7.4，进行血小板聚集抑制实验，但是对照与65A205A43A凝血酶没有差异。
评价2除了使用1μg/ml M-凝血酶PBS溶液作为引发物质，使65A205A43A凝血酶的最终浓度成为100、50、25、10μg/ml的方式进行添加以外，按照评价1的方法进行实验。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl的PBS，记录透过率的经时变化。结果示于图29、30、31。
评价3添加100μl的1μg/ml M-凝血酶PBS溶液作为引发物质的情况下，以65A205A43A凝血酶的最终浓度分别成为36、18、9、4、5μg/ml的方式调整浓度，添加65A205A43A凝血酶的PBS溶液，根据评价1的方法进行实验。结果示于图32、33、34。
评价4以修饰65A205A43A凝血酶的最终浓度成为36μg/ml的方式调整浓度，每130μl的PRP添加100μl 65A205A43A凝血酶的PBS溶液，添加35μl的5mg/ml瑞斯托霉素PBS溶液作为引发物质。作为对照，在130μl的PRP中添加100μl PBS，记录透过率的经时变化。结果示于图35。
根据以上结果可知，65A205A43A与205A43A相比具有较高的APTT延长效果，而且在更低浓度显示出较强的M-凝血酶引发血小板聚集抑制效果。而且修饰65A205A43A凝血酶不仅仅显示出瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果，而且，与其他的衍生物相比，显示出更高水平的凝血酶受体活化抑制效果。
(6)65A205A43A凝血酶以及205A43A凝血酶的与Fbgn以及FVIII的结合特异性的比较通过将65A205A43A凝血酶以及205A43A凝血酶的约0.1mg/ml的浓度的10mM磷酸缓冲液(pH7.7)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，在25℃搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得65A205A43A凝血酶固定化比色管。(约1800arc固相化)，接着添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。在65A205A43A凝血酶比色管中分别添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图36。从图36中可知，与205A43A相比，65A205A43A比色管中，通过降低Fbgn结合能力，提高FVIII的特异性。
可以确认FVIII、Fbgn结合能力的比与B链65赖氨酸的置换前相比提高了2.8folds。
(7)205A43A凝血酶以及65A205A43A凝血酶的与TM结合能力的比较在205A43A凝血酶以及24E205A43A凝血酶固定化比色管中，按顺序加入16.7nM、50nM的TM。
结合曲线示于图37中。此外，65A205A43A凝血酶固定化约1800arc。
根据以上的结果，与在图19中所记载的205A43A凝血酶的TM结合能力相比较的情况下，如果按固定化蛋白量的相当比率进行换算，则65A205A43A与B链65赖氨酸被置换前相比降低约30％TM结合能力。通过降低TM结合能力投予生态时，65A205A43A凝血酶变异体降低通过生体内的凝血酶引起的蛋白质C活化的抑制(抑制)。
(1)B链205丝氨酸甘氨酸的凝血酶(以下称为205G凝血酶)的表达通过使用相当于205G凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。
将205G凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约5mg大致提纯的205T凝血酶。
(2)205G凝血酶的基质分解活性测定根据上述方法B对凝血酶的凝血酶基质分解活性的结果示于图42。泳道7表示培养3小时后的样品。可以确认分解约50％的FXIII的泳带。根据以上可知，205G凝血酶虽然可以作为抗血栓剂使用，但是残存有成了问题的活性。
(1)B链197精氨酸置换成丙氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(197A205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于197A205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码197A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号47。
将197A205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，再直接通过的部分中没有确认到泳带存在，而在溶出峰中可以确认到与凝血酶相同的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法以硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的77A205A43A凝血酶。
(2)将50μg以及25μg的197A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为43.5秒，197A205A43A凝血酶的APTT分别为77.5秒、65秒。
根据以上的结果，197A205A43A与197精氨酸的置换前相比显示出一定程度较强的APTT延长效果。而且，一般认为，197精氨酸的置换的原因是RGDA序列的细胞增殖活性丧失。
(1)B链77赖氨酸置换成丝氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(77S205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于77S205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码77S205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号49。
将77S205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法以硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约2.5mg大致提纯的77S205A43A凝血酶。
(2)将50μg 77A205A43A凝血酶溶解于1ml的PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为48秒，77S205A43A凝血酶的APTT分别86秒。
