专利名称：纳米材料固载蛋白酶分子的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物纳米制剂与生物纳米酶催化领域，更具体地讲，本发明涉及纳米材料固载蛋白酶分子的方法及其应用。
背景技术：
对于蛋白质稳定性研究，早在二十世纪九十年代中期，人们就开始对蛋白质稳定性进行了系统的研究。目前，国内外对蛋白质稳定性的改进主要是对其进行修饰和在溶液中添加各种稳定剂，前者由于成本较高主要用于修饰药用蛋白，例如聚乙二醇(PEG)修饰各种细胞因子等蛋白类药物，而后者主要用于各种酶制剂。通过稳定剂来稳定蛋白质比对其进行化学修饰简单易行，成本也较低；并且蛋白质在经过修饰后，结构、活性和抗原性都发生了改变，但是，这种改变往往对蛋白质的实际利用是不利的，所以国内外研究尝试添加稳定剂的方法来实现蛋白酶的稳定性。蛋白酶的不稳定性是一直存在的一个问题，它严重制约着酶的实际应用。由于蛋白酶是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响变性，同时每一种蛋白酶都有自己特有的空间结构或三维结构，所以很难找到一种稳定性剂适合所有的蛋白质。这导致研制适合长期保存蛋白质制剂的配方并非易事。这主要是由于蛋白酶的物理和化学不稳定性决定的，与低分子量的化合物不同，要想保持蛋白酶的活性就必须保持其三维结构不变，另外，组成蛋白质骨架的氨基酸残基很容易发生化学降解，因此从分子水平来认识蛋白酶的不稳定性，解决众多蛋白酶制剂的稳定问题具有深远的现实意义。蛋白酶的不稳定性主要是因为其聚集作用，而蛋白酶的聚集主要是因为其构象的改变，蛋白质构象变化随着溶剂极性的减小而增大。由于蛋白质同时含有亲水性和疏水性基团，疏水部分容易发生延伸变性，所以蛋白质疏水位点越多，越易发生聚集。蛋白质聚集传统的观点认为是跟蛋白质的伸展模式有关，但是根据最新的研究，认为蛋白质聚集是与折叠和伸展之间的一种中间模式有关。全部折叠或全部打开的蛋白质不易聚集，因为它们疏水端的链要么完全包裹不与水接触要么随意的暴露，而中间态的蛋白质为了掩饰邻近的疏水基团导致了聚集的发生。另有文献报导，蛋白质聚集基本上都是由β折叠产生的，而α螺旋对聚集的影响不大，这可能是由于α螺旋的偶极距比β折叠的强。蛋白质的降解途径可分为两种类型，即化学不稳定性和物理不稳定性.化学不稳定性是由于氨基酸的残基的修饰/变化， 主要有几种反应氧化作用、还原作用、脱氨基反应、水解作用、精氨酸转化、β消除和消旋作用.物理不稳定性涉及蛋白质的二级、三级、四级结构的变化，不涉及蛋白质共价键的变异，包括变性、表面吸附、凝聚和沉淀。另外有关研究表面，蛋白质二级结构控制蛋白质的聚集、稳定性及毒性。游离酶对工业催化过程存在一定的障碍。酶催化过程已经在工业中获得了较多的应用，但仍然存在以下障碍，限制了酶在工业上更广泛的应用(1)酶在细胞外由于脱离了细胞内的环境，往往很难保持长期的稳定性，容易失去活性，尤其在油相或油-水界面，更容易失去活性；(2)反应速率较化学反应慢；(3)由于酶需要提取和纯化，同时重复利用率低、成本高，涉及辅酶体系时成本进一步增高；(4)现有的工业应用大多局限于单酶催化体系，多酶体系应用困难，限制了更多高附加值产品的开发。自然界中的酶至少有70万种，目前只有1万种的结构和化学性能已知，而实现工业应用的仅上百种。因此，在开发利用酶资源方面，可以说才刚刚起步，潜力巨大，迫切需要克服影响酶工业化应用的障碍，实现酶的高效利用。这不仅需要使单个酶在各个体系(水相、油相、油-水界面等)发挥其最高活性， 而且需要实现酶的重复利用、实现多酶的协调反应和辅酶再生。近年来，随着纳米科学和纳米技术的迅速发展，有望利用纳米技术实现上述关键技术的突破。传统酶固定化还存在着一定的缺陷性。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使之仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。按其性质分，主要有四种，即包埋法、交联法、吸附法及共价法，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。