专利名称：双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药与酶工程领域，具体地说是采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶联合制备分子量可控的药用右旋糖酐的工艺。
背景技术：
右旋糖酐(Dextran)是若干葡聚糖脱水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1，6糖苷键连接而成，由肠膜状明串菌株(Leuconstoc mesenteriodes)产生的右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase ；E. C. 2. 4. I. 5)合成的右旋糖酐含有95%的α -I, 6糖苷键，同时含有少量其它糖苷键的分支结构。因其具有安全、无毒等多种优点，已被广泛应用于医药、工业、食品等多个领域。高分子右旋糖酐可以被用来作为药物载体，以及常用的凝胶色谱填料。临床上常用的有中分子右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。重均分子量6-8 kDa的右旋糖酐常被用于制成右旋糖酐铁，用于治疗严重的贫血症。重均分子量低于5 kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用于抗血栓。小分子右旋糖酐I (Dextran I, Mw 1000 Da)近来被发现,可以避免由于右旋糖酐70及40而引起的人体自身免疫的变态反应。分子量更小的低聚异麦芽糖则被用于益生
J Li ο目前国内多采用发酵方法制备高分子右旋糖酐，再利用盐酸水解得到不同分子量的药用右旋糖酐，由于生产的右旋糖酐含有大量的氯化物严重影响了右旋糖酐的质量和品质，在临床使用过程中常出现过敏反应，可引起皮肤反应、严重的呼吸和循环衰竭，甚至导致死亡。同时由于是酸催化水解，水解过程无序，得到的产品分子量分布不集中，影响产品的质量。另外，由于利用盐酸水解需要高温高酸等恶劣条件，不利于环保、低碳。而采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶酶法制备药用级右旋糖酐，就能减少氯化物对产品质量的影响，同时由于酶对底物的特异性水解，能得到分子量分布集中的高品质右旋糖酐，产品达到高产率。此外，酶催化降解反应条件温和、能耗低，从而实现了中、小分子量多糖生产工艺的绿色、环保、低碳的目标。目前国外已有学者直接采用分别产右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的菌株发酵制备药用右旋糖酐，但是由于直接发酵，菌株产生的代谢物种类繁杂，不利于产品的分离纯化，同时由于产率低，不利于产业化生产。另外也有学者采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶双酶联合制备药用糖酐，但是由于产率较低(36%)，从而不利于产业化生产。
发明内容
本发明为了避免现有技术存在的不足之处，提供一种采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶双酶联合制备分子量可控的药用右旋糖酐的方法，该方法不仅绿色、环保、低成本、简便；而且使制备获得的右旋糖酐分子量可控。本发明解决技术问题采用如下方案双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐，该方法按如下步骤进行(I)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，、
采用pH 5.4 O. 02 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制终体积浓度12%的蔗糖溶液1000 mL，所述缓冲液中添加0.05g/L CaCl2 ;将配置好的蔗糖溶液置于25°C保温10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其终浓度为2 IU/mL，置于25°C恒温、120r/min反应4小时，再置于25°C条件下保温20小时；然后终止右旋糖酐蔗糖酶的催化反应，将反应液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解；所述右旋糖酐蔗糖酶的一个酶活IU是指，以pH5. 4的醋酸-醋酸钙缓冲液配制终体积浓度为10%的蔗糖溶液为底物；所述缓冲液中含醋酸钙0.05 8/1、冰醋酸0.02 mol/L ;25°C条件下，每毫升底物反应液中每小时催化蔗糖产生O. I mg果糖所需要的酶量；(2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐
向步骤I)经右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反应液中加入右旋糖酐酶使其终浓度为O. 23 U/mL，置于35°C条件下搅拌反应160min_180 min，然后终止酶促反应；所述右旋糖酐酶的一个酶活U是指，以pH 5. O的醋酸盐缓冲液配制的终体积浓度为3%的重均分子量为70 kDa的右旋糖酐溶液为底物，在35°C条件下，每分钟产生I μ mol还原糖所需要的右旋糖酐酶量；(3)去除杂质将上述步骤2)经右旋糖酐酶催化水解的反应液置于80°C保温3小时，随后采用多层纱布过滤杂质，重复过滤两次，随后采用中速定性滤纸过滤上清液；然后再将上述过滤后的上清液加热煮沸15 min，待上清液冷却后，再利用中速定性滤纸过滤去除杂质，清澈无色的滤液用于下一步乙醇分级醇沉；(4)乙醇分级醇沉及真空干燥采用4级划分，一级划分乙醇体积浓度为39%，在搅拌装置下，向步骤(3)所得滤液中缓慢加入体积浓度95%乙醇，定时测定滤液中乙醇体积浓度，当乙醇体积浓度达到39%时停止醇沉，将滤液置于40度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇取出大分子杂质；二级划分乙醇体积浓度为43%，向一级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达43%时，停止醇沉，将醇沉好的滤液置于34度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐70产品；三级划分乙醇浓度为47%，向二级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达47%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于40度保温12小时，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐40产品；四级划分乙醇浓度为57%，向三级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达57%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于常温，2小时后，再加入乙醇获得右旋糖酐20产品；将上述乙醇划分所得到的产品分别置于80°C真空干燥箱中干燥4小时，去除产品中残留的乙醇及水分，即得到相应的右旋糖酐产品。