(1)B链65赖氨酸丙氨酸B链77赖氨酸丙氨酸205丝氨酸丙氨酸43组氨酸丙氨酸的凝血酶(65A77A205A43A凝血酶)的表达通过使用相当于65A77A205A43A凝血酶的DNA的变异导入引物的PCR法合成所述凝血酶。编码65A77A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号51。然后，根据实验例1的(1)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的65A77A205A43A凝血酶。
(2)将50μg、25μg以及12.5μg 65A77A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为49秒，65A77A205A43A凝血酶的APTT分别145.5秒、112.5秒、86.5秒，分别延长2.3folds、1.77folds。在实施例12中，50μg/ml的205A43A凝血酶通过具有1.7folds的APTT延长效果的将65赖氨酸置换成丙氨酸，将B链77赖氨酸置换成丙氨酸的置换，可增强APTT延长效果1.35folds。
可以确认通过B链第65及第77号氨基酸的置换的相乘效果，65A77A205A43A凝血酶具有非常高的APTT延长效果。

(1)B链65赖氨酸置换成丙氨酸B链245精氨酸置换成丙氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(65A245A205A43A凝血酶)的表达将65A245A205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。
编码65A245A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号53。
根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约2mg大致提纯的65A245A205A43A凝血酶。
然后，根据方法F确认肝素结合能力的时候，以A35％溶出。一般认为人野生型凝血酶的35％中肝素亲和性降低。所述肝素亲和性的降低的原因是肝素结合区域Exocite II上的氨基酸245精氨酸的置换。
(2)将50μg以及25μg的65A245A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为41秒，65A245A205A43A凝血酶的APTT分别65秒、60秒。
以上结果显示，65A245A205A43A凝血酶具有APTT延长效果而且通过Exocite II上的氨基酸的置换，肝素亲和性与人野生型凝血酶相比下降。
(1)B链65赖氨酸置换成丙氨酸B链248赖氨酸置换成丙氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(65A248A205A43A凝血酶)的表达将65A248A205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。
编码65A248A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号55。
然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约2mg大致提纯的65A248A205A43A凝血酶。
然后，根据方法F确认肝素结合能力的时，以A35％溶出。一般认为人野生型凝血酶的35％中肝素亲和性降低。所述肝素亲和性的降低的原因是肝素结合区域Exocite II上的氨基酸248精氨酸的置换。
(2)将50μg以及25μg的65A248A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液加入标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂是使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为45秒，65A248A205A43A凝血酶的APTT分别83秒、71秒。
以上结果显示，即使是65A248A205A43A凝血酶，与65A245A205A43A凝血酶同样具有APTT延长效果而且通过Exocite II上的氨基酸的置换，肝素亲和性与人野生型凝血酶相比降低。
将200μl采血后立即添加柠檬酸的全血装入玻璃管中，分别添加20μl的溶解于PBS的205A43A凝血酶、M-205A43A凝血酶、M-65A205A43A凝血酶溶液(100μg/ml)以及PBS。在各凝血酶衍生物添加血液中添加30μl的0.1MCaCl2。
添加钙后，每30秒钟确认流动性，测定失去流动性的时间(凝固时间)，其结果如下PBS 4分30秒205A43A凝血酶7分钟M-205A43A凝血酶 8分30秒M-65A205A43A凝血酶溶液 8分30秒全血205A43A凝血酶、M-205A43A凝血酶、M-65A205A43A凝血酶显示出较高的抗凝固能。
(1)B链19苯基丙氨酸置换成丙氨酸205丝氨酸置换成丙氨酸43组氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(19A205A43A凝血酶)的表达将19A205A43A凝血酶用实验例1的(1)的方法进行表达。编码19A205A43A凝血酶基因的碱基序列示于序列号57。根据实验例1的(2)的方法确认水蛭素C末端肽结合能力时，直接通过的馏分中没有确认到泳带的存在，而在溶出峰中可以确认到凝血酶同样的泳带。然后，根据实验例1的(3)的方法通过硫酸化cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行提纯。在SDS-PAGE上获得约3mg大致提纯的19A205A43A凝血酶。
(2)将50μg以及25μg的19A205A43A凝血酶溶解于1ml PBS中，将所述溶液添加到标准血浆(国际试剂公司)中使容量比成为1∶1，并测定APTT。将PBS与标准血浆(国际试剂公司)以成为1∶1的方式进行添加，以此为对照测定APTT。另外，APTT试剂使用国际试剂公司的试剂。其结果是，相对于对照的APTT为46.5秒，19A205A43A凝血酶的APTT分别83.5秒、79秒。
通过将19苯基丙氨酸置换成丙氨酸，与置换前相比，APTT延长效果显示出一定程度的提高。
(3)19A205A43A凝血酶的与Fbgn以及FVIII的结合特异性的比较通过将19A205A43A凝血酶的约0.1mg/ml的浓度的10mM磷酸缓冲液(pH7.7)溶液，分别添加到NHS活化CM葡聚糖比色管(日制产业公司)中，于25℃下搅拌10分钟，将被验样品(凝血酶衍生物)固定在NHS活化CM葡聚糖比色管中，获得19A205A43A凝血酶固定化比色管。(约1000arc固相化)，接着添加0.2ml的1M乙醇胺(pH8)进行阻断处理。19A205A43A凝血酶比色管中分别添加100nM的Fbgn以及FVIII，记录各自的结合曲线。结果示于图47。可以确认，与205A43A凝血酶相比，19A205A43A比色管中，通过降低Fbgn结合能力，提高FVIII的特异性。