酶的催化效率及选择性在很大程度上取决于所使用酶的比表面积和几何形状；如不考虑其它因素，则粒径越小，比表面积越大， 催化剂的效率就越高。传统的固定化酶粒径一般为(O. l-10)mm。由于受到固定酶量少和较大传质阻力的影响，这类固定化酶的催化效率比较有限。而纳米级固定化的酶具有比表面积大、传质阻力小、固定酶量多和催化效率高等优点，这使得酶的纳米级固定化技术受到越来越广泛的关注。现代纳米技术有望实现酶的稳定固定化与稳定化。酶固定化技术可以在一定程度上解决酶稳定性和重复利用问题，利用在微米级载体上的酶固定化技术，可以提高酶的稳定性并实现酶的重复利用。但是，酶在同相界面上的固定化往往会造成酶一定程度的变构， 活性降低，同时固定在载体上的酶与底物之间的接触频率降低，造成催化效率进一步降低， 限制了酶固定化技术研究的更深入开展。将酶固定在纳米颗粒上后，发现纳米颗粒显示了显著的尺寸效应，纳米颗粒的粒径越小，所固定酶的催化效率越高。通过理论研究发现，这和纳米颗粒的布朗运动相关，颗粒越小，布朗运动速率提高，和底物的碰撞频率迅速提高， 从而提高了催化效率。纳米颗粒上的固定化酶和底物的碰撞频率介于游离酶和传统微米级载体固定酶之间，既通过酶固定化稳定了酶的结构，克服了游离酶不稳定的缺点，又克服了微米级载体存在的催化效率低的问题。同时，Dordick等发现纳米颗粒的尺寸对酶的固定结构有很大的影响，他们比较了粒径分别为4nm、20nm、IOOnm的二氧化硅纳米颗粒对固定化酶活性的影响，发现纳米颗粒直径越小，越不容易使酶变构。纳米颗粒的粒径越小，纳米颗粒表面的曲率越大，酶与纳米颗粒表面的接触面积就越小，就不容易使酶变构失活；而纳米颗粒的直径较大时，纳米颗粒的表面变得平坦，与酶的接触位点增多，容易使酶变构失活。因此，纳米技术和酶技术的结合突破了传统酶同定化的概念，为酶的稳定固定化研究找到了关键的解决方法。Kim等用纳米技术包埋酶，制备出了包埋单个酶的纳米颗粒(single enzyme nanoparticle)，纳米颗粒内的纳米限定空间(微环境)使得酶无法自由变构，从而高度保持了酶活性。
发明内容
本发明的目的在于提供纳米材料固载蛋白酶分子的方法，所述纳米材料指碳纳米管。
本发明的第二个目的是提供纳米材料固载蛋白酶分子的方法在酶的固定、稳定与利用中的应用。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案一种纳米材料固载蛋白酶分子的方法，其特征在于，所述纳米材料指碳纳米管，包括单壁碳纳米管和多壁碳纳米管，所述方法包括以下步骤
(1)碳纳米管分散，至形成均一的溶液；
(2)碳纳米管的酸化将体积比为1:2—1 5的浓硝酸与浓硫酸的混酸酸化步骤(1)获得的碳纳米管；
(3)碳纳米管的功能化利用NHS和EDC在碳纳米管管壁接上功能化的连接-NH2官能团，最后与酶的-NH2反应，将酶固定化在管壁。碳纳米管功能化时，PH值为7. 0—7. 5。所述蛋白酶分子，是指通过基因工程制取的超氧化物岐化酶(SOD)、乙酰辅酶 A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase, AACase 脂肪酶(lipase)、磷脂酸磷酸酶 (phosphatidic acid phosphatase, PAP)禾口二 1 "油酉先—胃#g|(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)、1，3_丙二醇氧化还原酶、人胆碱酯酶中的一种或几种。纳米材料固载蛋白酶分子的方法在酶的固定、稳定与利用中的应用，所述酶是指用于能源、环境与生化制药领域进行生物催化或转化的酶。本发明的优点在于本发明公开一种利用单壁或多壁碳纳米管负载、固定、转运和利用其所载的蛋白酶分子，并将其应用于特定催化反应与催化体系，起到稳定、转运和协助发挥生物药学功能的作用。根据不同碳纳米管、不同蛋白酶分子以及不同的目标用途，采用特定的技术将碳纳米管与蛋白酶分子相结合，为蛋白酶分子这类不太稳定、不易实际利用的生物大分子技术的高效发挥其应有生物学功能提供了可行的技术。本发明制作工艺程序简便、快捷，结合稳定牢固，且效率高。特别是用于能源、环境与生化制药等领域进行生物催化或转化的碳纳米管价格低廉，易于规模化利用，是具有实际应用前景的纳米酶催化手段。