本发明优选使用申请号为200710134765. 4的专利公开文本中的重组右旋糖酐蔗糖酶，该酶具有高酶活性，平均酶活达到40IU/mL，能够高效的催化蔗糖转化为右旋糖酐，蔗糖的转化率高达95%以上；同时本发明优选使用申请号为201110117071.6的专利公开文本中的右旋糖酐酶，该酶催化水解高分子右旋糖酐具有较强的底物特异性，该酶在催化高分子右旋糖酐时，能够优先催化降解分子量较大的糖酐，从而实现中小分子右旋糖酐的富集，利于酶法定向制备分子量可控的药用右旋糖酐，同时获得较高的产品收率；也可以使用从土壤中筛选出的棘孢青霉菌株发酵而成的右旋糖酐酶，该菌株GenBank登录号为HQ647326。本发明采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶联合制备分子量可控的药用右旋糖酐，方法具有如下优点(I)本发明先用蔗糖酶作用于蔗糖合成高分子的右旋糖酐，转化率高达95%，之后再加入右旋糖酐酶降解160-180min，得到系列右旋糖酐产品，该方法不仅绿色、环保、低成本、简便；而且能够大幅度提闻广品收率，获得闻品质药用右旋糖野。(2)本发明能够实现药用右旋糖酐的分子量可控生产，通过控制反应条件，调节催化反应时间可以定向制备以右旋糖酐20为主的产品。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。
实施例I(I)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，包含以下A、B两步A :右旋糖酐蔗糖酶活力测定用pH5. 4的醋酸-醋酸钙缓冲液(含醋酸钙O. 05 g/L、冰醋酸O. 02 mol/L)蔗糖溶液的终浓度配制为10%，加入适量稀释酶液在25°C条件下静置反应lh。反应完成后取样500 μ I加入DNS试剂375 μ I (稀释10倍)，沸水浴中加热准确煮沸5min，然后取出将其冷却至室温，加入蒸馏水定容至5. 375ml。以未反应的对照液作为参照，用分光光度计在波长520nm处测量光密度值，根据果糖的标准曲线计算果糖量，最终计算出酶活力。一个酶活单位(IU)定义为在上述条件下，每毫升底物反应液中每小时催化蔗糖产生O. I mg果糖所需要的酶量。检测结果显示右旋糖酐蔗糖酶粗酶液活力达110IU/mL。B :酶法合成高分子右旋糖酐工艺条件采用pH 5. 4 O. 02 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(添加O. 05g/L CaCl2)配制12%的蔗糖溶液5000 mL，置于25°C保温10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其终浓度为2 IU/mL,加入右旋糖酐蔗糖酶总活力单位10000 IU，置于25°C恒温、120r/min反应4小时，再置于25°C条件下保温20小时。反应结束后，将反应液置于70°C保温20 min终止右旋糖酐蔗糖酶的催化反应。反应液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解。反应液取样检测，采用高效液相色谱检测样品的重均分子量达IOOOkDa以上，蔗糖转化率高达95%以上。(2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐，包含以下A、B两步A :右旋糖酐酶活力测定右旋糖酐酶的活力测定将4ml O. 02mol/L pH 5. O的醋酸盐缓冲液配制的3%右旋糖酐70 kDa溶液置于35°C保温lOmin，再加入适当稀释的酶液Iml保温Ih后，利用3，5- 二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以在上述条件下每分钟产生I μ mol还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。检测结果显示右旋糖酐酶粗酶液活力达500U/mL。B :右旋糖酐酶的催化降解向上述步骤I)经右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反应液中加入右旋糖酐酶使其终浓度为0.23 U/mL，加入右旋糖酐酶总活力单位为1150U，置于35°C条件下搅拌反应160min-180 min,反应结束后,将反应液置于100°C水浴保温10 min或通入水蒸气5min,使右旋糖酐酶变性失活，以终止酶促反应。(3)去除杂质将上述步骤2)经右旋糖酐酶催化降解的反应液置于80°C保温3小时，反应液保温3小时后，会有大量絮状变性蛋白析出，随后采用八层纱布过滤杂质(主要为加热变性的右旋糖酐蔗糖酶)，以上步骤重复两次，随后采用中速定性滤纸过滤上清液。然后再将上述反应液过滤后的上清液加热煮沸15 min，待上清液冷却后，再利用中速定性滤纸过滤杂质，清澈无色的滤液用于下一步乙醇分级醇沉，即杂蛋白的去除分为两步进行。(4)乙醇分级醇沉及真空干燥采用4级划分，一级划分乙醇体积浓度为39%，在搅拌装置下，向步骤(3)所得滤液 中缓慢加入体积浓度95%乙醇，定时测定滤液的温度和酒精度，并根据温度和酒精度值查表得滤液中乙醇体积浓度，当乙醇体积浓度达到39%时停止醇沉，将滤液置于40度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇取出大分子杂质；二级划分乙醇体积浓度为43%，向一级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达43%时，停止醇沉，将醇沉好的滤液置于34度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐70产品；三级划分乙醇浓度为47%，向二级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达47%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于40度保温12小时，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐40产品；四级划分乙醇浓度为57%，向三级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达57%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于常温，2小时后，再加入乙醇获得右旋糖野20广品；最后获得三种分子量不同的药用右旋糖酐，经高效液相色谱检测，三种产品的分子量分别为 69376,38251 和 21364 Da，保留时间分别为 13. 