本发明的凝血酶衍生物与以往的凝血酶衍生物相比，可以用更少的使用量获得稳定的抗血栓效果。所述效果可根据例如如实施例中所表示的血浆的APTT测定、全血凝固时间的测定以及血小板聚集能抑制效果加以确认。本发明中所谓抗血栓效果是指结合抗血小板、抗血液凝固的1次止血、2次止血的整体上的抗血栓作用。本发明的具有抗血小板效果以及抗血液凝固效果的凝血酶衍生物，例如在1次止血中，主要是通过作用在以GPIbα(血小板受体糖蛋白质Ibα)以及以PAR1为代表的凝血酶上，来抑制对血小板的羧基修饰凝血酶(称为“M-凝血酶”)、瑞斯托霉素以及剪切应力等的刺激，抑制血小板聚集以及粘着，在2次止血中，主要是抑制FVIII的活化，从而特异性地延长APTT。
并且，通过进行活性中心氨基酸以及其他氨基酸的置换，可以获得具有较高的APTT延长效果以及抗血小板效果较低类型的凝血酶衍生物；以及具有较高的APTT延长效果以及较高的抗血小效果(但PAR1抑制效果仅)类型的凝血酶衍生物等，效果的表达实施例不同的凝血酶衍生物。所述活性中心氨基酸以及那些以外的氨基酸被置换的本发明的凝血酶衍生物，通过在生体内所产生的TM上的凝血酶抑制蛋白质C的活化。
另外，如果修饰本发明的凝血酶衍生物的羧基，则不仅只可以延长APTT，而且依赖于氨基酸的置换也可以附加、控制抗血小板效果，尤其是PAR1活化以及瑞斯托霉素引发血小板聚集抑制效果，并且可获得适应各种血栓症的具有抗血液凝固效果以及抗血小板效果的凝血酶衍生物。
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SEQUENCE LISTINGctg aag gag acg tgg aca gcc aac gtt ggt aag ggg cag ccc agt gtc624Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val195 200 205ctg cag gtg gtg aac ctg ccc att gtg gag cgg ccg gtc tgc aag gac672Leu Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp210 215 220tcc acc cgg atc cgc atc act gac aac atg ttc tgt gct ggt tac aag720Ser Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys225 230 235 240cct gat gaa ggg aaa cga ggg gat gcc tgt gaa ggt gac agt ggg gga768Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly245 250 255ccc ttt gtc atg aag agc ccc ttt aac aac cgc tgg tat caa atg ggc816Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly260 265 270atc gtc tca tgg ggt gaa ggc tgt gac cgg gat ggg aaa tat ggc ttc864Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe275 280 285tac aca cat gtg ttc cgc ctg aag aag tgg ata cag aag gtc att gat912Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp290 295 300cag ttt gga gag tag927Gln Phe Gly Glu305<210>2<211>308<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Thr Ala Thr Ser Glu Tyr Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly1 5 10 15Ser Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser20 25 30Leu Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly35 40 45Arg Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln50 55 60Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser65 70 75 80Leu Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr85 90 95Pro Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile100 105 110Gly Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser115 120 125Met Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn130 135 140Leu Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe145 150 155 160Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala165 170 175Ser Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn180 185 190Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val195 200 205Leu Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp210 215 220Ser Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys225 230 235 240Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly245 250 255Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly260 265 270Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe275 280 285Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp290 295 300Gln Phe Gly Glu305<210>3<211>12<212>PRT