图1为多壁碳纳米管与SOD酶的具体连接与固定方法。图2为单壁碳纳米管对SOD酶的固定流程图。图3为碳纳米管固定化酶质量测定表。图4为酶蛋白测定标准曲线。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例一多壁碳纳米管(MWNTs)的活化与SOD酶的固定化。将0. 5g商品多壁碳纳米管倒入15ml浓硝酸与45mL浓硫酸的混酸中，容器封口， 超声波分别振荡池；用大量水稀释，静置过夜，0. 22 μ m微孔过滤；过滤得到的多壁碳纳米管用去离子水反复洗涤至中性，100°C真空烘干称重。取干燥的50 mg酸处理的MWNTs，加入15ml的PH=7. 0磷酸盐缓冲液中，超声分散均勻；再向其中加入200 mg的碳二亚胺(EDC) 与N-羟基琥珀酰亚胺(MB) 250 mg，超声30 min ；取一定量酶液加入上述溶液中常温震荡24h ；然后用0. 22 μ m的聚碳酸酯膜过滤；得到的固体用磷酸缓冲液洗涤，然后在真空中干燥得到最终的固定化酶。先用混酸在碳纳米管管壁上生成羧基，然后在碳二胺(EDC)的辅助下，羧基与 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成酯键，然后与蛋白质的游离氨基端形成酰胺键，将酶固定上。 具体连接与固定方法如图1所示。SOD连接与固定前后酶活性测定方法，采用邻苯三酚发生自氧化测定50mM的 Tris-HCl (PH=8. 2)缓冲液:3ml，预热至250°C，加入IOul 150mM的邻苯三酚，充分摇勻，以缓冲液做空白对照，每隔半分钟测一次吸光度。同样条件，加入IOul待测SOD液，读取其吸光度。标准连苯三酚自氧化曲线的测定，50mmol / LTris-HCl pH8. 2缓冲液:3ml，预热至25°C，加入IOul 50mmol / L连苯三酚充分摇勻，以缓冲液作空白对照每隔半分钟(自连苯三酚加入起计时)测一次吸光度，使之自氧化速率达到每分钟A325为0.070。标准SOD活力测定。酶活力单位的定义在Iml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位。50mmol / L Tris_HCIpH8. 2 缓冲液 3ml，预热至 25°C，同时加入 5ommol / L 连苯三酚(自氧化速率已达到的量)和样品各10ul，充分摇勻，以缓冲液作空自对照。每隔半分钟(自联苯三酚和样品加入起计时)测一次A325值使抑制连苯三酚自氧化速率达50% 左右。结果显示，国产SWNTs与样品SOD的质量比在4 :1左右。实施例二 功能化多壁碳纳米管用于脂肪酶固定化。经一定比例(体积比1:21: 浓硝酸与浓硫酸的混酸处理后的多壁碳纳米管表面连接有羧基，再用氯化亚砜和N，N-二甲基甲酰胺进行酰基氯化作用得到含氯的酰基多壁碳纳米管，然后将含氯的酰基多壁碳纳米管在氯仿中与己二胺反应得到多氨基终端的多壁碳纳米管即CNT-NH。酸化的碳纳米管与十六烷基溴等在一定条件下反应得到CNT-NH。功能化碳纳米管在Tris-HCl缓冲液中超声后加入基因工程制备的脂肪酶液震荡离心。固定化酶量利用Brandford测定上清中蛋白含量。同时采用常规方法检测固定前后脂肪酶的活性变化，并采用FIlR光谱与拉曼光谱来表征多壁碳纳米管固定脂肪酶时 CNT - COOH展现出典型的条带。通过对比分析CNT-C00H、CNT-NH、CNT-R固定化效率，发现 CNT-COOH效率最高，装载量也最大。通过检测固定前后脂肪酶的活性变化，发现等量酶在采用功能化碳纳米管固定后，其活性没有明显的增加，但是起活性保持时间延长很多，最高达到5-7被倍。为该酶的多次重复利用和提高使用效率奠定了基础。实施例三单壁碳纳米管(SWNTs)对SOD酶的固定化。 