866 min, 14. 390 min 和 15. 037min，分子量分布系数分别为2. 08、I. 39、I. 21，三种产品的总产率为80. 32%，对应的产率为5. 77%、12. 55%、62%。当反应时间为160min_180min，可以定向制备右旋糖酐20为主要的产
品O本实施例中的右旋糖酐蔗糖酶为申请号为200710134765. 4的专利公开文本中的重组右旋糖酐蔗糖酶；右旋糖酐酶为申请号为201110117071.6的专利公开文本中的右旋
糖酐酶。
权利要求
1.双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐，其特征在于，该方法按如下步骤进行 (1)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐， 采用pH 5.4 0. 02 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制终体积浓度12%的蔗糖溶液1000mL，所述缓冲液中添加0.05g/L CaCl2;将配置好的蔗糖溶液置于25°C保温10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其终浓度为2 IU/mL,置于25°C恒温、120r/min反应4小时，再置于25°C条件下保温20小时；然后终止右旋糖酐蔗糖酶的催化反应，将反应液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解； 所述右旋糖酐蔗糖酶的一个酶活IU是指，以pH5. 4的醋酸-醋酸钙缓冲液配制终体积浓度为10%的蔗糖溶液为底物；所述缓冲液中含醋酸钙0.05 g/L、冰醋酸0.02 mol/L ；25°C条件下，每毫升底物反应液中每小时催化蔗糖产生0. I mg果糖所需要的酶量； (2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐 向步骤I)经右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反应液中加入右旋糖酐酶使其终浓度为0. 23U/mL，置于35°C条件下搅拌反应160min-180 min，然后终止酶促反应； 所述右旋糖酐酶的一个酶活U是指，以pH 5. 0的醋酸盐缓冲液配制的终体积浓度为3%的重均分子量为70 kDa的右旋糖酐溶液为底物，在35°C条件下，每分钟产生I y mol还原糖所需要的右旋糖酐酶量； (3)去除杂质 将上述步骤2)经右旋糖酐酶催化水解的反应液置于80°C保温3小时，随后采用多层纱布过滤杂质，重复过滤两次，随后采用中速定性滤纸过滤上清液；然后再将上述过滤后的上清液加热煮沸15 min,待上清液冷却后，再利用中速定性滤纸过滤去除杂质,清澈无色的滤液用于下一步乙醇分级醇沉； (4)乙醇分级醇沉及真空干燥 采用4级划分，一级划分乙醇体积浓度为39%，在搅拌装置下，向步骤(3)所得滤液中缓慢加入体积浓度95%乙醇，定时测定滤液中乙醇体积浓度，当乙醇体积浓度达到39%时停止醇沉，将滤液置于40度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇取出大分子杂质；二级划分乙醇体积浓度为43%，向一级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达43%时，停止醇沉，将醇沉好的滤液置于34度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐70产品；三级划分乙醇浓度为47%，向二级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达47%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于40度保温12小时，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐40产品；四级划分乙醇浓度为57%，向三级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达57%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于常温，2小时后，再加入乙醇获得右旋糖酐20产品； 将上述乙醇划分所得到的产品分别置于80°C真空干燥箱中干燥4小时，去除产品中残留的乙醇及水分，即得到相应的右旋糖酐产品。
全文摘要
本发明涉及一种双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐，其产品种类包括右旋糖酐70，右旋糖酐40以及右旋糖酐20；其制备步骤分为两大步，第一大步为高分子右旋糖酐的合成，首先是采用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖制备高分子右旋糖酐，该新方法使蔗糖转化为右旋糖酐的转化率达到95%以上；第二大步为高分子右旋糖的可控性降解，采用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐为药用右旋糖酐，实现右旋糖酐的分子量可控降解；反应结束后采用简单的过滤方法去除产品中的杂蛋白，采用乙醇分级醇沉获得不同分子量右旋糖酐。该方法不仅绿色、环保、低成本、简便；而且能够大幅度提高产品收率，获得高品质药用右旋糖酐。
文档编号C12P19/16GK102676615SQ20121018943
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月10日 优先权日2012年6月10日
发明者吴定涛, 张洪斌, 甘微苇, 胡雪芹 申请人:合肥工业大学