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SEQUENCE LISTINGPro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala210 215 220gga tac aag ggg cgg gtg aca ggc tgg ggc aac ctg aag gag acg tgg720Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp225 230 235 240aca gcc aac gtt ggt aag ggg cag ccc agt gtc ctg cag gtg gtg aac768Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn245 250 255ctg ccc att gtg gag cgg ccg gtc tgc aag gac tcc acc cgg atc cgc816Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg260 265 270atc act gac aac atg ttc tgt gct ggt tac aag cct gat gaa ggg aaa864Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys275 280 285cga ggg gat gcc tgt gaa ggt gac agt ggg gga ccc ttt gtc atg aag912Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys290 295 300agc ccc ttt aac aac cgc tgg tat caa atg ggc atc gtc tca tgg ggt960Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly305 310 315 320gaa ggc tgt gac cgg gat ggg aaa tat ggc ttc tac aca cat gtg ttc1008Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe325 330 335cgc ctg aag aag tgg ata cag aag gtc att gat cag ttt gga gag tag1056Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu340 345 350<210>6<211>351<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala1 5 10 15Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln20 25 30Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Thr Ala Thr Ser Glu35 40 45Tyr Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp50 55 60Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr65 70 75 80Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly85 90 95Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg100 105 110Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg115 120 125Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys130 135 140Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg145 150 155 160Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile165 170 175Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile180 185 190Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His195 200 205Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala210 215 220Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp225 230 235 240Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn245 250 255Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg260 265 270Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys275 280 285Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys290 295 300Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly305 310 315 320Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe325 330 335
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权利要求
1.一种凝血酶衍生物，包括A链及B链，其特征在于所述B链具有将从凝血酶B链的氨基酸序列中的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的一种或一种以上活性中心氨基酸进行置换的氨基酸序列，且其中(1)当所述凝血酶衍生物与凝血酶基质在含有0.1M的NaCl的pH 7.4的50mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸中在37℃下反应3小时，被所述凝血酶衍生物分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下。，且(2)所述凝血酶衍生物保持Exocite I的结构。