将6mgSWNTs悬浮于6mlBMIM_BF4 ( 一种离子液体)得液体A ；然后在12mlDMF ( 二甲基甲酰胺)中加入60mgN-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸得液体B ；将A液体加入B液体在室温下混合震荡12h ；然后加入30ml甲醇，功能化SWNTs将沉淀下来；将沉淀用纯甲醇洗涤三次，每次50ml，去除多余的还原剂；在真空下干燥，得到功能化SWNTs ；取5mg功能化 SMNTs悬浮在5ml BMIM-BF4中然后加入SOD溶液(54mg酶溶于10ml20mM pH为7. 2的磷酸缓冲液)；将上述不均勻混合物在室温下震荡Mh ；然后用0. 1 um的聚碳酸酯膜过滤；最后得到的固体用磷酸缓冲液(25mlx2)洗涤，然后在真空中干燥得到最终的固定化酶。具体的单壁碳纳米管对SOD酶的固定流程图如图2所示。为了验证固定的酶量，对标准酶、样品酶以及固定化酶进行定蛋白，进行了 Bradford工作液的配制考马斯亮蓝G250 IOOmg溶于50ml 95%的乙醇，加入IOOml 85%的 H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤，棕色瓶避光保存。在不同条件，包括最适pH、最适温度、金属离子和存储稳定性等方面，对游离酶与固定化酶性质的研究进行了研究，发现在最适条件37°C、pH7.0、3h，存在i^eS04、MnCl2或者CuCl2时，i^e2+、Mn2+、Cu2+离子在体系中的终浓度为lxl0-3mol / L lxlO-4 mol / L。游离酶和固定化酶的相对酶活力差异不太显著，只是固定化后活性略有下降。据文献报道SOD 的活性中心基团与活性中心与固定化有影响。虽然酶的活性没有降低，在量的方面，固定化的量却比较少，其条件还有待进一步优化。其原因可能是由于操作过程中，SWNTs有损失。但是在存储稳定性方面，将固定化后的酶进行重复催化操作，经过多次操作后看酶活力变化情况。将固定化后的酶和游离的酶于冰箱内4°C，37°C及常温放置，每隔10天测一次酶活力，酶活变化都比游离的酶高，最高达到7倍。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种纳米材料固载蛋白酶分子的方法，其特征在于，所述纳米材料指碳纳米管，包括单壁碳纳米管和多壁碳纳米管，所述方法包括以下步骤(1)碳纳米管分散，至形成均一的溶液；(2)碳纳米管的酸化将体积比为1:2—1 5的浓硝酸与浓硫酸的混酸酸化步骤(1)获得的碳纳米管；(3)碳纳米管的功能化利用NHS和EDC在碳纳米管管壁接上功能化的连接-NH2官能团，最后与酶的-NH2反应，将酶固定化在管壁。
2.根据权利要求1所述的一种纳米材料固载蛋白酶分子的方法，其特征在于，碳纳米管功能化时，PH值为7. 0—7. 5。
3.根据权利要求1所述的一种纳米材料固载蛋白酶分子的方法，其特征在于，所述蛋白酶分子，是指通过基因工程制取的超氧化物岐化酶SOD、乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酶、磷脂酸磷酸酶和二酰基甘油酰基转移酶、1，3-丙二醇氧化还原酶或者人胆碱酯酶中的一种或几种。
4.权利要求1所述的纳米材料固载蛋白酶分子的方法在酶的固定、稳定与利用中的应用，所述酶是指用于能源、环境与生化制药领域进行生物催化或转化的酶。
全文摘要
本发明公开一种纳米材料固载蛋白酶分子的方法，所述纳米材料指碳纳米管，所述方法包括以下步骤(1)碳纳米管分散，至形成均一的溶液；(2)碳纳米管的酸化将体积比为12—15的浓硝酸与浓硫酸的混酸酸化步骤(1)获得的碳纳米管；(3)碳纳米管的功能化利用NHS和EDC在碳纳米管管壁接上功能化的连接-NH2官能团，最后与酶的-NH2反应，将酶固定化在管壁。本发明制作工艺程序简便、快捷，结合稳定牢固，且效率高。特别是用于能源、环境与生化制药等领域进行生物催化或转化的碳纳米管价格低廉，易于规模化利用，是具有实际应用前景的纳米酶催化手段。
文档编号C12N11/14GK102373192SQ20111002415
公开日2012年3月14日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者刘洋, 张倩, 马兴元, 高原 申请人:华东理工大学