2.一种凝血酶衍生物，包括A链及B链，其特征在于所述B链具有将从凝血酶B链的氨基酸序列中的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的一种或一种以上活性中心置换的氨基酸氨基酸序列，其中(1)当所述凝血酶衍生物与凝血酶基质在含有0.1M的NaCl的pH 7.4的50mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸中在37℃下反应3小时，被所述凝血酶衍生物分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下。，且(2)所述凝血酶衍生物保持与水蛭素C末端肽固定化凝胶的结合能力。
3.根据权利要求2所述的凝血酶衍生物，进一步保持与肝素的结合能力。
4.根据权利要求1或2所述的凝血酶衍生物，其中所述凝血酶基质是血液凝固第XIII因子。
5.根据权利要求1或2所述的凝血酶衍生物，其特征在于凝血酶基质是纤维蛋白原。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述活性中心氨基酸的置换是从凝血酶B链的第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的两种或两种以上氨基酸的置换。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述活性中心氨基酸的置换包括第205号丝氨酸的置换。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述活性中心氨基酸的置换包含第205号丝氨酸及第43号组氨酸的置换。
9.根据权利要求8所述的凝血酶衍生物，其特征在于将第43号组氨酸置换成丙氨酸或者丝氨酸。
10.根据权利要求6至9中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于将第205号丝氨酸置换成丙氨酸、苏氨酸、或甘氨酸。
11.根据权利要求6至9中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于将第205号丝氨酸置换成丙氨酸。
12.根据权利要求8所述的凝血酶衍生物，其特征在于将第205号丝氨酸及第43号组氨酸置换成丙氨酸。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力是去水凝血酶的10％以上。
14.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力是去水凝血酶的80％以上。
15.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力的比是去水凝血酶的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力的比的1.1folds以上。
16.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力的比是去水凝血酶的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力的比1.2folds以上。
17.根据权利要求1至12中任一项所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的活化部分促凝血酶原激酶时间是去水凝血酶的1.1folds以上。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的凝血酶衍生物，其特征在于由于所述活性中心氨基酸的氨基酸置换，导致所述凝血酶衍生物的纤维蛋白原结合能力降低10％以上，活化部分促凝血酶原激酶时间延长至1.1folds以上。
19.一种凝血酶衍生物，包括A链及B链，其特征在于所述B链含有将凝血酶B链的氨基酸序列中的第205号丝氨酸、及第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸及第43号组氨酸中选择的一种或一种以上氨基酸置换的氨基酸序列。
20.一种凝血酶衍生物，包括A链及B链，其特征在于所述B链含有将凝血酶B链的氨基酸序列中的第205号丝氨酸及第43号组氨酸置换的氨基酸序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述B链含有将除活性中心氨基酸以外的氨基酸进一步置换的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的凝血酶衍生物，其特征在于除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸是凝血酶的Exocite I区域的氨基酸。
23.根据权利要求22所述的凝血酶衍生物，其特征在于凝血酶的所述Exocite I区域的氨基酸是碱性氨基酸。
24.根据权利要求22所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶的所述Exocite I区域的氨基酸是从所述凝血酶B链的第24号谷氨酰胺、第65号赖氨酸、及第77号赖氨酸中选择的一种或一种以上氨基酸。
25.根据权利要求21至24中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力的比是除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能的比的1.1folds以上。
26.根据权利要求21至24中任一项所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力的比是除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与纤维蛋白原结合能力之比的1.5folds以上。
27.根据权利要求21至24中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物具有活化部分促凝血酶原激酶时间延长效果、抑制凝血酶受体活化的效果、与抑制瑞斯托霉素引起血小板聚集的效果中的任一种效果，而且与将除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物相比，所述凝血酶衍生物具有降低的血栓调节蛋白结合能力。
28.根据权利要求21至24中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物具有活化部分促凝血酶原激酶时间延长效果、抑制凝血酶受体活化的效果、抑制瑞斯托霉素引起血小板聚集的效果中的任一种效果，而且与将除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物相比，所述凝血酶衍生物具有降低10％以上的血栓调节蛋白结合能力。
29.根据权利要求21至24中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与血栓调节蛋白结合能力之比是将除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与血栓调节蛋白结合能力之比的1.1folds以上。
30.根据权利要求21至24中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与血栓调节蛋白结合能力之比是将除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸置换以前的凝血酶衍生物的血液凝固第VIII因子结合能力与血栓调节蛋白结合能力之比的.5folds以上。
31.根据权利要求21所述的凝血酶衍生物，其特征在于除所述活性中心氨基酸以外的氨基酸是凝血酶的Exocite II区域的氨基酸，且当所述凝血酶的所述Exocite II区域的氨基酸的肝素结合能力下降，所述凝血酶的所述Exocite II区域的氨基酸保持抗血栓能力。
32.根据权利要求31所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶的所述Exocite II区域的氨基酸是从所述凝血酶B链的第98号精氨酸、第245号精氨酸、第248号赖氨酸、及第252号赖氨酸中选择的一种或一种以上氨基酸。
33.根据权利要求31或32所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的肝素结合能力是将除所述活性中心以外的氨基酸置换前的凝血酶的肝素结合能力的90％以下。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的凝血酶衍生物，其特征在于从活化部分促凝血酶原激酶时间延长效果、抑制修饰凝血酶引起血小板聚集的效果、抑制瑞斯托霉素引起血小板聚集的效果中选择的一种或一种以上的抗血栓效果被提高。
35.根据权利要求21至33中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的活化部分促凝血酶原激酶时间是去水凝血酶的活化部分促凝血酶原激酶时间的1.1folds以上。
36.根据权利要求31或32所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物的活化部分促凝血酶原激酶时间是将除所述活性中心以外的氨基酸置换前的凝血酶的活化部分促凝血酶原激酶的1.5folds以上，而且所述凝血酶衍生物的血栓调节蛋白结合能力降低为将除所述活性中心以外的氨基酸置换前的凝血酶的血栓调节蛋白结合能力的50％以下。
37.根据权利要求1至36中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶B链的氨基酸序列为人野生型凝血酶B链的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述人野生型凝血酶B链的氨基酸序列是序列号2的第50～308位的氨基酸序列。
39.根据权利要求1至38中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于将所述凝血酶衍生物的羧基加以修饰。
40.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于以氨基酸的酯将所述羧基加以修饰。
41.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于以聚乙二醇将所述羧基加以修饰。
42.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于以具有氨基的聚乙二醇将所述羧基加以修饰。
43.根据权利要求41或42所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述聚乙二醇是分子量1000以下的聚乙二醇。
44.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于以碳酰二亚胺将所述羧基加以修饰。
45.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于将每个分子中至少3处以上的所述羧基加以修饰。
46.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于将每个分子中25处以下的所述羧基加以修饰。
47.根据权利要求39所述的凝血酶衍生物，其特征在于将至少所述B链第25号谷氨酰胺的所述羧基加以修饰。
48.根据权利要求1至47中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于所述凝血酶衍生物具有抑制PAR1活化的效果及/或抑制瑞斯托霉素引起血小板聚集的效果。
49.一种DNA，其特征在于将根据权利要求1至38中任一权利要求所述的凝血酶衍生物编码。
50.一种医药组合物，其特征在于含有根据权利要求1至48中任一权利要求所述的凝血酶衍生物。
51.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物是抗血栓剂。
52.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物是抗炎症剂。
53.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物是血小板聚集抑制剂。
54.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物是血小板粘着抑制剂。
55.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物是内因类血液凝固抑制剂。
56.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物是凝血酶受体活化抑制剂。
57.根据权利要求50所述的医药组合物，其特征在于所述医药组合物兼具抗血液凝固作用及抗血小板作用。
全文摘要
本发明提供一种凝血酶衍生物，其包括A链及B链，所述B链具有从凝血酶B链的氨基酸序列中第205号丝氨酸、第203号甘氨酸、第99号天冬氨酸、以及第43号组氨酸中选择的一种或一种以上活性中心氨基酸被置换的氨基酸序列，其特征在于(1)在含有0.1M的NaCl、pH7.4的50mM三羟甲基氨基甲烷－盐酸中，凝血酶基质与在37℃下反应3小时时被所述凝血酶衍生物分解的所述凝血酶基质的比例为10％以下；(2)保持有ExociteI的结构。
文档编号A61K38/00GK1934252SQ20058000887
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月22日 优先权日2004年3月19日
发明者细川和也, 鹿岛甲介 申请人:智索株式会社, 藤森工业株式会社